豬乙型腦炎病毒的分離及鑒定

邵攀峰 尹忠良 孫慶霞 李少麗 朱國坡

（杭州佑本動物疫苗有限公司，浙江杭州 310018）

流行性乙型腦炎（Epidemic encephalitis），又稱日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JVE ），簡稱乙腦，是由黃病毒科（Flaviridae）黃病毒屬乙型腦炎病毒而引起的一種嚴重威脅人畜健康的急性中樞神經系統傳染病大多數動物成隱性感染，病毒通常在蚊-豬-蚊等動物間循環，豬被認為是JEV最重要的自然增殖動物[1]。豬還是JEV的重要貯存宿主和傳染源，人的感染大多是豬群感染JEV經蚊傳播而引致的[2]。我國對JEV的研究大多集中在人源和蚊源株，對豬源JEV的報道較少[3]。因此，加大對豬源乙型腦炎病毒研究不僅有利于豬傳染病防控，而且對人類乙型腦炎病的防控也具有重要的公共衛生意義。

本研究采集疑似豬乙型腦炎發病養豬場流產胎兒病料組織，取RT-PCR檢測陽性樣品，經過在BHK-21細胞繼代培養、病毒含量測定、病毒中和試驗、小鼠致死量測定等試驗研究，最終確定分離獲得1株豬乙型腦炎病毒，現將研究情況報告如下。

1 材料

1.1 病料

采集妊娠母豬流產胎兒腦組織樣品6份，-70℃凍存備用。

1.2 細胞及血清

BHK-21細胞、豬乙型腦炎特異性陽性血清均由杭州佑本動物疫苗有限公司制備和保存。

1.3 主要試劑

DMEM培養基和胎牛血清（FBS）購自GIBCO公司；Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、反轉錄試劑 盒（RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0）、DNA Marker、10×PCR Buffer、Taq 酶、dNTP 等均購自寶生物工程（大連）有限公司。

2 方法

2.1 病毒分離

取流產胎兒病料組織，用無菌生理鹽水按1：5（W/V）比例勻漿后制成懸液，反復凍融3次，經5000rpm離心5min，取上清、過濾除菌后-70℃ 凍存，備用。

對流產胎兒病料組織樣品用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit和RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0）試劑盒進行核酸提取及反轉錄。利用本實驗室建立的豬病PCR檢測方法進行豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒和豬乙型腦炎病毒篩查。檢測豬乙型腦炎病毒特異性引物 P1 5’-GCATCCCAAGCGAAGCAGGAGCC-3’，下游引物 P2 5’-AGCGTCCAATGTTGGTTTGTCG-3’，目的條帶 463 bp（E基因部分保守片斷），進行RT-PCR擴增。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀下觀察結果。

2.2 病毒細胞培養

將豬乙型腦炎病毒RT-PCR檢測為陽性的組織樣品按1.5% 比例接種到BHK-21細胞上，35 ℃ 吸附60 min，補加入維持液，置35 ℃，5% CO2培養。在顯微鏡下觀察BHK-21細胞CPE，培養至96 h或細胞病變達75%左右時將培養物反復凍融3次收獲，連續繼代培養，觀察乙腦病毒對BHK-21細胞的病變情況。

2.3 病毒含量的測定

取病毒液用含2% 新生牛血清的DMEM培養液作10倍系列稀釋，取10-1～10-7稀釋度，每個稀釋度接種6孔細胞培養板上已長成良好單層的BHK-21細胞4孔，0.4ml/孔；同時設不接毒的正常細胞對照組。將細胞培養板置37℃、5% CO2條件下吸附90min，吸附結束后棄去細胞培養板中液體，再每孔加入含1% 甲基纖維素的2% 新生牛血清DMEM培養液4.0ml，繼續置35℃、5%CO2條件下培養5日，然后棄去細胞培養板中液體，每孔加入固定液（含2.5%重鉻酸鉀以及5% 冰醋酸的5% 福爾馬林溶液）2.0ml室溫處理30min，棄去細胞培養板中液體，再每孔加入1% 結晶紫染色工作液2.0ml室溫染色20min，棄去結晶紫染色液并用PBS緩沖液（0.015mol/L，pH7.4～7.6）輕輕沖洗3次晾干，當細胞對照無蝕斑出現時進行蝕斑計數，選取每孔蝕斑數在10～100之間的稀釋度為基準計算病毒含量（PFU/ml）。

