LINC00963靶向miR-525-5p調控LPS誘導的牙周膜細胞損傷的機制研究

喻茂文 柳建磊 湯洪波 陳建軍 莫邦竹

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)通過調節微小RNA(MicroRNA，miRNA)在牙周炎的發展中發揮調節作用[2-3]。LINC00963是一種在癌癥病理進展中具有重要作用的lncRNA[4]，被認為是細胞凋亡的調節因子。研究表明，LINC00963在急性腎損傷小鼠和細胞模型中高表達，敲低其表達可靶向miR-128-3p減輕急性腎損傷[5]。LINC00963在慢性腎衰竭小鼠模型中高表達，干擾其表達可抑制慢性腎衰竭造成的氧化應激[6]。MiR-525-5p在心肌梗死中下調表達[7]。miR-525-5p在腦缺血再灌注損傷中下調表達，敲低其表達可誘導細胞凋亡，增加腦梗死面積[8]?？梢奓INC00963和miR-525-5p可以影響細胞損傷過程，但二者在酯多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的牙周膜細胞損傷中的表達及其對LPS誘導的牙周膜細胞損傷的影響尚未可知。本研究構建了LPS刺激的人牙周膜細胞作為細胞模型，考察LINC00963和miR-525-5p對此模型中細胞凋亡和炎癥因子表達的影響，并進行LINC00963的機制探索。

1 材料與方法

1.1 材料

LipofectamineTM2000、增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑底物(Invitrogen,美國); PrimeScript RT試劑盒、SYBR Master Mix試劑盒(Takara,日本); miScript Reverse Transcription試劑盒、miScript SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen，德國)； si-NC、si-LINC00963、miR-NC、miR-525-5p、anti-miR-NC、anti-miR-525-5p(上海GenePharma)；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(南京KeyGen)； TNF-α和IL-1βELISA試劑盒(Abcam,美國)。

1.2 細胞分離培養

收集在本院進行正畸的健康志愿者離體牙，研究獲得參與者的知情同意，經醫院倫理批準通過。將牙周膜組織從牙根表面輕輕刮下，根據先前的報道[9]分離人牙周膜細胞(human periodontal ligament cells， hPDLCs)，將其接種到含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基中生長，并保持在5% CO2和37 ℃的環境。

1.3 細胞處理與分組

取第2～3 代牙周膜細胞分為Con組(對照)、LPS組(10 μg/mL LPS誘導牙周膜細胞24 h)、LPS+si-NC組(LPS+轉染si-NC)、LPS+si-LINC00963組(LPS+轉染si-LINC00963)、LPS+miR-NC組(LPS+轉染miR-NC)、LPS+miR-525-5p組(LPS+轉染miR-525-5p)、LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC組(LPS+轉染si-LINC00963+anti-miR-NC)、LPS+si-LINC00963+anti-miR-525-5p組(LPS+轉染si-LINC00963+anti-miR-525-5p)。根據制造商Invitrogen的操作規程，當牙周膜細胞達到70%～80%融合時，使用LipofectamineTM2000進行轉染。轉染24 h后，進行10 μg/mL LPS誘導，持續24 h。

1.4 RT-qPCR檢測LINC00963和miR-525-5p表達

將Con組、LPS組和各實驗組中的牙周膜細胞加入Trizol試劑提取總RNA。檢測LINC00963表達時，根據說明，使用PrimeScript RT試劑盒用10 μL逆轉錄系統將總RNA逆轉錄為cDNA。qPCR實驗是使用SYBR Master Mix試劑盒在ABI 7900HT定量PCR系統進行的。檢測miR-525-5p表達時，根據說明，使用miScript Reverse Transcription試劑盒制備cDNA，miScript SYBR Green PCR試劑盒進行qPCR。將GAPDH和U6用作內參，采用2-ΔΔCt法計算LINC00963和miR-525-5p水平。引物如下(5′-3′)：LINC00963 F：GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT，R：ACGTGGATGACAGCGTGTGA。GAPDH F：AGTCCACTGGCGTCTTCA，R：GAG-TCCTTCCACGATACCAA。miR-525-5p F：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG，R：GCGAGCACAGAATTAATAC-GACTCAC。U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA，R：AACG-CTTCACGAATTTGCGT。

