NH4+雙階段發酵控制谷氨酸工藝研究

劉景陽，余子辰，徐慶陽,2,3*

(1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457；3.代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300457)

谷氨酸是生物體中蛋白質的主要構成成分之一，也是參與機體氮代謝的基本氨基酸之一，在生命代謝活動中發揮著重要作用[1]。因此，L-谷氨酸被廣泛應用到食品、醫藥、化工、化妝品、飼料等行業中，已經成為世界上應用范圍較廣的氨基酸產品，年產量接近200萬噸，產值超過200億，市場前景廣闊，潛力巨大[2-3]。但是，相較于國外的發酵技術，我國的谷氨酸發酵技術產酸率僅在15%左右，糖酸轉化率在64%左右，與國際領先水平仍有較大差距。究其原因，主要是我國谷氨酸發酵行業發酵工藝簡陋，發酵過程調控粗放，進而導致菌體活力不足，產酸能力弱。因此，采用合適的發酵控制工藝成為提高谷氨酸產量的有效途徑[4-5]。

NH4+在微生物發酵過程中常被用作氮源，在細胞內參與輔因子、氨基酸、蛋白質、核酸等含氮化合物的合成，在菌體生長代謝中扮演著重要角色[6]。鄭夢杰等[7]在研究銨離子抑制 avermectin 生物合成的機理時發現，NH4+能直接或間接地影響菌體代謝過程中各種酶的活力，導致菌體內部TCA循環加強，丙酮酸含量降低，同時由于能量代謝加快，ATP大量生成，過量的ATP經反饋后會抑制糖酵解過程中的酶，從而降低糖酵解效率。馮寧等[8]在探究NH4+濃度對黃色短桿菌XV0505發酵生產L-纈氨酸的影響時，發現NH4+濃度過高會抑制菌體生長，使得菌體量較少，從而影響產酸期產量，另外，發酵前期高濃度的NH4+會產生一定程度的阻遏效應，使發酵產酸階段對于NH4+的同化作用減弱，降低產酸。同樣，對于谷氨酸發酵而言，合適的NH4+濃度對谷氨酸發酵過程中菌體活力和菌體產酸能力尤為重要，在以菌體生長為主的階段，過高的NH4+濃度會抑制菌體生長，降低菌體活力；在以產酸為主的階段，NH4+濃度過低會使得α-酮戊二酸不能被還原成氨基酸，無法生成谷氨酸，造成α-酮戊二酸積累[9-10]。

目前，谷氨酸的生產方法主要有化學合成法、酶解法和微生物發酵法，其中由于微生物發酵法原料成本低、反應條件溫和、易于擴大生產等優點，逐漸成為L-谷氨酸行業普遍采用的大規模L-谷氨酸生產方法[11-13]。發酵法生產谷氨酸時通常需要流加氨水，一方面用于維持適宜的發酵環境pH，保證菌體的正常生長；另一方面提供谷氨酸發酵所需的NH4+，保證菌體的產酸性能[14]。但是，由于發酵過程中用于調節pH的氨水中的NH4+并不能被全部用來生產谷氨酸，NH4+過量積累，最終高濃度的NH4+會導致菌體活力和產酸性能下降，發酵上表現為菌體衰老死亡，產酸量和糖酸轉化率降低[15-16]。

針對上述問題，本研究以生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9為供試菌株，分析NH4+對谷氨酸生產菌株的生長特性和生產性能的影響，同時構建L-谷氨酸生物合成的代謝網絡模型[17]，對其進行代謝流分析，針對發酵生產谷氨酸的不同階段，探究NH4+雙階段控制工藝，從而提高菌體活力和L-谷氨酸產量。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-谷氨酸生產菌：生物素亞適量型菌株黃色短桿菌GDK-9，天津科技大學代謝工程研究室保藏。

1.2 培養基

1.2.1 活化斜面培養基

葡萄糖2 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，瓊脂粉25 g/L。

1.2.2 種子培養基

葡萄糖35 g/L，玉米漿干粉15 g/L，氯化膽堿0.1 g/L，丁二酸1 g/L，豆粕水解液22 mL/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，VB50.5 mg/L，MnSO4·H2O 5 mg/L，VB10.5 mg/L，VB30.5 mg/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，VB120.5 mg/L，甜菜堿0.1 g/L。