2.4 病毒中和試驗

將病毒液用含2% 新生牛血清的DMEM培養液稀釋至200PFU/0.4ml，與等量乙型腦炎病毒陽性血清混合后，置37℃中和90min，接種6孔細胞培養板上已長成良好單層的BHK-21細胞4孔，0.4ml/孔；同時設病毒對照孔4孔，每孔接種同條件處理的病毒與含2% 新生牛血清的DMEM培養液混合液0.4ml；正常細胞對照孔4孔，每孔加入含2% 新生牛血清的DMEM培養液0.4ml。將細胞培養板置37℃、5% CO2條件下吸附90分鐘，吸附結束后棄去細胞培養板中液體，再每孔加入含1% 甲基纖維素的2% 新生牛血清DMEM培養液4.0ml，繼續置35℃、5% CO2條件下培養5日，然后棄去細胞培養板中液體，每孔加入固定液（含2.5%重鉻酸鉀以及5% 冰醋酸的5% 福爾馬林溶液）2.0ml室溫處理30min，棄去細胞培養板中液體，再每孔加入1% 結晶紫染色工作液2.0ml室溫染色20min，棄去結晶紫染色液并用PBS緩沖液（0.015mol/L，pH 7.4～7.6）輕輕沖洗3次，晾干后用于進行蝕斑觀察。

2.5 小鼠致病力試驗

將病毒液用DMEM培養液作10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7這3個適宜稀釋度，每個稀釋度腹腔接種11～13g SPF小鼠5只，0.3ml/只。觀察14日，記錄各組小鼠死亡數量，按Reed-Muench法計算LD50。

3 結果與分析

3.1 病毒分離

進行豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒和豬乙型腦炎病毒核酸物質PCR檢測，結果表明，6份樣品中豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒的病原PCR檢測結果均為陰性。6份樣品進行乙型腦炎病毒RT-PCR檢測，有1份樣品擴增出明顯條帶，有2份樣品擴增條帶亮度微弱，擴增出目的條帶大小相符（463 bp），而陰性對照無條帶（圖1）。

圖1 豬乙型腦炎病毒RT-PCR結果

3.2 病毒細胞培養

RT-PCR檢測豬乙型腦炎病毒陽性的3份病料組織樣品，接種BHK-21細胞，并進行連續繼代培養，顯微鏡下觀察BHK-21細胞病變，結果表明，只有1號樣品能造成BHK-21細胞明顯而穩定的細胞病變，將1號樣品命名為JEV（A6株）。

3.3 病毒含量的測定

JEV（A6株）經過在BHK-21細胞進行連續傳代，結果表明，隨著病毒在細胞傳代適應，病毒含量不斷提高，病毒含量可達到106.6PFU/ml。（表1）

表1 不同代次豬乙型腦炎病毒含量測定結果

3.4 病毒中和試驗

將病毒液用含2% 新生牛血清的DMEM培養液稀釋至200PFU/0.4ml，與等量乙型腦炎病毒陽性血清混合后接種BHK-21細胞。結果表明，JEV（A6株）病毒對照孔4/4出現CPE；JEV（A6株）與乙型腦炎病毒陽性血清中和均未出現CPE孔；正常細胞對照孔4/4未出現CPE，結果表明JEV（A6株）能夠被乙型腦炎病毒陽性血清特異性中和。

3.5 小鼠致死量測定試驗

攻毒后觀察14日，記錄各組小鼠死亡數量，按Reed-Muench法計算LD50（表2）。結果表明，JEV（A6株）能引起小鼠表現有痙攣、戰栗、肢體麻痹等腦炎典型發病癥狀，并且可以造成死亡。

4 討論

乙型腦炎病的研究大多集中在人源和蚊源，然而豬被認為是JEV最重要的自然增殖動物[1]。豬還是JEV的重要貯存宿主和傳染源，病毒通常在蚊-豬-蚊等動物間循環。目前國內豬乙型腦炎病防控只有豬乙型腦炎活疫苗（SA14-14-2株）在售，并且乙型腦炎病毒（SA14-14-2株）也一直用于人乙型腦炎病的防控，存在的生物安全風險值得思考。雖然目前豬乙型腦炎活疫苗（SA14-14-2株）在豬的應用上安全、有效，但是研制開發動物專用乙型腦炎疫苗，豐富動物用乙型腦炎疫苗類別比如豬乙型腦炎滅活疫苗和基因工程疫苗的研發與應用，這樣更有利于乙型腦炎病的長期防控和凈化。

本研究從豬乙型腦炎發病養豬場流產胎兒病料分離獲得1株豬乙型腦炎病毒JEV（A6株）。JEV（A6株）能夠在BHK -21細胞上穩定增殖產生細胞病變，經過連續傳代培養后病毒含量可達到106.6PFU/ml。JEV（A6株）能引起小鼠表現有痙攣、戰栗、肢體麻痹等腦炎典型發病癥狀，并且可以造成死亡。本研究為進一步開展豬乙型腦炎滅活疫苗及相關研究奠定了基礎。