1.5 ELISA檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β水平

使用ELISA試劑盒測定Con組、LPS組和各實驗組中的牙周膜細胞上清液中TNF-α和IL-1β水平。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒于流式細胞儀分析不同組的牙周膜細胞凋亡率(%)。

1.7 Western blot檢測B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)表達

將Con組、LPS組和各實驗組中牙周膜細胞于RIPA裂解緩沖液在冰上反應30 min。使用Bio-Rad電泳儀，SDS-PAGE(10%凝膠)分析含有20 μg總蛋白的樣品，并轉膜。將膜與抗Bcl-2、Bax和GAPDH(對照)抗體(均為1∶1 000)在4 ℃過夜，并與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶二抗在室溫下孵育1 h。隨后將膜與ECL溶液孵育進行成像分析。

1.8 雙熒光素酶報告實驗

構建含有miR-525-5p結合位點的LINC00963野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶報告質粒，命名為WT-LINC00963和MUT-LINC00963。隨后，將兩個質粒分別與miR-NC或miR-525-5p共轉染到牙周膜細胞中，轉染48 h后收集細胞，利用雙熒光素酶報告檢測系統檢測相關熒光素酶活性。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 LINC00963和miR-525-5p在LPS誘導的牙周膜細胞損傷中的表達

LPS誘導牙周膜細胞后，LPS組LINC00963表達水平約為Con組的2.74 倍，miR-525-5p表達水平約為Con組的0.35倍(P<0.05)(圖 1)。

圖 1 LINC00963和miR-525-5p在LPS誘導的牙周膜細胞損傷中的表達

2.2 干擾LINC00963表達對LPS誘導的牙周膜細胞炎癥因子表達的影響

LPS組牙周膜細胞中LINC00963表達水平、TNF-α和IL-1β水平分別比Con組增加了約1.88、1.80和2.33 倍(P<0.05)，干擾LINC00963表達后，LPS+si-LINC00963組牙周膜細胞中LINC00963表達水平、TNF-α和IL-1β水平比LPS+si-NC組減少了約0.47、 0.57和0.48 倍(P<0.05)(圖 2)。

圖 2 干擾LINC00963表達對LPS誘導的牙周膜細胞炎癥因子表達的影響

2.3 干擾LINC00963表達對LPS誘導的牙周膜細胞凋亡的影響

LPS組牙周膜細胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白水平分別是Con組的約3.68、0.39和4.83 倍(P<0.05)，干擾LINC00963表達后，LPS+si-LINC00963組牙周膜細胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白水平是LPS+si-NC 組的約0.41、2.5和0.34 倍(P<0.05)(圖 3)。

圖 3 干擾LINC00963表達對LPS誘導的牙周膜細胞凋亡的影響

2.4 LINC00963靶向調控miR-525-5p的表達

StarBase軟件對LINC00963與miR-525-5p靶向結合位點預測結果見圖 4A。 miR-NC組WT-LINC00963和MUT-LINC00963的熒光素酶活性分別為1.02±0.05、1.00±0.06，miR-525-5p組WT-LINC00963和MUT-LINC00963的熒光素酶活性分別為0.62±0.04、1.03±0.07，WT-LINC00963的熒光素酶活性在miR-NC組和miR-525-5p組之間差異有統計學意義(P<0.05)，MUT-LINC00963的熒光素酶活性在miR-NC組和miR-525-5p組之間差異無統計學意義(P>0.05, 圖 4B)。miR-525-5p表達水平在pcDNA-LINC00963組(0.33±0.03)顯著低于pcDNA組(1.00±0.05)(P<0.05)， si-LINC00963組(2.71±0.21)卻顯著高于si-NC組(0.98±0.07)(P<0.05)(圖 4C)。

