原生質體融合制備三效工程菌HL及其溶藻機理

黃金杰，毛林強，張文藝

（常州大學環境與安全工程學院，江蘇常州 213164）

由于人類活動范圍的不斷擴大與工農業的快速發展，導致大量含有氮、磷等營養元素的污水排入水體，造成水體富營養化程度加深，這會誘導藍藻的暴發頻率加快與持續周期變長。近年來，如何有效地治理藍藻水華問題成為研究熱點。相比于傳統物理、化學法治理藍藻，溶藻細菌因其成本低、安全環保等優點更受國內外學者的關注，但在菌株溶藻過程中往往隨著藻細胞的破裂，藻細胞內氮、磷等營養元素會二次釋放，使原本的環境水體富營養化程度加重，繼而會再度成為藻類的“溫床”。通過溶藻菌單一的溶藻作用去處理藍藻問題難以治本，因此尋找一種兼備溶藻、脫氮、除磷菌株成為解決問題的關鍵。

目前，在微生物領域原生質體融合已有較為成熟的技術。利用原生質體融合將親本優勢基因發生重組，使獲得兼備雙親優良性狀的融合菌株獲得成為可能。這不僅克服了傳統育種方法中的單一特性障礙，還具有傳遞親本優勢遺傳物質完整性的優點。趙曉燕等通過蘇云金芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌原生質體融合使融合菌株具備雙親的防蟲及防病雙優勢；張安妮等等通過原生質體融合使融合菌株具備雙親的溶藻及降解藻毒素功效。因此利用原生質體融合菌株，既達到溶藻控藻的目的，又能改善水體富營養化，是一種可能實現的想法。

本文通過溶藻菌R1、脫氮除磷菌B8原生質體融合出菌群，經一系列條件比較，挑選出其中1株高效溶藻、脫氮除磷的三效工程菌，對比了其與親本的溶藻、脫氮、除磷7天的效率。通過考察菌株降解銅綠微囊藻過程中葉綠素a（Chlorophyll-a）濃度與菌株生長速率兩者之間的關聯關系，建立了該菌株降解銅綠微囊藻的Haldane 模型。利用掃描電鏡觀察菌株溶藻過程與三維熒光、紅外紅外光譜分析溶藻產物初步分析菌株溶藻機理，為微生物措施治理藍藻問題提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

（1）菌種 菌株HL 篩選自R1 與B8 原生質體融合的菌群，于4℃冰箱保存。

（2）藻種 銅綠微囊藻購自中國科學院武漢水生生物研究所，藻種編號為FACHB-905。設定培養條件為光照周期比12h∶12h、光照強度3200 Lux、溫度25℃。

1.1.2 主要培養基與試劑

（1）培養基 BG-11培養基、牛肉膏蛋白胨培養基：配方詳見文獻[7]，以下簡稱液培、固培。高滲液體培養基：蛋白胨10g，酵母浸出汁5g，牛肉膏5g，蔗糖170g，加入1000mL 超純水，調節pH為7.2（固體培養基另加瓊脂粉20g/L）。以上培養基均須經高溫滅菌（121℃、20min），并冷卻至室溫后使用。

（2）主要試劑 原生質體穩定液（SMM）：依次稱取蔗糖71.5g、氯化鎂4.273g、順丁烯二酸2.336g、加入蒸餾水500mL，調節pH至6.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 三效工程菌制備、純化與篩選

（1）原生質體融合 分別取10mL 的溶藻細菌R1 和脫氮聚磷菌B8 發酵液于離心機4500r/min 離心10min。棄上清液，收集菌體。用無菌針筒吸取10mL SMM 緩沖液洗滌菌體2 次后，重懸于10mL SMM緩沖液中；酶解、重懸、融合步驟如下。

