亞硫酸氫鹽預處理對黃貯玉米秸稈產甲烷潛力機理研究

蘇小紅， 王 欣， 王玉鵬， 趙 嫻， 陸 佳， 秦國輝， 周 闖， 劉 偉

(黑龍江省能源環境研究院， 哈爾濱 150009)

我國東北地區秸稈資源量極其豐富，其中玉米秸稈產量最大，但秸稈收獲的季節性與大型沼氣工程周年運行間存在矛盾，需對收獲秸稈作長期有效貯存，但秸稈收獲具有明顯的季節性與時效性，累計收獲總量遠超過即時轉化利用量，必須妥善儲存才能為全年可持續生產提供高質量原料[1-3]。近年來，廣泛用于飼草領域的青貯技術被用于能源作物的貯存，由于青貯要求秸稈含水率在60.0%～70.0%，含水率過低時便不能作業，因此受到時間上的限制。而東北地區秋季玉米收貨后秸稈被大量堆放在田地里，玉米秸稈發干黃化，原料含水率過低，達不到青貯技術的要求，青貯秸稈沼氣技術在東北地區無法實現。黃貯技術對原料的要求較低，且不受秸稈含水率限制，一年四季都可以做，是非常有推廣價值的飼料貯存技術，在我國北方寒冷地區秸稈沼氣工程應用上具有廣闊的推廣前景[4-6]。所以將黃貯技術應用于寒區沼氣工程秸稈原料的預處理技術非常適用，且在寒區已有沼氣企業采用黃貯技術預處理秸稈，效果較好。

黃貯技術具有易存貯、處理量大、無污染和原料供應足等優點，然而預處理時間長、存貯條件不合格易造成腐爛變質是黃貯技術發展的瓶頸問題。本文選擇亞硫酸氫鹽即SPORL法(Sulfite Pretreatmeng to Overcome Recalcitrance of Lignocellulose)為技術突破口。SPORL法在造紙業廣泛使用，當在在酸性和一定溫度條件下(50℃～180℃)，亞硫酸鹽溶液與木質素發生磺化反應引進磺酸基團，木質素和半纖維素變為可溶態[8-11]。黃貯是一種酸性產熱的厭氧環境，為磺化反應提供了條件，節省了磺化反應的成本，且減少了過高的磺化反應溫度造成的半纖維素過度降解為糠醛等后續發酵抑制物及芳香族化合物發生聚合反應影響纖維素酶活性等缺點[12-13]。同時，適當濃度的酸性亞硫酸鹽的存在不會破壞黃貯環境，另外，黃貯預處理后原料不需要經水洗滌，微調酸堿度至中性即可上發酵，最大限度的保留了原料中的養分，同樣經SPORL法與黃貯聯合預處理后原料中半纖維素、還原糖等養分溶出在預處理液中，不經洗滌固液一起經過厭氧發酵產沼氣，減少營養物質損失的同時提高了產氣效果，所以本研究將兩者結合起來，對聯合的預處理技術工藝參數進行優化研究，以尋求高效、低成本的秸稈預處理技術，這對寒區秸稈資源化利用的推廣與實際應用具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設備

本試驗所用玉米秸稈(以下簡稱CS)均采自黑龍江省能源環境研究院院內秋季收獲后的秸稈，粉碎成1～3 cm小段，用20～30目的篩子篩選，除去粉末，在預處理之前，需將全部試樣混合均勻，稈和葉的比例要適中， 以免出現誤差，最后平衡水分，作為預處理原料使用。

取5.0 g樣品于105℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，測定其總固體(TS)含量。馬弗爐600℃煅燒至恒重，測其揮發性固體(VS)含量，備用。厭氧發酵微生物菌劑取自黑龍江省能源環境研究院中試平臺厭氧發酵罐中發酵后的沼液。

