利多卡因通過LncRNA H19/miR-671-5p 分子軸調控胃癌細胞增殖、遷移及侵襲

謝玉海 朵海珍 王學軍 （青海紅十字醫院麻醉科，西寧 810000）

胃癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，其高度的侵襲性及轉移能力可提高患者病死率。目前臨床主要采用手術等方式進行治療，但大部分患者確診時已處于腫瘤晚期，若采用手術、化療等姑息治療，患者會出現胃癌轉移、耐藥性等現象，導致治療失敗，研究表明麻醉藥物可用于治療胃癌并可能改善患者臨床癥狀［1-2］。但麻醉藥物在胃癌治療中的作用機制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）可充當微小RNA（miRNA）的競爭性內源RNA 從而參與胃癌的發生及發展過程［3］。因而需要探究麻醉藥物是否通過調控LncRNA表達從而影響胃癌的發生及發展。利多卡因可抑制乳腺癌細胞遷移［4］。LncRNA H19 在卵巢癌細胞中表達上調，并可促進卵巢癌細胞的遷移及順鉑耐藥性的發生［5］。生物信息學分析顯示miR-671-5p可能是H19 的靶基因，研究表明miR-671-5p 在胃癌細胞中表達下調，并可通過靶向URGCP抑制胃癌細胞增殖并促進細胞凋亡［6］。因此，本研究主要探討利多卡因對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，探究其對H19/miR-671-5p 分子軸的靶向調控作用，旨在為進一步闡釋利多卡因治療胃癌的分子機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 利多卡因購自山東華魯制藥有限公司（國藥準字：H80110255）；胃癌細胞AGS 購自美國ATCC細胞庫；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；miR-671-5p mimics、miR-NC、si-H19、si-NC 購自上海吉瑪制藥技術有限公司；pcDNA3.1 購自上?？吕咨锟萍加邢薰?；Trizol試劑購自北京全式金生物技術有限公司；反轉錄與實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；MTT、DMSO 購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning 公司；Matrigel 基質膠購自美國 BD 公司；兔抗人Ki-67、PCNA 抗體購自美國CST 公司；兔抗人E-cadherin、N-cadherin 抗體購自美國 Santa Cruz 公司；HRP標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 AGS 細胞接種于96 孔板（3×104個/孔），分別使用不同濃度（10、50、100 μmol/L）的利多卡因處理 24 h［7］，分別記作利多卡因-L 組、利多卡因-M組、利多卡因-H組。同時將正常培養的細胞作為Con 組。參照Lipofectamine2000 說明書進行轉染，分別將 pcDNA、pcDNA-H19 轉染至 AGS 細胞，隨后使用含100 μmol/L 的利多卡因處理24 h，分別記作利多卡因-H+pcDNA 組、利多卡因-H+pcDNAH19組。

1.2.2 MTT 檢測細胞增殖 取對數生長期AGS 細胞（3×105個/ml）按照每孔100 μl的密度接種于96孔板后加入20 μl MTT 溶液，室溫孵育4 h 后棄上清，加入150 μl DMSO，室溫振蕩孵育10 min，酶標儀檢測波長490 nm處各孔吸光度值（OD）。

1.2.3 Transwell 實驗檢測細胞遷移與侵襲 AGS細胞（5×104個/ml）以200 μl/孔接種于Transwell 小室的上室，繼續培養24 h后加入多聚甲醛固定20 min，PBS 洗滌，0.1%結晶紫染液染色10 min，棉簽擦拭未遷移的細胞，顯微鏡下觀察遷移細胞數。預冷培養液稀釋Matrigel 基質膠后加入上室（40 μl/孔），將其放入培養箱內孵育5 h 后加入AGS 細胞，后續實驗步驟同細胞遷移實驗，觀察侵襲細胞數。

1.2.4 qRT-PCR 檢測細胞中 H19、miR-671-5p 的表達水平 收集各組處于對數生長期的AGS 細胞，Trizol 法提取細胞中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA 濃度。參照反轉錄試劑盒將總RNA 反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板進行qRT-PCR 反應，參照實時熒光定量PCR 試劑盒配置反應體系及設置反應程序，應用羅氏LightCycler480 熒光定量 PCR 儀檢測 H19、miR-671-5p 的相對表達量。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測H19 的靶基因starBase 預測顯示 H19 與 miR-671-5p 存在結合位點，構建野生型載體WT-H19、突變型載體MUT-H19后，分別與 miR-NC、miR-671-5p mimics 共轉染至AGS細胞，繼續培養24 h后檢測相對熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot 檢測 Ki-67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達 AGS 細胞加入 RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，SDS-PAGE 分離蛋白后轉移至PVDF膜，封閉，分別加入一抗稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育24 h 后使用TBST 洗滌，分別加入二抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育 1 h 后使用 TBST 洗滌，滴加ECL，暗室內曝光顯影，應用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0統計學軟件分析數據，計量資料以表示，數據進行正態分布檢驗及組間方差齊性檢驗，符合正態分布及方差齊性，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 利多卡因對胃癌細胞AGS 增殖的影響 與Con 組相比，利多卡因-L 組、利多卡因-M 組、利多卡因-H 組細胞活力顯著降低（P＜0.05），Ki-67、PCNA蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且利多卡因-L 組、利多卡因-M 組、利多卡因-H 組細胞活力、Ki-67、PCNA蛋白水平比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 利多卡因對胃癌細胞AGS增殖的影響（，n=9）Tab.1 Effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

