牦牛轉移因子對藏綿羊外周血淋巴細胞轉化功能的影響

常建軍，文 英，李 莉

（青海大學農牧學院，西寧 810016）

0 引言

轉移因子(Transfer Factor,TF)因其具有安全、作用迅速、效果顯著、無藥物殘留、無抗原性、無毒副作用、無種屬差異性等優點，而成為學者們研究的一種理想的動物細胞免疫增強劑。李相安等[1]研究發現，雞脾TF可顯著提高雛雞免疫器官脾臟和腔上囊的相對重量。黃建文等[2]試驗表明，用雞傳染性喉支氣管炎滅活疫苗免疫雞的同時，肌肉注射TF，淋巴細胞轉化率升高，這表明蛋雞的細胞免疫機能增強。張廣英[3]報道豬TF能顯著增加受體豬的外周血T細胞比值，王建文[4]報道雞TF除對仔雞的法氏囊、脾臟等免疫器官增重作用明顯外，還具有促生長發育作用。馬志勇[5]等報道犬TF可使小鼠E玫瑰花環形成細胞顯著增加。

機體免疫系統中淋巴細胞增殖是機體對非己抗原刺激發生免疫應答過程中的重要階段，淋巴細胞的增殖結果表現為效應淋巴細胞的產生，并發揮其清除非己抗原的作用，以維持體內內環境的穩定，而效應淋巴細胞的數量，決定了機體免疫應答的強度，在評價機體免疫功能方面具有重要意義[6]?，F國內外對動物外周血淋巴細胞自身增殖功能的研究多見于鴨[7]、番鴨[8]、雛雞[9]、犬[10]、大鼠[11]、鱘魚[12]等動物。針對新型免疫增強劑的報道多見于多糖[13-15]、中藥[16]、植物提取物[17]等制劑，而相關動物TF的報道不多?？讘c波等[18]研究不同濃度犬、豬轉移因子對犬外周血淋巴細胞增殖的影響，發現同源或異源TF對犬淋巴細胞增殖均有良好的刺激效果；文英等[19]研究報道，用牦牛TF單獨或協同ConA刺激小鼠淋巴細胞后，均可提高各種細胞因子的分泌能力，但尚未見牦牛TF對藏綿羊外周血淋巴細胞轉化功能的研究報道。

本試驗主要目的是通過研究牦牛TF對藏綿羊外周血淋巴細胞體外增殖的影響，進而對其免疫調節作用機制進行研究，為增強藏綿羊細胞免疫功能提供更為準確的方法和手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8月齡健康藏綿羊12只，購于青海省大通縣某養殖場。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養基，購自宜興市賽爾生物化工廠；臺盼藍、塞唑藍(MTT)，購自北京中生瑞泰公司；二甲基亞砜(DMSO)、刀豆蛋白(ConA)、犢牛血清(FCS)，均購自北京中生瑞泰公司；淋巴細胞分離液，購自北京索萊寶科技有限公司；牦牛TF凍干粉，由實驗室自制保存。

1.3 主要儀器設備

超凈工作臺(AC2-4S1)，購自北京五洲東方科技發展有限公司；水平離心機（LD4-2A型），購自北京醫用心機廠；CO2培養箱(Model TC2323)，購自CE公司；酶標分析儀(DNM-9602)，購自北京普朗新技術有限公司。

1.4 主要培養基和溶液

不完全RPM I-1640培養液；無Ca2+、Mg2+PBS液、ConA應用液、MTT應用液、轉移因子應用液、臺盼藍等。

1.5 藏綿羊淋巴細胞懸液的制備

無菌采取抗凝血，與等量無Ca2+、Mg2+PBS混勻后，疊加于等體積淋巴細胞分離液上，2000 rpm離心20 min，輕輕吸取淋巴細胞層（即中間的云霧層），用無Ca2+、Mg2+PBS洗滌3次，每次1000 rpm離心10 min，用臺盼藍染色計數，保證活細胞數在95%以上。用RPMI-1640培養液將淋巴細胞分別調至為1.35×106個/mL(C1)、2.70×106個/mL(C2)、5.40×106個/mL(C3)3個濃度的細胞懸液。

1.6 藏綿羊淋巴細胞體外轉化增殖最優條件確定

設計FCS含量、淋巴細胞濃度、ConA濃度3個因素。FCS設3個水平，分別為5%、8%和10%；淋巴細胞懸液設3個濃度（見淋巴細胞懸液的制備）；ConA設3個濃度，分別為 1 μg/mL(A1)、2 μg/mL(A2)、2.5 μg/mL(A3)，在96孔細胞培養板上進行淋巴細胞轉化增殖試驗。