①酶解 用5mg/L 的溶菌酶對對數生長期R1菌和生長遲滯期B8菌于30℃下酶解45min，將制備的原生質體于45℃熱滅活。

②重懸 經離心機3800r/min 離心10min 后，用無菌針筒吸取高滲生理鹽水洗滌原生質體2 次后，重懸于10mL高滲生理鹽水溶液中。

③融合 將處理后的兩個原生質體各取1mL于離心管中，經離心機3800r/min離心10min，棄上清液。加入0.2mL 新生磷酸鈣溶液、1.8mL 30%的PEG 4000。經30℃水浴保溫40min 后，3800r/min離心10min，棄上清液。用SMM 溶液定容至2mL，再以SMM 溶液梯度分別稀釋到10、10、10，吸取25μL 涂布于高滲固體培養基，各梯度做3 個平行，置于25℃恒溫培養箱培養48h。

（2）純化 用接種環挑取分離不同單菌落并培養2～3天，5次平板劃線得到純化菌株。

（3）篩選 將純化菌株發酵培養，以菌藻比1∶10（體積比）接種，溫度為25℃，光照強度為3200Lux，光暗比12h∶12h，光照培養7 天。每天測1 次葉綠素a、總氮（TN）、總磷（TP）含量并計算溶藻率、脫氮率、除磷率，設平行及空白對照3組，比較各組之間的溶藻、脫氮、除磷率。

1.2.2 菌株HL效能與zeta電位變化

將R1、B8、HL 菌液培培養12h，以菌藻比1∶10（體積比）接種于濃度為(1043.28±12.71)mg/m銅綠微囊藻，并在溫度為28℃、光照強度為3200Lux、光暗比12h∶12h 的條件下培養7 天。利用乙醇法提取葉綠素，以Chlorophyll-a 濃度表現溶藻效果，每天測1次TN、TP并計算脫氮除磷率，試驗重復3次，空白對照組為投加相同比例的滅菌液培。取每天的菌株處理組與對照組各5mL，用Zetasizer（Nano-ZS90，UK）測定其藻細胞表面的zeta電位。

1.2.3 菌株HL降解銅綠微囊藻建模

進行菌株HL 處理不同初始濃度銅綠微囊藻試驗來研究藻濃度對菌株生長的影響，并確定菌株降解各濃度銅綠微囊藻的降解曲線。以滅菌接種環挑取純化5次的菌株HL于液培中活化12h，以菌藻比例為1∶10接種，在28℃、125r/min的搖床中培養，用橡皮塞密封以防止外界因素對銅綠微囊藻污染。同等條件下設平行試驗和不接菌空白試驗。每天測1次Chlorophyll-a含量。

1.2.4 菌株HL溶藻機理初探

（1）菌株作用組分確定 設置以下5 種處理方式：①培養處于對數增長期菌液（以下皆簡稱為發酵液）；②將步驟①中發酵液經12000r/min處理20min 后的上清液過0.22μm 濾膜，即為除菌發酵液；③將菌液經高溫高壓（設定121℃、1.0×10Pa）滅活處理20min，即為高溫無菌上清液；④收集步驟②濾膜中的菌體，用超純水洗滌3 遍后，等體積重懸制備菌懸液；⑤液培。將上述5 種菌液按照菌藻體積比1∶10 的比例投加到銅綠微囊藻中，連續觀察藻樣，并測定各處理組在7 天的溶藻率。

（2）溶藻過程電子顯微鏡 為觀察菌株HL 溶藻過程中藻細胞結構的變化，取對照組與試驗組3天、5 天、7 天藻液各10mL，5000r/min 離心5min后，收集藻體，并用2.5%戊二醛固定，經4℃冰箱過夜。棄固定液，用磷酸緩沖液漂洗藻體1次，隨后用梯度稀釋的乙醇（體積分數50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）依次對藻體進行脫水處理15min，最后冷凍干燥。在掃描電鏡（JSM-IT-100，日本電子株式會社）下觀察拍照。