表1 利多卡因對胃癌細胞AGS增殖的影響（，n=9）Tab.1 Effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

PCNA 0.98±0.15 0.71±0.131）0.50±0.151）2）0.25±0.061）2）3）52.873 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P Cell viability/%100.23±13.25 76.35±20.301）50.21±16.581）2）30.16±11.151）2）3）34.050 0.000 Ki-67 1.01±0.25 0.75±0.161）0.53±0.111）2）0.30±0.081）2）3）31.123 0.000

圖1 利多卡因對AGS細胞Ki-67、PCNA蛋白表達的影響Fig.1 Effects of lidocaine on protein expressions of Ki-67 and PCNA in AGS cells

2.2 利多卡因對胃癌細胞AGS 遷移及侵襲的影響 與Con 組相比，利多卡因-L 組、利多卡因-M 組、利多卡因-H 組遷移細胞數及侵襲細胞數顯著減少（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），N-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且利多卡因-L組、利多卡因-M組、利多卡因-H組遷移細胞數、侵襲細胞數及E-cadherin、N-cadherin 蛋白水平比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2、表2。

表2 利多卡因對胃癌細胞AGS遷移及侵襲的影響（，n=9）Tab.2 Effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

表2 利多卡因對胃癌細胞AGS遷移及侵襲的影響（，n=9）Tab.2 Effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

N-cadherin 1.01±0.16 0.72±0.111）0.53±0.121）2）0.28±0.041）2）3）63.665 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P Number of migration cells 125.24±16.32 92.31±12.241）63.22±11.251）2）36.32±10.021）2）3）81.830 0.000 Number of invasion cells 97.65±11.26 70.32±13.241）51.26±15.231）2）31.24±10.051）2）3）45.354 0.000 E-cadherin 0.52±0.13 0.78±0.111）0.92±0.131）2）1.05±0.081）2）3）35.444 0.000

圖2 利多卡因對 AGS 細胞 E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達的影響Fig.2 Effects of lidocaine on expressions of E-cadherin and N-cadherin protein in AGS cells

2.3 利多卡因對胃癌細胞AGS 中H19、miR-671-5p表達量的影響 與Con組相比，利多卡因-L組、利多卡因-M組、利多卡因-H組細胞中H19表達顯著降低（P＜0.05），miR-671-5p 表達顯著升高（P＜0.05），且利多卡因-L 組、利多卡因-M 組、利多卡因-H 組細胞中H19、miR-671-5p 的表達量比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 利多卡因對胃癌細胞AGS中H19、miR-671-5p表達的影響（，n=9）Tab.3 Effect of lidocaine on expressions of H19 and miR-671-5p in gastric cancer cell AGS（，n=9）

表3 利多卡因對胃癌細胞AGS中H19、miR-671-5p表達的影響（，n=9）Tab.3 Effect of lidocaine on expressions of H19 and miR-671-5p in gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.05；compared with Lidocaine-L group，2）P＜0.05；compared with Lidocaine-M group，3）P＜0.05.

miR-671-5p 1.00±0.12 1.65±0.131）2.52±0.201）2）3.02±0.241）2）3）225.689 0.000 Groups Con Lidocaine-L Lidocaine-M Lidocaine-H F P H19 1.01±0.13 0.71±0.111）0.52±0.121）2）0.30±0.091）2）3）63.309 0.000

2.4 H19 靶向調控miR-671-5p starBase 預測顯示H19 的序列中含有與miR-671-5p 互補的核苷酸序列，見圖3。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，共轉染野生型載體WT-H19 的細胞實驗中，與miR-NC 組相比，miR-671-5p 組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；共突變型載體MUT-H19的細胞實驗中，miR-671-5p 組熒光素酶活性與miR-NC 組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。與si-NC組相比，si-H19組細胞中miR-671-5p 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與 pcDNA 組相比，pcDNA-H19 組細胞中 miR-671-5p表達水平顯著降低（P＜0.05），見表5。

表4 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（，n=9）

表4 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）Tab.4 Double luciferase report experiment（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

MUT-H19 1.01±0.21 1.03±0.11 0.253 0.803 Groups miR-NC miR-671-5p t p WT-H19 1.03±0.15 0.63±0.111）6.451 0.000

表5 H19靶向調控miR-671-5p的表達（，n=9）Tab.5 H19 target regulate expression of miR-671-5p（，n=9）

表5 H19靶向調控miR-671-5p的表達（，n=9）Tab.5 H19 target regulate expression of miR-671-5p（，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05；compared with pcDNA group，2）P＜0.05.