實驗藥品試劑主要包括亞硫酸氫鈉(純度99.5%，分析純，天津市北方天醫化學試劑廠)、濃硫酸(純度98.0%，分析純，天津市贏達稀貴化學試劑廠)、 3，5-二硝基水楊酸 (純度98.0%，分析純，天津市光復精細化工研究所)、無水磷酸氫二鈉(純度98.0%，分析純，天津市致遠化學試劑有限公司)、十六烷基三甲基溴化銨(純度99.0%，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)、乙二胺四乙酸二鈉(純度99.0%，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)、十水合四硼酸鈉(純度99.8%，分析純，西隴科學股份有限公司)、氫氧化鈉(純度99.0%，分析純，西隴科學股份有限公司)、無水葡萄糖(純度99.0%，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)等。

主要儀器設備如下：ANKOM220型半自動纖維素分析儀(USA)；F57纖維素濾袋；封口機；高速萬能粉碎機FW80(天津)；藥典標準篩；精密pH計(PHS-3C)；DHZ-DA型電熱鼓風干燥機；馬弗爐(天津中環試驗電爐制造有限公司)；FA I 004 精密電子天平(上海精科天平廠)，島津 GC-2010Plus氣相色譜儀，AMPTSII全自動產甲烷分析測試系統(碧普儀器有限公司)，XL30掃描電子顯微鏡，(荷蘭FEL公司)。

1.2 實驗設計

1.2.1 預處理實驗設計

選用酸性亞硫酸氫鈉和黃貯法聯用對玉米秸稈進行預處理，黃貯實驗按添加不同濃度用量的亞硫酸氫鈉溶液與固定濃度硫酸組成的混合試劑作為不同處理的實驗組進行，設定的亞硫酸氫鈉濃度用量梯度分別為4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%，分別與0.2%的硫酸溶液按體積比3∶1比例混合，并逐層噴灑到準備好的秸稈原料中至含水率達到65.0%，壓實密封存儲在黃貯容器中，貯存30 d，同時以單一黃貯預處理作為對照組(以下簡稱DCSS)，預處理方法為將水逐層噴灑到粉碎后的秸稈中至含水率為65.0%，并壓實密封存儲在黃貯容器中，貯存90 d，備用[14-16]。

1.2.2 發酵實驗設計

將上述預處理后秸稈按照發酵條件進行厭氧發酵產甲烷，發酵條件分別為：發酵溫度為55℃，發酵濃度為15.0%，發酵pH值為7，發酵總質量為400.0 g，接種物與底物VS質量比為1.5，發酵時間為22 d。

1.3 實驗裝置

1.3.1 預處理實驗裝置

組合預處理實驗按照黃貯工藝進行，所以預處理實驗裝置即為黃貯實驗裝置(見圖1)，采用3 L燒杯作為黃貯容器，將上述黃貯后的秸稈按一定含水率逐層添加至燒杯中，邊噴水邊壓實，填滿后用塑料覆蓋并用繩勒緊密封，直至黃貯實驗結束。

圖1 預處理實驗裝置

1.3.2 發酵實驗裝置

實驗使用AMPTSII產甲烷潛力分析測試系統(型號01-0000-02，瑞典)作為厭氧發酵實驗裝置，具體如圖2所示，由恒溫水浴發酵裝置、CO2脫除裝置及甲烷產量計量裝置組成。

1.水浴鍋； 2.脫除CO2的百里酚酞試劑； 3.氣體計數裝置圖2 厭氧發酵實驗裝置

1.4 實驗方法

1.4.1 秸稈原料的組分與結構分析

1.4.1.1 秸稈原料電鏡掃描(SEM)分析

采用場發射電鏡對預處理前后玉米秸稈原料表面結構進行電子顯微鏡(SEM)掃描觀察。處理步驟：在試樣表面噴涂一層金涂層，探針電流為1.85A，工作電壓為20kv，然后在掃描電鏡儀下觀察秸稈預處理前后形貌變化并拍照。

1.4.1.2 木質纖維素組分測定：

將預處理后的原料，蒸餾水洗至中性，80℃烘干。將上述各樣品經FW80萬能高速粉碎機粉碎，過1 mm藥典標準篩。稱取0.5 g樣品置于F57濾袋中，封口機封口，運用ANKOM220型半自動纖維素分析儀對預處理各樣品中纖維素、半纖維素、木質素含量分別進行分析測定，方法詳見范氏Van Soest纖維素測定法[17]。