1.2.3 發酵培養基

MnSO4·H2O 10 mg/L，氯化膽堿0.1 g/L，MgSO4·7H2O 1.8 g/L，KCl 1.8 g/L，豆粕水解液15 mL/L，VB30.5 mg/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，Na2HPO4·12H2O 3.5 g/L，VB10.5 mg/L，VB50.5 mg/L，VB120.5 mg/L，糖蜜1.2 g/L，玉米漿干粉2.5 g/L，甜菜堿0.1 g/L。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器 天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動控制發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;Agilent 1200高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；奧林巴斯高壓蒸汽發生器 上海奉賢協新機電廠；752分光光度計 上海分析儀器廠；Olympus生物顯微鏡 日本Olympus株式會社。

1.4 培養方法

1.4.1 菌種活化

使用接種環從保藏在-80 ℃的甘油管中蘸取2～3環菌液，然后均勻接種于2支一代斜面上，在32 ℃培養箱中持續培養12 h，之后從培養好的一代斜面中取1環菌體接種于二代斜面上，在32 ℃培養箱中持續培養12 h。

1.4.2 一級種子培養

將活化好的菌種斜面分別接種到3個1 L圓底燒瓶中，每個燒瓶中含有100 mL的種子培養基，然后將其置于32 ℃，220 r/min的搖床上，連續培養6～8 h。

1.4.3 二級種子培養

將培養好的一級種子通過發酵罐進樣口接種到含有種子培養基的5 L發酵罐中，通過流加氨水控制pH在7.0左右，溫度34 ℃，溶氧維持在30%～50%。

1.4.4 發酵培養

當OD600達到15左右時，按20%的接種量接入含有發酵培養基的5 L發酵罐中。發酵過程中通過流加調節液(用于調節pH)，將pH控制在7.0左右，通過控制轉速和通風量將溶氧穩定在30%～50%。初始發酵溫度為36 ℃，發酵時間為30～32 h。

1.5 檢測方法

1.5.1 pH的測定

采用發酵罐自帶的梅特勒pH電極進行測定，用pH 6.4～8.0的精密pH試紙輔助測定。

1.5.2 殘糖含量的檢測

每隔2 h取樣，離心，取上清液，將上清液稀釋100倍，用SBA-40E生物傳感分析儀檢測殘糖含量。

1.5.3 菌體量的檢測

每隔2 h取樣，分別稀釋10，20，50，100倍，用紫外可見分光光度計測量 OD600。

菌體生物量=吸光值 OD600×稀釋倍數。

注：吸光值范圍在0.2～0.8，超過量程后需換下一個稀釋倍數。

1.5.4 有機酸和氨基酸的測定

使用高效液相色譜分析儀進行有機酸測定，首先，取1 mL的發酵液置于1.5 mL的離心管中，12000 r/min離心5 min，取其上清液并進行適當倍數稀釋，然后過0.22 μm微孔濾膜，最后采用液相色譜分析儀進行含量檢測；色譜柱條件：色譜柱型號為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，8 μm)，用0.04 mol/L硫酸緩沖液洗脫，柱溫32 ℃，流速0.4 mL/min，檢測波長為210 nm。

發酵液中氨基酸(副產物)含量采用氨基酸分析儀進行檢測，發酵液的預處理方式同上述有機酸測定，稀釋適當倍數后，過0.22 μm微孔濾膜，最后使用氨基酸分析儀進行定量檢測；色譜條件：LCAK06/Na型色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，體積分數為50%的乙腈溶液緩沖液A和4.1 g/L的乙酸鈉緩沖液B同時洗脫，柱溫58 ℃，流速0.50 mL/min，檢測波長分別為570 nm和440 nm。