試驗設3個組，1個試驗組，淋巴細胞+ConA；1個對照組，淋巴細胞；1個空白組，完全RPMI-1640 200 μL，每個樣品設3個重復孔。淋巴細胞加入量為100 μL，ConA 和 TF 加入量為 50 μL，每孔總量為200 μL，不足的用完全RPMI-1640補足。試驗結果用MTT法測定[11-13]。測出OD值后，計算出刺激指數(SI,stimulate index)，選出各因素最佳值。SI的計算見公式(1)。

1.7 牦牛TF對藏綿羊淋巴細胞轉化增殖的影響

1.7.1 體外培養淋巴細胞中加入牦牛TF在最優條件下設3個TF濃度，分別為0.5 mg/mL(T1)、1.5 mg/mL(T2)、2.5 mg/mL(T3)，尋求牦牛TF的最佳刺激量。試驗共設4個組，淋巴細胞+ConA+TF組、淋巴細+TF組；淋巴細胞+ConA組、淋巴細胞組，每個樣品設3個重復孔。方法同2.2。

1.7.2 牦牛TF體內注射 皮下注射牦牛TF，分1 mL、2 mL、3 mL 3個劑量組，對照組注射生理鹽水，3只/組，連續注射3天，并在注射后第3、5、7天采血并分離淋巴細胞進轉化增殖試驗，方法同體外試驗。注射所用TF濃度為體外試驗確定的最佳刺激濃度。

1.8 統計結果

用SPSS統計軟件分析實驗數據，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 藏綿羊淋巴細胞體外轉化增殖最佳濃度確定

試驗用含5%、8%及10%FCS的完全RPMI-1640，在相同濃度FCS的條件下，確定最佳淋巴細胞及ConA濃度。按FCS濃度統計SI值，結果見表1～3。結果表明，當FCS濃度為8%，淋巴細胞濃度為5.40×106個/mL，ConA濃度為1 μg/mL時促進藏綿羊淋巴細胞增殖的效果顯著優于其他2個濃度組(P＜0.05)。

表1 5%FCS對羊淋巴細胞增殖影響的測定

表2 8%FCS對羊淋巴細胞增殖影響的測定

表3 10%FCS對羊淋巴細胞增殖影響的測定

2.2 牦牛TF對藏綿羊淋巴細胞轉化增殖的影響

2.2.1 體外培養細胞中加入牦牛TF結果顯示，在0.5～2.5 mg/mL濃度范圍內，TF單獨或協同絲裂原均可刺激藏綿羊外周血淋巴細胞的增殖，且濃度為1.5 mg/mL時，對淋巴細胞的轉化增殖的效果明顯，差異顯著(P＜0.05)。結果見表4。

表4 不同濃度TF協同絲裂原對羊淋巴細胞增殖的影響

2.2.2 牦牛TF體內注射 結果顯示，各劑量組在注射TF第3天時，淋巴細胞再次受到TF單獨或協同ConA刺激時，其增殖效果與細胞組單獨增殖效果比較，差異不顯著(P＞0.05)，至第5～7天時，淋巴細胞再次受到TF單獨或協同ConA刺激時，淋巴細胞增殖效果明顯高于細胞組，差異顯著(P＜0.05)。注射2 mL劑量組其轉化增殖效果優于1 mL劑量組和3 mL劑量組，差異顯著(P＜0.05)。測定結果見表5～7。

表5 注射1 mL TF對羊淋巴細胞增殖的影響

表6 注射2 mL TF對羊淋巴細胞增殖的影響

表7 注射3 mL TF對羊淋巴細胞增殖的影響

3 討論

3.1 MTT法確定羊外周血淋巴細胞增殖條件

淋巴細胞增殖反映的是機體免疫應答的過程，增殖效果越好，說明機體的免疫狀態越好。一般淋巴細胞的增殖能力就是通過測定淋巴細胞的轉化增殖指數來說明。淋巴細胞轉化試驗方法有形態學檢查法、同位素標記物摻入轉化法(3H-TdR摻入轉化法)、MTT法等。MTT法具有快速、簡便、準確、靈敏等優點，可用于分析體外培養的淋巴細胞受特異性刺激時增殖能力的變化情況從而反映出機體細胞免疫功能的狀態[20-22]。故本試驗選擇MTT法。但由于MTT法的高靈敏度，也決定其在試驗中會受到很多因素的影響，所以要嚴格把握試驗條件[23]。淋巴細胞存活率和濃度是影響MTT法的主要因素[24]，當培養條件如血清、培養液、MTT等不能滿足增殖需要時細胞間將會相互拮抗；相反，過少或存活力較低的細胞會因死亡和沉積，影響其他活細胞的增殖和干擾比色，因此試驗應嚴格控制細胞密度，以保證細胞的存活率在95%以上。其次,要控制血清濃度，血清濃度不足時細胞會產生競爭性代謝抑制；而過量的血清與細胞碎片混合會出現渾濁。再者，在評價淋巴細胞免疫功能時，培養時間不宜過長，因細胞存活力、增殖力等與其也有直接關系。因此對這些因素進行摸索并找出其在淋巴細胞轉化增殖試驗中的最佳值，可保證試驗結果充分反映機體的細胞免疫狀態。