（3）溶藻產物的紅外光譜 為探究菌株HL 溶藻原理，離心收集對照組和投放菌株HL 的銅綠微囊藻液，對藻體用超純水洗滌3 次后進行冷凍干燥，取溴化鉀（Kbr）固定藻樣，傅里葉紅外光譜分析儀（FTIR，IS50，美國賽默飛世爾科學公司）上光譜掃描。

（4）溶藻產物三維熒光光譜測定 以不添加菌株的銅綠微囊藻液為對照組，輔以菌株HL 處理第7 天的銅綠微囊藻為實驗組，經0.45μm 濾膜過濾后，采用Cary Eclipse 熒光光度計（為220～400nm，增量5nm；為280～550nm，增量2nm；PMT 電壓800V，掃描速度1200nm/min））測定溶藻進程的三維熒光譜圖，確定菌株HL 溶藻過程中產生溶藻物質及溶藻產物。將三維熒光光譜分為5個區域，每個區域代表一個類型有機物，詳見表1。

表1 熒光區域劃分

2 結果與討論

2.1 菌株形態及其溶藻、脫氮除磷能力

顯微鏡觀察培養3 天的菌株形態，篩選出5 株性狀明顯的菌株，各菌株特征如表2 所示。5在7天內溶藻率、脫氮率、除磷率均高于其他菌株，因此選取5作為研究對象，并命名為HL。

表2 菌株形態特征

2.2 三效工程菌效能與zeta電位

三效工程菌與雙親的溶藻率對比如圖1(a)，由圖1(a)可知，投加B8 菌的7 天內最高溶藻率僅為7.99%±0.70%，推測是液培對銅綠微囊藻的溶藻效果，而B8菌幾乎沒有溶藻特性；投加R1菌7天的溶藻率總體趨勢呈波動上升，在7天時溶藻率顯著提升至71.87%±0.45%；投加HL菌的組較雙親每天的溶藻率均顯著提升（0.05），7 天的溶藻率達81.61%±1.94%，溶藻效果相較于R1 提升9.84%±1.49%。HL菌在經原生質體融合后，溶藻性能較雙親有著顯著提升，從第1天起溶藻率顯著大于雙親（0.05），加之本身生長速度極快，故能在相比于雙親更短時間內達到溶藻閾值。三效工程菌與雙親的脫氮率對比如圖1(b)，由圖1(b)可知，投加B8 菌第1 天的脫氮率為14.88%±0.86%，隨后呈上升趨勢，第7 天時達75.89%±1.50%，展現出較好的脫氮能力；投加R1 菌7 天的脫氮率總體呈緩慢上升趨勢，第7 天時達到21.14%±0.64%，說明R1有著一定的脫氮能力，推測R1 是僅為滿足自身生長吸收BG-11 培養基中NaNO等鹽類作為營養源。投加HL 菌的7 天脫氮率僅在42.14%±1.68%與58.64%±1.07%之間波動，說明HL菌較雙親具有更為穩定的脫氮能力。三效工程菌與雙親的除磷率對比如圖1(c)，由圖1(c)可知，前兩天時投加B8菌的除磷率呈現出負增長，第2 天時至-11.25%±2.31%，隨后逐漸上升，第7 天時達86.59%±1.26%，說明B8菌適應環境速度較慢，當其發揮除磷作用時，除磷率顯著上升（0.05）。投加R1菌的7 天的除磷率總體呈下降趨勢，第1 天達到45.36%±1.28%，到第7天時僅為5.50%±0.25%，推測R1 菌本身并不具備除磷特性，僅可能在試驗初期大量吸收BG-11 培養基中所添加的磷酸鹽作為營養源為滿足自身生長需要，故而在試驗初期有著較高的除磷率。投加HL 菌的7 天的除磷率相對穩定，最高為第1 天時的69.52%±0.43%，最低為第2 天時（53.30±0.84）%，第7 天時為（61.78±1.32）%，試驗說明HL 菌較雙親具有穩定除磷特性。