2 結果與討論

2.1 L-谷氨酸發酵過程分析

在5 L自控發酵罐中進行L-谷氨酸補料分批發酵，在發酵過程中每2 h測定菌體量(OD600)、L-谷氨酸產量和NH4+濃度，繪制L-谷氨酸發酵過程曲線，結果見圖1。

圖1 L-谷氨酸發酵過程曲線

由圖1可知，NH4+濃度在整個發酵過程中呈現持續上升的趨勢，其中有2個增長趨勢明顯加快的時間點，分別為4 h和20 h。在4 h時，由于菌體量快速上升，菌體開始轉型，導致L-谷氨酸分泌，因而需要流加氨水以平衡發酵環境的pH,發酵液中NH4+濃度明顯上升。到了20 h時，NH4+濃度已經超過了500 mmol/L，高濃度的NH4+嚴重影響菌體的生長，菌體活力開始下降，菌體量出現下降趨勢，L-谷氨酸生產速率也趨于平緩，同時由于菌體活力的下降，菌體代謝流異常，轉而生產副產物乳酸、丙氨酸，這些副產物同樣需要氨水來平衡發酵液中的pH，最終導致NH4+補充量大于消耗量，進而使得NH4+在發酵液中繼續積累。

由此可見，NH4+濃度的控制主要有兩個階段：第一階段為發酵前、中期，要盡可能地維持NH4+濃度使其既能保證菌體快速生長，又不影響菌體產酸；第二階段為發酵后期，由于長時間的發酵，菌體活力開始下降，如何避免高濃度NH4+對菌體的進一步毒害，從而保證菌體產酸速率成為重中之重。

2.2 L-谷氨酸發酵前、中期NH4+發酵控制對發酵結果的影響

本研究采用NaOH和氨水混合調節pH的方法，取代了傳統發酵中的全氨水調節，通過調節配比從而控制發酵液中NH4+的濃度。對于發酵前、中期的NH4+控制，本研究在發酵開始時分別采用NaOH∶氨水的摩爾比例為1∶3(A)、1∶5(B)、1∶7(C)、1∶9(D)、全氨水(E)的調節液代替氨水調節發酵液的pH，通過測定發酵過程中NH4+濃度、OD600和L-谷氨酸產量，明確了不同配比對菌體生長及產酸情況的影響，從而確定最佳混合比例，結果見圖2。

圖2 發酵前、中期NH4+控制的發酵過程曲線

E為全氨水調節，即基礎發酵，其發酵液中NH4+濃度增長速度最快，最大NH4+濃度為679 mmol/L，而隨著氨水比例的下降，NH4+的增長趨緩，A、B、C、D的最終NH4+濃度分別為101，203，486，590 mmol/L，較E分別降低了85.1%、70.1%、28.4%、13.1%。

另外，隨著氨水比例的下降，菌體量OD600的值逐漸升高，E的最大菌體量為51，最終菌體量為38，菌體量下降幅度為13，而A、B、C、D的最大菌體量分別為70，66，61，57，較E分別提高了37.3%、29.4%、19.6%、11.8%，最終菌體量分別為64，59，52，47，菌體量下降幅度分別為6，7，9，10，較E分別降低了53.8%、46.2%、30.7%、23.1%。對于L-谷氨酸來說，當NH4+下降時，L-谷氨酸產量表現為先升高后下降的趨勢，E的L-谷氨酸產量為153 g/L，A、B、C、D的L-谷氨酸產量分別為62，129，162，156 g/L，其中A、B較E分別下降了59.5%和17.3%，C、D較E分別提高了5.8%和2.0%。綜合結果來看，在發酵前、中期選擇NaOH和氨水混合比例為1∶7的調節液替代氨水，效果最好，其最大菌體量為61，最終菌體量為52，L-谷氨酸產量為162 g/L。