1.4.1.3 秸稈組分保留率

某組分保留率是指預處理后原料中某成分(如纖維素、木素、半纖維素等) 的保留量對預處理前原料中該成分含量的百分比。

計算公式如下:

(1)

式中：W為組分保留率；X、X1分別為預處理前后原料組分含量。

1.4.2 預處理玉米秸稈原料的糖化率測定

通過酶水解方法測預處理后秸稈糖化率，酶水解時取2 g絕干底物置于100 mL三角瓶中，分別加入50 mL HAc-NaAc緩沖液(pH值4.8、濃度0.l mol·L-1)，0.4 mL鹽酸四環素溶液，最后加入纖維素酶3.27 mL和纖維二糖酶0.6 mL，最后補加蒸溜水至總體積為100 mL?；旌暇鶆蚝?，將三角瓶放入溫度50℃、轉速200 r·min-1搖床內進行72 h的酶水解，酶水解后取樣，取上清液400 mL，裝入編號的離心管中，密封；將離心管在沸水中煮沸5 min，對樣品中的生物酶的進行滅活。之后將離心管置于微量高速離心機中，在800 r·min-1的轉速下離心10 min。離心后取離心管中的上清液，測定酶水解液中葡萄糖濃度。

第二，霜凍前剛追施過高氮萌芽肥的，葉面噴施蛋白質水解物/氨基酸類加海藻提取物類刺激素，最好土壤施用1次腐殖酸類肥料。

葡萄糖含量的測定：葡萄糖是可發酵底物的主要成分，依據國家標準采用DNS法測定糖含量。由于本項目采用的黃貯及黃貯與SPORL聯合預處理方法均對后續發酵沒有影響，預處理后的秸稈可固液共發酵，為進一步研究，實驗中分別對預處理后原料濾液及酶水解液中葡萄糖含量進行了分析。

計算公式如下：

(2)

(3)

式中：W1、W2分別為預處理后秸稈葡萄糖得率、酶水解糖化率；C1、C2分別為預處理后原料濾液及酶水解液中葡聚糖含量；C為預處理后玉米秸稈中纖維素含量；V1、V2分別為上清液體積及酶水解液體積； 0.9為葡萄糖和葡聚糖的換算系數；m為所取預處理原料絕干質量； 1.11為單位質量纖維素理論上可轉化的葡萄糖的量[18-19]。

2 結果與分析

2.1 亞硫酸氫鈉用量對玉米秸稈結構的影響

利用場發射掃描電鏡對預處理前后的秸稈分別進行物料表面結構掃描分析，結果見圖3～圖9。

圖3 未經預處理的空白CS組

圖4 經黃貯預處理的DCSS組

圖5 4.0%亞硫酸氫鈉處理組

圖6 5.0%亞硫酸氫鈉處理組

圖7 6.0%亞硫酸氫鈉處理組

圖8 7.0%亞硫酸氫鈉處理組

圖9 8.0%亞硫酸氫鈉處理組

從圖中可以看出，未經預處理的玉米秸稈結構致密，表面較為光滑平整，其結構阻礙了細菌分泌的纖維素酶對秸稈的降解。經不同方式預處理后，秸稈表面結構受到不同程度的破壞，經黃貯預處理后，秸稈表面結構變得粗糙、破損，說明表層臘質結構受到一定程度的破壞；用酸性亞硫酸氫鈉與黃貯聯合預處理的秸稈表面結構破壞較為嚴重，且出現許多微孔，有助于微生物對可發酵物質的利用和酶解的進行，有效提高了秸稈厭氧發酵產氣率，其中6.0%亞硫酸氫鈉實驗組對秸稈表面的破損率及孔隙率比較明顯。