miR-671-5p 1.00±0.21 2.35±0.321）1.02±0.16 0.32±0.082）145.632 0.000 si-NC si-H19 pcDNA pcDNA-H19 F P Groups

圖3 H19的序列中含有與miR-671-5p互補的核苷酸序列Fig.3 Sequence of H19 contains a nucleotide sequence complementary to miR-671-5p

2.5 H19 過表達減弱利多卡因對胃癌細胞AGS 增殖的抑制作用 與利多卡因-H+pcDNA 組相比，利多卡因-H+pcDNA-H19 組細胞活力顯著升高（P＜0.05），Ki-67、PCNA 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖4、表6。

表6 H19過表達減弱利多卡因對胃癌細胞AGS增殖的抑制作用（，n=9）Tab.6 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

表6 H19過表達減弱利多卡因對胃癌細胞AGS增殖的抑制作用（，n=9）Tab.6 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on proliferation of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Lidocaine-H+pcDNA group，1）P＜0.05。

PCNA 0.27±0.07 0.92±0.181）10.097 0.000 Groups Lidocaine-H+pcDNA Lidocaine-H+pcDNA-H19 t P H19 0.31±0.08 1.32±0.121）21.009 0.000 miR-671-5p 3.01±0.18 1.15±0.161）23.170 0.000 Cell viability/%31.21±10.03 96.32±11.241）12.966 0.000 Ki-67 0.26±0.03 0.85±0.111）15.524 0.000

圖4 Western blot檢測Ki-67、PCNA蛋白表達Fig.4 Western blot was used to detect expressions of Ki-67 and PCNA protein

2.6 H19 過表達減弱利多卡因對胃癌細胞AGS 遷移及侵襲的抑制作用 與利多卡因-H+pcDNA 組相比，利多卡因-H+pcDNA-H19 組遷移細胞數及侵襲細胞數顯著增多（P＜0.05），E-cadherin 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），N-cadherin 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖5、表7。

圖5 Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達Fig.5 Western blot was used to detect expressions of E-cadherin and N-cadherin protein

表7 H19過表達減弱利多卡因對胃癌細胞AGS遷移及侵襲的抑制作用（，n=9）Tab.7 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

表7 H19過表達減弱利多卡因對胃癌細胞AGS遷移及侵襲的抑制作用（，n=9）Tab.7 H19 overexpression attenuated inhibitory effect of lidocaine on migration and invasion of gastric cancer cell AGS（，n=9）

Note：Compared with Lidocaine-H+pcDNA group，1）P＜0.05.

N-cadherin 0.29±0.06 0.78±0.131）10.267 0.000 Groups Lidocaine-H+pcDNA Lidocaine-H+pcDNA-H19 t p Number of migrating cells 39.32±10.12 98.65±13.241）10.681 0.000 Number of invasion cells 31.58±10.11 85.42±11.291）10.658 0.000 E-cadherin 1.03±0.05 0.56±0.111）11.669 0.000

3 討論

利多卡因可通過調節LncRNA-MEG3/miR-421/BTG1 分子軸抑制宮頸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡［8］；通過調節miR-539/EGFR 分子軸抑制肺癌細胞的增殖和轉移［9］；通過上調 miR-145 表達抑制胃癌細胞的生長、遷移和侵襲［10］。本研究結果顯示，不同濃度的利多卡因處理后胃癌細胞活力顯著降低，提示利多卡因可抑制胃癌細胞增殖。上皮-間質轉化（EMT）與腫瘤細胞遷移及侵襲密切相關，其中上皮型標志物為E-cadherin，E-cadherin 表達下調可促進EMT 的發生從而促進腫瘤細胞轉移，間充質細胞標志物N-cadherin表達下調可抑制EMT的發生從而抑制腫瘤細胞轉移［11］。本研究結果顯示，不同濃度的利多卡因處理后胃癌細胞遷移及侵襲能力顯著降低，E-cadherin 表達上調，N-cadherin 表達下調，且呈利多卡因劑量依賴性，提示利多卡因可抑制胃癌細胞的遷移及侵襲。

H19在胃癌細胞中表達水平升高并可促進細胞生長［12］；在多發性骨髓瘤細胞中表達上調并可通過激活BRD4 信號通路促進多發性骨髓瘤發生［13］。miR-671-5p在胃癌細胞中表達下調，circPIP5K1A可充當miR-671-5p 的海綿分子從而促進胃癌的發展進程［14］。本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實H19可靶向結合miR-671-5p。本研究結果顯示，不同濃度的利多卡因處理后胃癌細胞中H19 表達下調，而miR-671-5p 表達上調，且呈利多卡因劑量依賴性，而H19 過表達可減弱利多卡因對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

綜上所述，利多卡因可抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲，其可能是通過下調H19 表達及上調miR-671-5p 表達發揮作用，可為進一步揭示利多卡因抗胃癌的作用機制提高理論依據，并可為胃癌的治療提供新方向。