圖1 R1菌、B8菌、HL菌的溶藻、脫氮、除磷效率對比與zeta電位的變化

由于藻細胞壁上的羧酸基團或附著藻細胞表面的細胞外聚合物官能團的解離，在天然水體中藻類自帶負電荷，而藻細胞團聚和細胞表面的多種胞外聚合物都會影響藻細胞表面電荷。由圖1(d)可知，與對照組相比，試驗組的zeta電位隨試驗時間顯著增加（＜0.05），然后在試驗后期逐漸趨于平穩，在試驗第7天時，試驗組zeta電位為-19.87mV?？傮w而言，當zeta電位較低時，藻類系統更傾向于凝聚或聚集。具體而言，吸引力大于排斥力，因此分散受到限制并發生凝聚。添加三效工程菌HL 導致了藻細胞表面zeta 電位的降低，在7天時發生了藻類的降解與凝聚沉底的現象，這也與蘇俊峰等的研究結果類似。

2.3 菌株降解過程的建模

在生物降解過程中，銅綠微囊藻中初始Chlorophyll-a 濃度起著重要作用，類似于某些底物，如苯酚等會對生物質的降解活性產生抑制作用， 故而進行試驗從(486.69±13.89)mg/m至(3135.43±16.27)mg/m的7 個不同初始Chlorophyll-a濃度對菌株降解過程影響的試驗。如圖2所示，實際上Chlorophyll-a 濃度的降解與時間成線性關系，因此，對于所有初始濃度的Chlorophyll-a降解速率都是恒定的。盡管生物降解率不會隨時間變化，但會隨著Chlorophyll-a初始濃度的增加而增加，而在(1525.67±27.22)mg/m時達到最大值，當初始Chlorophyll-a 濃度增加并超過此值時都會降低Chlorophyll-a 的去除速率，這可以歸因于銅綠微囊藻的抑制作用。另一方面，在低Chlorophyll-a濃度下較低的生物降解速率是受底物濃度的影響，其中可用于微生物降解的Chlorophyll-a較少。

圖2 不同初始Chlorophyll-a濃度對菌株降解過程的影響

在任何生物降解過程中都涉及將生物質（菌株）的特定生長速率與底物（Chlorophyll-a）的消耗速率的相互關系。微生物的生長可以解釋為活細胞數量的增加或生物量的增加，微生物生長與Chlorophyll-a 濃度之間的關系可被認為是決定微生物處理各種濃度的銅綠微囊藻中降解效率的關鍵因素。在銅綠微囊藻微生物降解試驗中，以藻液中Chlorophyll-a 作為底物，因此推測Chlorophyll-a 濃度與微生物生長速率存在關聯性。而根據Chlorophyll-a 濃度范圍，可以使用非抑制性或抑制性動力學模型來估算這種非線性關系。Monod模型和Haldane 模型是兩種生物降解模型。Monod 模型認為銅綠微囊藻是非抑制性化合物，忽略其對菌株的抑制作用，對底物生物降解，一般采用Monod動力學模型描述微生物的比降解速率，但有的底物本身在被降解的同時會對微生物產生一定的毒性，當濃度達到一定值時會抑制底物的降解。故用Haldane 模型（圖3），因其考慮了銅綠微囊藻的抑制作用，見式(1)。