2.2 亞硫酸氫鈉用量對玉米秸稈結構及化學成分的影響

預處理的目的是脫出部分半纖維素和木素，盡量提高酶和微生物與纖維素接觸的機率。亞硫酸氫鈉可以為體系提供 HSO-3和 SO2-3等離子，這些離子可以進攻木素基團使其磺化降解。因此，亞硫酸鹽與硫酸協同作用降解溶出木素和半纖維素，提高纖維素暴露的面積。實驗過程中，選擇固定了硫酸用量為0.2%，固液比為3，亞硫酸氫鈉用量梯度為 4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%，并與黃貯法聯用，將通過均勻噴灑酸性亞硫酸鹽溶液的玉米秸稈逐層壓實密封存貯于黃貯容器中，預處理時間為30 d。同時以未經預處理的CS實驗組作為空白實驗組，以未添加酸性亞硫酸氫鈉溶液的黃貯預處理組DCSS作為對照試驗組，其預處理時間為90 d，考察亞硫酸氫鈉用量對玉米秸稈結構、成分組成、組分保留率的影響如圖10和圖11所示。

圖10 亞硫酸氫鈉用量下秸稈組分含量

圖11 亞硫酸氫鈉用量下秸稈保留率

從亞硫酸氫鈉用量上來看，通過添加酸性亞硫酸氫鈉及黃貯聯合預處理后，秸稈組分中的木質素、半纖維素含量均有所降低，且從圖11中可以看出半纖維素保留率呈先迅速下降后區域平緩的趨勢，即亞硫酸氫鈉對半纖維素的降解速率呈先增加后降低的趨勢，這個轉折點出現在亞硫酸氫鈉用量為6.0%左右，這可能是因為適當增加亞硫酸氫鈉，提高了木素的溶出，暴露出半纖維素，從而提高了半纖維素的降解，主要原因是木素和亞硫酸氫根離子發生磺化反應，生產親水性的木素磺酸鹽，亞硫酸氫鈉用量的增加使體系中亞硫酸氫根離子增多，木素磺化反應速度加快，導致更多的木素溶出。

但隨著亞硫酸氫鈉用量的增加，同時也消耗了更多的硫酸，導致體系 pH值 提高，從而減弱了半纖維素的降解；木質素的降解隨著亞硫酸氫鈉用量的增加而增加，超過 6.0%以后木素溶出減緩，參考齊臨冬[22]等研究結果，亞硫酸氫鈉用量增加到 8.0% 以后不必再提高用量。而相對于DCSS黃貯預處理組其纖維素含量變化緩慢，且纖維素保留率隨著亞硫酸氫鈉用量的增加呈先緩慢增加后緩慢降低的趨勢，當亞硫酸氫鈉用量在6.0%條件下，預處理玉米秸稈的纖維素保留率及纖維素含量均達到一個較高值，且高于DCSS黃貯預處理組，此時，纖維素保留率達到80.0%以上，繼續增加亞硫酸氫鈉用量至8.0%，預處理秸稈纖維素含量和纖維素保留率變化緩慢，這表明存在一個合適的亞硫酸氫鈉用量，該用量有助于纖維素在酸性條件下的保留。有研究認為，亞硫酸氫鈉在酸性條件下會與六碳糖醛基形成加合物，從而阻止六碳糖進一步降解，至于亞硫酸氫鈉在酸性條件下如何阻止纖維素進一步發生水解反應，有待進一步研究[23]。

2.3 亞硫酸氫鈉用量對預處理秸稈糖化效果的影響

預處理是將秸稈轉化為可發酵性糖的同時，松散結構、增加空隙，以增加纖維素酶對纖維素的接觸面積，所以分析預處理后秸稈料液中葡萄糖含量及酶解糖化率有助于優化預處理參數，進而提高秸稈生物轉化速率。

在前期的研究中，對未經預處理的玉米秸稈(CS)及黃貯預處理玉米秸稈(DCCS)進行了糖得率及酶水解糖化率測定，結果表2所示。

表2 預處理前后玉米秸稈糖化率 (%)

從表2中可以看出，通過黃貯預處理后玉米秸稈的酶水解糖化率大幅提高，而未經預處理的玉米秸稈水洗上清液中基本沒有還原性的糖可轉化，所以依據本項目的研究目的及意義，在本項目選用的黃貯與SPORL組合法預處理玉米秸稈研究分析中，沒有對未經預處理的玉米秸稈空白組進行比較分析，僅以單一黃貯預處理組為對照實驗組即可。