從上述結果分析可以看出，NH4+濃度對L-谷氨酸發酵產酸具有十分重要的影響：氨基酸中所需要的氮素來源是NH4+的同化，丙酮酸、α-酮戊二酸是L-谷氨酸代謝中的重要物質，在低NH4+環境下，丙酮酸和α-酮戊二酸這些參與銨同化的有機酸不能被利用，從而被排出細胞，影響L-谷氨酸的生產；當NH4+濃度過高時，在發酵初期菌體活力不足，菌體增長速率和最大菌體量都較低，當菌體增長速率不足時，會導致菌體間競爭生物素能力下降，進而使得菌體轉型不充分，影響菌體產酸，同時，過高的NH4+濃度在發酵后期會導致菌體衰老得更早，甚至自溶裂解，增加發酵液的黏度，影響氧的傳遞，對最終的L-谷氨酸產量以及后續的提取造成不良后果。

2.3 L-谷氨酸發酵后期NH4+發酵控制對發酵結果的影響

通過對發酵前、中期的NH4+發酵控制可以發現，僅在前、中期對NH4+濃度控制是不夠的，發酵后期NH4+依然處于較高濃度且有一直增長的趨勢，這表明L-谷氨酸發酵前、中期與發酵后期對于NH4+的需求并不一樣，為了保證L-谷氨酸發酵過程中NH4+濃度始終處于較為適宜的情況，為此本研究在L-谷氨酸發酵前、中期NH4+發酵控制的基礎上，對發酵后期的NH4+濃度進行控制優化，在發酵18 h開始采用NaOH和氨水混合比例(摩爾濃度)為1∶1(A)、1∶3(B)、1∶5(C)、1∶7(D)，通過每2 h測定發酵液中的NH4+濃度、OD600和L-谷氨酸產量，繪制過程曲線，見圖3。

圖3 發酵后期NH4+控制的發酵過程曲線

由圖3可知，D為NaOH和氨水的混合比例(摩爾濃度)1∶7，即全程1∶7調節發酵，D的NH4+濃度曲線處于持續增長趨勢，最終NH4+濃度為486 mmol/L。C的NH4+濃度曲線與D的NH4+濃度曲線趨勢相同，但相較于D來說較為平緩，24 h之后NH4+濃度又快速上升，最終NH4+濃度為400 mmol/L。A與B的NH4+濃度曲線在替換調節液后，NH4+濃度先是出現了下降趨勢，而后趨于平穩，且B相較于A較為平緩，A和B的最終NH4+濃度分別為72 mmol/L和121 mmol/L，表明在發酵后期NH4+濃度維持在100 mmol/L左右即可滿足菌體對于NH4+的需求。

由圖3中的菌體生長曲線和L-谷氨酸產量曲線可知，D的最大菌體量為62.4，最終菌體量為52.1，菌體量下降幅度為10.3，L-谷氨酸產量為158 g/L。A、B、C的最大菌體量基本相同，分別為63，63，62.1，最終菌體量分別為60.2，58，54.4，菌體量下降幅度分別為2.8，5，7.7，較D降低了72.8%、51.5%、25.2%。A、B、C的L-谷氨酸產量分別為159，167，161 g/L，較D分別提高了0.6%、5.7%、1.9%。

綜上所述，在發酵后期，發酵液中NH4+濃度越高，菌體活力下降越嚴重，表現為菌體產酸速率和產酸量下降，菌體衰老自溶，同時由于菌體自溶釋放的菌體碎片、菌體蛋白、內毒素等物質會進一步降低菌體活力，降低氧的傳遞效率，影響菌體的發酵性能，造成惡性循環；當發酵液中NH4+濃度過低時，NH4+對菌體生長的抑制作用解除，保證了菌體活力，但過少的NH4+又成為菌體產酸的限制因素，最終依然會導致產酸速率和產酸量的降低。因此，發酵后期合適的NH4+濃度對菌體的生長和生產性能有很大影響，通過上述結果分析，最終決定在發酵后期選擇NaOH和氨水的摩爾混合比例為1∶3的調節液作為替代，既保證菌體活力又不會成為產酸的限制因素，能夠提高L-谷氨酸的產量。