圖 4 LINC00963靶向調控miR-525-5p的表達

2.5 miR-525-5p過表達對LPS誘導牙周膜細胞損傷影響

miR-525-5p過表達后，LPS+miR-525-5p組牙周膜細胞中miR-525-5p表達水平是LPS+miR-NC組的約3.01 倍，TNF-α、IL-1β水平、凋亡率和Bax蛋白水平分別比LPS+miR-NC組減少了約0.25、0.30、0.53、 0.59 倍，Bcl-2蛋白水平比LPS+miR-NC組增加了約1.18 倍(P<0.05)(圖 5)。

圖 5 miR-525-5p過表達對LPS誘導的牙周膜細胞損傷的影響

2.6 下調miR-525-5p表達逆轉了干擾LINC00963表達對LPS誘導的牙周膜細胞損傷的作用

同時下調miR-525-5p和干擾LINC00963表達后，LPS+si-LINC00963+anti-miR-525-5p組牙周膜細胞中miR-525-5p表達水平低于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC組，TNF-α、IL-1β水平、凋亡率和Bax蛋白水平高于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC組，Bcl-2蛋白水平低于LPS+si-LINC00963+anti-miR-NC組(P<0.05)(圖 6)。

圖 6 下調miR-525-5p表達逆轉了干擾LINC00963表達對LPS誘導的牙周膜細胞損傷的作用

3 討 論

LPS也稱為內毒素，是炎癥反應的有效激活劑，導致炎癥因子如IL-1β， IL-6， IL-8和TNF-α等炎癥因子的過度產生[10-11]。本研究同樣利用LPS誘導牙周膜細胞損傷，檢測到了LINC00963的上調。在乳腺癌[12]、骨肉瘤[13]、胃癌[14]等癌癥中， LINC00963通過調節腫瘤細胞的生長、凋亡、轉移、分化等過程促進癌癥的惡性進展。此外，根據Xie等[5]的研究結果，在缺氧誘導的HK-2細胞模型和缺血再灌注誘導的急性腎損傷大鼠模型中，LINC00963的表達均增加。本研究發現干擾LINC00963表達可通過抑制促凋亡蛋白Bax表達、促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達來減少LPS誘導的牙周膜細胞凋亡。促炎因子TNF-α和IL-1β是牙周炎中炎性損傷的重要調節劑[15]。本研究表明，干擾LINC00963表達抑制了炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達。通過檢測這些指標，本研究發現，干擾LINC00963表達可降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達和細胞凋亡，從而在牙周炎中起保護作用，這與Chen等[6]報道的si-LINC00963減少慢性腎功能衰竭大鼠模型中TNF-α、IL-6及細胞凋亡率、Bax和增加Bcl-2的結果相類似。

大多數lncRNA主要靶向miRNA以發揮其功能[16]。本研究中，miR-525-5p是牙周膜細胞中LINC00963的直接靶標。miR-525-5p作為一種腫瘤抑制因子，被確定在膠質瘤[17]、宮頸癌[18]中表達下調。最近的研究表明， miR-525-5p減輕了Ang-II處理的心肌細胞的肥大反應[19]。但miR-525-5p在牙周炎中的功能仍然未知。本實驗中，牙周膜細胞中的miR-525-5p被LPS下調，miR-525-5p過表達通過抑制細胞凋亡和炎癥因子TNF-α、 IL-1β表達，在LPS誘導的牙周膜細胞中顯示出有益作用。此外，下調miR-525-5p后，干擾LINC00963表達對LPS誘導的牙周膜細胞損傷的保護作用被逆轉，這表明下調miR-525-5p可以反向增加被si-LINC00963減少的LPS損傷牙周膜細胞的凋亡和炎癥因子表達，也表明LINC00963通過靶向LINC00963實現對LPS誘導的牙周膜細胞損傷的調節作用。

總之，本研究首次發現，在LPS誘導的牙周膜細胞中，LINC00963表達增加，干擾LINC00963表達抑制LPS誘導的牙周膜細胞凋亡和炎癥因子表達，可能與靶向miR-525-5p有關。本研究結果表明，LINC00963和miR-525-5p可能成為治療牙周炎的新靶標。