本次試驗摸索出最佳條件為，FCS濃度為8%，淋巴細胞濃度為5×106個/mL，ConA濃度為1μg/mL，此時所得到的SI值結果最理想，促進藏綿羊淋巴細胞增殖的效果優于其他2個濃度組，差異顯著(P＜0.05)。試驗確定的ConA濃度(1 μg/mL)與孔慶波[25]所用ConA濃度(2.5 μg/mL)及金擴世等[26]所用ConA濃度(20 μg/mL)有一定差別，是否與使用的產品和實驗動物不同有關，有待進一步研究。

3.2 牦牛TF對藏綿羊淋巴細胞轉化增殖的影響

細胞免疫主要通過T淋巴細胞介導，而TF具有活化T淋巴細胞，刺激并促進干擾素和白細胞介素產生，進而活化巨噬細胞的效應[27-28]。吳德華等[29]在犬口服或注射TF后用酯酶染色法檢測了犬外周血T細胞比值變化，檢測結果表明犬T細胞數量明顯升高。何孟蓮等[30]研究了不同動物來源TF對肉仔雞T細胞免疫功能及免疫器官指數的影響，結果發現不同來源的TF對T細胞轉化增殖作用顯著，促免疫器官生長發育作用也顯著，TF通過促T細胞轉化增殖作用和促免疫器官生長發育，可顯著提高肉仔雞免疫功能。文英等[19]研究報道，用牦牛TF刺激小鼠淋巴細胞后，IL-12、IL-1、IL-4、IFN-γ等細胞因子的分泌能力均有提高。除了增強細胞免疫外，羅俊崇等[31]也報道羊胎盤轉移因子能夠在一定時間內提高仔豬血清中IgM和IgG的含量，對仔豬的體液免疫能力有增強作用。全炳昭等[32]發現犬TF能夠犬淋巴細胞轉化率，且TF促進犬淋巴細胞轉化效應的大小與TF濃度密切相關。濃度高或低時，均可影響淋巴細胞的轉化。

試驗結果顯示，牦牛TF在0.5～2.5 mg/mL濃度范圍內，牦牛TF單獨或協同絲裂原均可刺激藏綿羊外周血淋巴細胞的增殖，且濃度為1.5 mg/mL時，對淋巴細胞的轉化增殖的效果明顯。各劑量組體內注射牦牛TF后，在7天內淋巴細胞再次受到TF單獨或協同ConA刺激時其增殖能力呈現上升趨勢，與孔慶波[33]“注射豬TF的犬淋巴細胞增值能力早期（4～6天）呈下降趨勢，6天后受到抑制”的結果不同，這或與TF種類不同有關。牦牛TF對藏綿羊而言屬于非特異性免疫增強劑，能夠促進藏綿羊非特異性淋巴細胞的增殖，從而改善藏綿羊的非特異性細胞免疫功能。藏綿羊注射異種TF后，在一定時間內，淋巴細胞增殖能力呈增強的特點，體現了免疫增強劑的本質，這為非特異性TF在藏綿羊疾病防治的臨床應用提供了理論依據。至于牦牛TF作用于藏綿羊外周血淋巴細胞時其增殖能力何時下降或受到抑制，有待進一步研究。不同劑量組間比較發現，注射2 mL劑量組其轉化增殖效果優于注射1 mL組和3 mL組，差異顯著(P＜0.05)。此結果可為臨床治療提供一定的理論依據。

4 結論

從試驗結果可知，當FCS濃度為8%、藏綿羊淋巴細胞濃度為5×106個/mL、ConA濃度為1 μg/mL時，所得SI值結果最理想，即藏綿羊淋巴細胞的增殖效果最佳，因此該條件可做為MTT法檢測藏綿羊外周血淋巴細胞轉化的最佳條件，可用于實踐中對藏綿羊免疫功能的檢查。

在0.5～2.5 mg/mL濃度范圍內，牦牛TF單獨或協同絲裂原均可刺激藏綿羊外周血淋巴細胞的增殖，且濃度為1.5 mg/mL時，對淋巴細胞的轉化增殖的效果明顯，差異顯著(P＜0.05)。各劑量組體內注射牦牛TF后，在7天內淋巴細胞再次受到TF單獨或協同ConA刺激時其增殖能力呈現上升趨勢，不同劑量組間比較發現，注射2 mL劑量組其轉化增殖效果優于注射1 mL組和3 mL組，差異顯著(P＜0.05)。說明牦牛TF能較好的增強機體免疫功能。