2.4 L-谷氨酸發酵過程中轉換時間對雙階段NH4+控制發酵結果的影響

為了探究雙階段NH4+控制的轉換時間對L-谷氨酸發酵結果的影響，本研究選擇在16 h(A)、19 h(B)、21 h(C)、24 h(D)進行兩個階段調節液的替換，通過對整個發酵過程中NH4+濃度、OD600、L-谷氨酸產量進行測定，明確不同轉換時間對雙階段NH4+濃度控制發酵結果的影響，從而確定最佳轉換時間，結果見圖4。

圖4 轉換時間對雙階段NH4+控制發酵結果的影響

由圖4可知，A和B的NH4+濃度曲線趨勢大致相同，二者在轉換完成后NH4+濃度快速下降，而后趨于平緩，最終NH4+濃度分別維持在50.4 mmol/L和120.1 mmol/L，C和D的NH4+濃度曲線逐漸上升，且C的曲線較D來說較為平緩，最終NH4+濃度分別為394 mmol/L和491 mmol/L。A、B、C、D 4種情況最大菌體量大致相同，分別為63.5，62.2，63，62.6，最終菌體量隨著轉換時間的推后逐漸降低，分別為60.8，59，58，56，下降幅度分別為2.7，3.2，5，6.6，L-谷氨酸最終產量分別為160，170，163，155 g/L。

通過分析發現，在16 h和19 h轉換調節液后，由于此時L-谷氨酸生產速度較快，因此轉換后NH4+被快速消耗，NH4+濃度逐漸降低，適宜的NH4+濃度保證了菌體活力，L-谷氨酸生產速率得以維持，之后趨于平緩。原因是發酵時間過長致使菌體衰老，L-谷氨酸生產速率下降，NH4+濃度維持在該水平，但16 h時，由于過早進行替換導致NH4+濃度過低，不能滿足菌體生產L-谷氨酸，因此16 h相較于19 h，最終的L-谷氨酸產量較低。在21 h和24 h進行轉換時，由于此時菌體活力已經下降，菌體量開始下降，菌體裂解死亡，副產物與內毒素積累，使得此時即使轉換調節液，補充的NH4+也無法被大量消耗，因而發酵液中NH4+濃度快速上升，L-谷氨酸產酸速率下降，影響最終的L-谷氨酸產量。綜合上述結果來看，最終選擇在19 h進行調節液的替換，此時進行替換既不影響前、中期L-谷氨酸的生產，同時還能保證發酵后期的菌體活力以及菌體的產酸能力。

2.5 最優條件下的發酵結果驗證

通過對上述實驗的論證分析可以得出，在采用雙階段NH4+發酵控制進行L-谷氨酸發酵實驗時，最佳發酵條件為在發酵開始時采用NaOH和氨水摩爾混合比例為1∶7的調節液代替純氨水進行pH的調節，在發酵19 h時采用NaOH和氨水摩爾混合比例為1∶3的調節液代替1∶7的調節液進行pH的調節，在此優化條件下對雙階段NH4+發酵控制策略進行多批次發酵結果驗證，結果見圖5和表1。

表1 兩種發酵方式對糖酸轉化率的影響

圖5 最優條件下的發酵過程曲線

在基礎發酵的NH4+濃度過程曲線中，NH4+濃度呈現持續上升趨勢，且上升速度較快，最終的NH4+濃度為678 mmol/L，而采用了雙階段NH4+發酵控制策略后，在發酵前、中期，發酵液中NH4+濃度快速上升，而后當L-谷氨酸產酸速率穩定后，NH4+濃度基本維持在300 mmol/L左右，而在發酵后期，由于調節液中NH4+濃度降低，NH4+濃度最終維持在100 mmol/L。

在基礎發酵中，發酵初期，高濃度的NH4+會影響菌體的生長，其最大菌體量為51，同時在發酵進行到20 h時，菌體出現明顯的下降趨勢，最終菌體量為38，菌體量下降幅度為13，采用雙階段NH4+發酵控制策略后，由于降低了發酵液中的NH4+濃度，解除了高濃度NH4+對菌體生長的抑制作用，因此最大菌體量達到了63，較基礎發酵提高了23.5%。在發酵后期同樣緩解了NH4+的高濃度抑制，使得菌體活力得到穩定，菌體衰老自溶現象緩解，最終的菌體量為58，較基礎發酵提高了52.6%，下降幅度為5，降低了61.5%。