圖3 菌株生長速率的實驗數據與Haldane模型擬合

式中，為微生物比增長速率，d；為微生物最大比生長速率，d；為底物濃度，mg/m；為半飽和速率常數，mg/m；為微生物生長抑制常數，mg/m。

利用式(1)中關系，Haldane 模型可預測隨著銅綠微囊藻的濃度變化的菌株生物降解率（），其中菌株比生長速率（）是由菌體細胞干質量和時間半對數圖繪制最小二乘擬合而得。使用Origin非線性回歸將實驗數據擬合到Haldane 模型，該模型使用Levenberg-Marquardt算法查找在數據與模型方程之間具有最佳擬合的參數。將模型與實驗數據進行比較，Haldane 抑制模型具有很好的擬合度，其中最大比生長速率（）為(1.046±0.12)d，半飽和常數（）為(896.92±49.16)mg/m，抑制常數（）為(1568.95±123.14)mg/m。觀察到的比生長速率隨著底物濃度增加到一定濃度而線性增加，這與裴海燕等的研究結果類似，當銅綠微囊藻中Chlorophyll-a 濃度在0～1568.95mg/m時，菌株HL對藻類降解速度與藻類濃度呈線性關系。然而在該臨界濃度之后，在Haldane 模型中觀察到急劇下降，尤其當濃度高于1568.95mg/m時，對銅綠微囊藻的生物降解能力具有相當大的抑制作用。

2.4 溶藻效果的電鏡觀察

采用掃描電鏡對菌株作用于銅綠微囊藻細胞進行形態觀察，如圖4所示，其中圖4(a)為對照組藻細胞，直徑為2～3μm，藻細胞形態飽滿，結構完整，呈現出規則的球形且藻細胞表面完好。圖4(b)～(d)為溶藻階段3天、5天、7天的藻細胞形態。試驗中前期（3天、5天）藻細胞經過菌株HL的作用后，形態發生變化，藻細胞細胞壁被破壞，胞內物質外泄，細胞結構較圖4(a)而言變得松垮干癟，細胞質出現空化，藻細胞之間緊密地堆疊在一起，可能是藻細胞表面的黏質膠被破壞，使得細胞周圍黏性物質增加，說明菌株HL 能夠釋放某種或某些物質致使藻細胞破裂死亡。至試驗后期（7天）時，圖4(d)中藻細胞幾乎均破裂，這也印證三效工程菌HL 在7天時的高溶藻率。

圖4 菌株HL的溶藻效果電鏡圖

2.5 菌株的溶藻作用組分

不同菌液處理銅綠微囊藻可能會造成溶藻細菌HL的溶藻效果有所差異，試驗結果如圖5，由圖5可見，發酵液溶藻能力高于其他試驗樣本，7天溶藻率為80.83%%±0.42%；經0.22μm 針式濾除器除去菌體后的發酵液仍有溶藻效應，7 天溶藻率為76.17%±2.31%，說明HL菌并未因菌體的去除而失去溶藻效應，推測HL 菌主要溶藻方式為間接溶藻，而溶藻細菌發酵液溶藻率比無菌發酵液溶藻率高，可能是發酵液的菌體仍在繼續分泌某種活性物質；菌懸液在7天溶藻過程中沒有產生明顯溶藻效應，7 天溶藻率為6.78%±0.40%，推測菌體在遇到新環境時，能夠再次分泌溶藻活性產物，同時也驗證了發酵液溶藻率高于無菌發酵液溶藻率的原因；經高溫處理的菌體發酵液依舊具有溶藻能力，7天溶藻率為65.9%±0.36%，相較于發酵液的溶藻率有一定的下降，推測有多種溶藻物質，有溶藻物質具有耐高溫特性；液培本身具有一定的溶藻能力，7天溶藻率為13.75%±0.21%。