亞硫酸氫鈉用量對預處理秸稈糖化效果的影響如圖 12所示。

圖12 亞硫酸氫鈉用量下預處理秸稈酶解糖化率和葡萄糖得率

由圖12可知，隨亞硫酸氫鈉用量的增加，酶水解糖化率和葡萄糖得率呈先逐漸上升后下降的趨勢。當亞硫酸氫鈉用量在4.0%～6.0%范圍內，酶水解糖化率與葡萄糖得率逐漸增大，最大值在亞硫酸氫鈉用量為6.0%時，其糖化率達83.0%。繼續增加亞硫酸氫鈉用量，酶解糖化率與葡萄糖得率略有下降。增加亞硫酸氫鈉用量能夠促進木素脫除和半纖維素水解，從而使得纖維素酶能夠與纖維素更好地接觸，促進預處理玉米秸稈酶水解。由于亞硫酸氫鈉用量的增加有助于預處理秸稈纖維素保留率的提高，使得當亞硫酸氫鈉用量大于4.0%時，葡萄糖得率大幅提高。

2.4 亞硫酸氫鈉用量對玉米秸稈厭氧發酵產甲烷效果的影響

預處理后玉米秸稈進行厭氧發酵產甲烷潛力實驗，共發酵22 d，每日測量甲烷含量，產氣效果如圖13和圖14所示。

圖13 亞硫酸氫鈉用量下預處理秸稈甲烷日產量

從甲烷日產氣量結果可以看出，未經預處理的CS空白實驗組直接進行厭氧發酵產甲烷潛力較低，其最高日產氣量僅為52.0 mL·g-1TS，且發酵后期基本處于停止狀態；其他經黃貯預處理及聯合預處理的試驗組產氣效果較好，發酵前期均有兩個產氣高峰，第1個產氣小高峰出現在發酵第3天，隨著發酵時間的延長日產甲烷量逐漸增大，最大日產氣量出現在亞硫酸氫鈉用量為6.0%實驗組，其發酵到第7天達到最大日產氣量為131.3 mL·g-1TS，這與僅通過黃貯預處理的實驗組出現第2個產氣高峰時間為發酵第9天相比提前了兩天，且最大日產氣量值高出14.17%，其他亞硫酸氫鈉處理組的產氣高峰也提前于單獨黃貯預處理組，這可能與亞硫酸氫鈉在酸性環境下對木質素的破壞有一定相關性，進一步增加了微生物對纖維素的接觸面積及降解速率，致使產氣速率及產氣量的提高。而發酵后期日產氣量呈現逐漸降低的趨勢，直至發酵終止，這與厭氧發酵整個發酵階段產氣規律相符。

而從圖14甲烷累積產氣量結果中可以看出，聯合預處理后的秸稈甲烷累積產氣量均好于單一黃貯預處理秸稈的產氣量，且最大甲烷累積產氣量是亞硫酸氫鈉用量為6.0%實驗組，甲烷累積產氣量達1462.2 mL·g-1TS ，在發酵到第9天甲烷累積產氣量就已達到總產氣量的一半，所以發酵主要產氣期在發酵前期，發酵22 d甲烷平均日產量為66.5 mL·g-1TS 。

圖14 亞硫酸氫鈉用量下預處理秸稈甲烷累積產氣量

3 結論

通過上述對預處理前后秸稈組分、結構特性及產甲烷潛力分析，得出以下結論:6.0%亞硫酸氫鈉用量下預處理玉米秸稈其糖化率在83.0%左右，甲烷日產量達131.3 mL·g-1TS，甲烷累積產氣量達1462.2 mL·g-1TS，甲烷平均日產量為66.5mL·g-1TS。通過聯合預處理的秸稈其組分中大量木質素被降解，纖維素保留率提高，結構疏散，纖維素、半纖維素可生化性提高，產氣效果較好，有利于后續資源化的利用，且在一定范圍內較低的亞硫酸氫鈉用量好于較高的亞硫酸氫鈉用量，所以亞硫酸氫鈉用量在4.0%～5.0%為宜，該預處理工藝適用于寒區秸稈資源化處理與利用的工程前預處理，且能節約成本，具有較好的經濟效益、環境效益、社會效益。