同時在采用雙階段NH4+發酵控制策略時，通過實驗探究發現在L-谷氨酸發酵的前、中期，即L-谷氨酸生產的高峰期，NH4+濃度維持在300 mmol/L，發酵后期NH4+濃度維持在100 mmol/L時，發酵效果最好，此時的NH4+濃度既保證了菌體活力，又提高了L-谷氨酸生產速率和產量。由圖5中L-谷氨酸生產曲線和表1可知，采用雙階段NH4+發酵控制策略后，L-谷氨酸的生產速率、最終產量和糖酸轉化率都得到了提高，其最終產量為171 g/L，相較于基礎發酵的153 g/L提高了11.8%；糖酸轉化率也由60.2%提高到了61.6%。

2.6 雙階段NH4+發酵控制策略對谷氨酸代謝流向及副產物的影響

為了探究雙階段NH4+發酵控制工藝對谷氨酸發酵中乳酸、丙氨酸等副產物的影響，本研究對兩種不同發酵控制工藝在發酵過程中前、中期的葡萄糖、L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-賴氨酸和乳酸質量積累或消耗速率進行測定，見表2。

表2 兩種發酵方式代謝產物變化速率

將葡萄糖的摩爾消耗速率以100 mmol/L計算，運用MATLAB軟件線性規劃法分析得到兩種發酵方式的代謝分布情況，結果見圖6(A為基礎發酵，B為NH4+雙階段發酵控制工藝)[18-19]。

圖6 兩種發酵方式代謝流分布圖

由圖6可知，在基礎發酵中,L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-賴氨酸和乳酸的代謝流分別為73.52，0.83，0.93，3.97，而在NH4+雙階段發酵控制策略中L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-賴氨酸和乳酸的代謝流分別為76.37，0.65，0.73，2.93。與基礎發酵相比，L-谷氨酸代謝流提高了3.9%，其余副產物分別降低了21.7%、21.5%和24.7%。

在基礎發酵中高濃度的NH4+對菌體具有一定的毒害作用，影響菌體內部各種酶的活力，由圖6代謝流分布圖可知，采用NH4+雙階段發酵控制工藝后，由于調整了發酵液中的NH4+濃度使其最適宜于菌體生長和產酸，菌體內異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶等酶活力得到增強，代謝流更多地流向谷氨酸，另一方面，由于菌體活力增強，菌體衰老現象延緩，菌體自溶、裂解、死亡等減少使得發酵液中的蛋白、菌體碎片等大分子物質隨之減少，發酵液黏度下降，泡沫減少，氧的供給與傳遞效率提高，因而乳酸脫氫酶等酶活下降，降低了副產物的生成[20-21]。

3 結論

本研究對NH4+雙階段發酵控制工藝進行了研究，發酵開始時采用NaOH和氨水摩爾混合比例為1∶7的調節液代替純氨水進行pH的調節，在發酵19 h時采用NaOH和氨水摩爾混合比例為1∶3的調節液代替1∶7的調節液進行pH的調節，對菌體生長及生產性能的提高最大，在此條件下最大OD600達到了63，較基礎發酵提高了23.5%，最終的菌體量為58，較基礎發酵提高了52.6%，下降幅度為5，降低了61.5%。L-谷氨酸產量最終產量為171 g/L，提高了11.8%，糖酸轉化率也由60.2%提高到了61.6%。同時對其代謝流進行分析后發現，L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-賴氨酸和乳酸的代謝流分別為76.37，0.65，0.73，2.93，與基礎發酵相比，L-谷氨酸代謝流提高了3.9%，其余副產物分別降低了21.7%、21.5%和24.7%。因此，NH4+雙階段發酵控制工藝在穩定發酵液中NH4+濃度、提高菌體活力和產酸能力、降低副產物、使代謝流盡可能地流向谷氨酸等方面起到了積極作用，對谷氨酸的精細化控制和高效產酸具有借鑒意義。