圖5 不同處理方式對銅綠微囊藻的效果

2.6 溶藻產物的三維熒光分析

三維熒光光譜可以對熒光化合物進行定性定量分析，菌株HL 溶藻產物的熒光特性如圖6 所示。試驗主要產生2個明顯的熒光基團，主要涉及的是含有類色氨酸的微生物溶解性降解產物、生物來源的類蛋白質物質與類腐殖質熒光峰。從圖6中可以看出，在對照組中，峰D 與峰E 清晰可見，而峰A、B、C強度低而不清楚。峰A屬于Ⅰ區，主要代表包括酪氨酸等芳香族蛋白。峰B屬于Ⅱ區，主要代表包括色氨酸等芳香族蛋白。峰C屬于Ⅲ區，主要代表包括富里酸類物質。峰D屬于Ⅳ區，主要代表包括微生物溶解性降解產物樣品（SMP）。峰E屬于Ⅴ區，主要代表包括腐殖酸有機物，該部分物質主要是由藻細胞死亡后所產生的，較低的響應值說明此時藻類活性好。暴露于菌株HL 7 天后，與對照組相比，峰D 的熒光強度減少，而A、B、C、E 的熒光強度增加。該結果表明，在菌株作用下，釋放出芳香族氨基酸等活性物質造成銅綠微囊藻藻細胞破裂，繼而導致腐殖酸物質的大量釋放。

圖6 溶藻進程中三維熒光圖

2.7 溶藻產物的傅里葉紅外光譜分析

應用FTIR對對照組和菌株HL發酵液處理后的產物進行分析，結果見圖7。由圖7 可見，對照組和處理組的紅外光譜主要吸收峰位置大致一致，峰形非常相似，但各吸收峰的相對強度有所差異，用菌株處理銅綠微囊藻的吸收峰強度比空白組弱。溶藻前后的樣品光譜圖均主要產生3個峰，由于吸收峰強度與化學鍵之間的極性呈正相關關系而出現不同強度的峰，峰的位置說明溶藻前后的銅綠微囊藻液中存在相同的官能團。從峰的歸屬看，A 處在3134.24cm吸收峰相對較弱，尖銳峰形，屬于—NH 鍵伸縮振動所在位置，推測是酰胺類化合物存在，可能為類腐殖酸等物質；B 處在1637.27cm為酰胺類Ⅰ帶，是C==O 鍵伸縮振動區，說明對照組與試驗組均含有酰胺類物質且銅綠微囊藻的細胞蛋白質被破壞；C 處在1400.58cm處有最強特征峰，強度大，峰尖銳，屬于COO鍵對稱伸縮，表明藻液中可能有芳香族氨基酸存在，可能是由于藻細胞結構遭到破壞，溢出的細胞質被吸收。在1083.72cm處的吸收峰是伯醇C—O伸縮振動區。此外，在2935cm附近還存在來自于蛋白質和脂類的—CH、—CH對稱、反對稱運動產生的峰。結合上述峰分析、SEM圖及三維熒光圖來看，對照組中藻細胞內含有酰胺類物質，通過菌株HL 間接溶藻的作用，藻液中酰胺類物質濃度發生變化，可能是菌株HL 釋放分泌芳香族氨基酸等活性物質破壞藻細胞壁、藻蛋白質，藻細胞破碎死亡，產生類腐殖酸類物質。

圖7 菌株HL溶藻產物紅外光譜圖

3 結論

（1）經原生質融合出的融合菌株HL 表現出高效溶藻和穩定脫氮除磷能力，在7天的溶藻率、脫氮、除磷率分別為(81.61±1.94)%、(58.64±1.07)%和(61.78±1.32)%。

（2） 菌株HL 降解銅綠微囊藻的過程符合Haldane 模型，其中最大比生長速率（） 為(1.046±0.12)d，半飽和常數（）為(896.92±49.16)mg/m，抑制常數（）為(1568.95±123.14)mg/m。當濃度大于(1568.95±123.14)mg/m時，銅綠微囊藻會對菌株HL降解Chlorophyll-a產生抑制作用。

（3）通過對菌株作用組分判定及掃描電鏡可以得出，菌株HL 的溶藻手段為間接溶藻，對銅綠微囊藻細胞壁進行破壞，導致藻細胞失活，藻細胞物質流失而死亡。由三維熒光與紅外光譜分析可以初步判斷：通過釋放芳香族氨基酸等活性物質破壞藻細胞，藻細胞死亡后釋放大量腐殖酸物質。