兒童雙耳感音神經性聾臨床特點及GJB2與GJB3基因突變分析

王團，蔡愛軍，張運波，吳瓊芳，張社江

(邯鄲市眼科醫院 邯鄲市第三醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，河北 邯鄲 056001)

雙耳感音神經性聾是一種聽力障礙性疾病，多發生于兒童，主要發病原因是由于機體的感音和傳音器官以及聽覺傳導通路中的聽覺神經和各級中樞神經出現病變，從而導致機體出現不同程度的聽力減弱[1-2]。臨床往往通過耳聾基因檢測對耳聾患者病變基因進行分析，即通過對人體的DNA進行檢測，發現患者存在的耳聾基因突變位點，尤其對于耳聾者而言，若其為家族性先天性耳聾成員，對其進行基因的檢測和分析，在很大程度上避免耳聾的再次發生具有一定的治療和預防價值[3]。近年來，隨著耳聾基因研究的逐漸增多，越來越多報道顯示縫隙連接蛋白26(gap junction beta2，GJB2)基因、縫隙連接蛋白31(gap junction beta3，GJB3)基因是我國耳聾兒童中較為常見的兩種致聾基因[4-5]。已有研究發現雙耳感音神經性聾主要通過常染色體隱性遺傳，其中由GJB2基因和GJB3基因導致的耳聾占據43%以上，而導致重度以及極重度語前聾的發生率在40%以上[6]，因此對耳聾患者的基因和基因分型進行正確的分析，可使其盡早接受臨床診斷和針對性治療，改善兒童聽力的預后，因此本研究通過對雙耳感音神經性聾兒童臨床表現及GJB2基因和GJB3基因特點進行分析，為兒童臨床診斷和治療提供依據，現將報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取2020年3月—2021年3月在本院健康體檢及耳鼻咽喉門診接受治療的150例雙耳感音神經性聾患兒作為研究對象，納入研究組，其中包括男95例，女55例；年齡在2個月至3歲，平均年齡(1.77±1.13)歲；其中包括85例先天性耳聾和65例后天性耳聾，包括46例雙耳對稱性耳聾和104例非對稱性耳聾；漢族133例，少數民族17例。選擇同期參與體檢的150例聽力正常的兒童作為對照組，包括男91例，女59例；年齡在7個月至3歲，平均年齡(1.76±1.35)歲；漢族129例，少數民族21例；所有正常兒童經聽力檢測和體格檢查均正常。比較兩組兒童年齡、性別等臨床一般資料，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有患者均簽署知情同意書，本研究經本院醫學倫理委員會審核批準。

納入標準：①均確診為雙耳感音神經性聾；②耳聾兒童和健康兒童臨床資料均齊全；③兒童年齡28 d至14歲；④均與兒童家屬取得聯系，獲得家屬知情同意。排除標準：①臨床病歷資料不完整；②年齡小于28 d或大于14歲；③患兒合并重大疾病史，如先天性心臟病等；④無中耳炎等耳部疾??；⑤嚴重肝腎功能不全兒童；⑥存在血液系統疾病等兒童。

1.2 研究方法

聽力測試檢測：①聲導抗檢測：臨床上常用的聲導抗測試主要包括3 部分：鼓室圖、同對側聲鐙骨肌反射(簡稱聲反射)和咽鼓管功能測試；②耳聲發射檢查：若耳聲發射能引出，說明外中耳健康，耳蝸功能正常，但并不能反映蝸后的情況。若耳聲發射未引出，說明耳蝸可能存在病變，需要通過其他檢查結果來綜合判斷病變位置。

采集受檢者手臂外周靜脈血樣本，采用上海華舜生物工程有限公司生產的試劑盒提取血液白細胞基因組DNA。采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增GJB2、GJB3基因編碼區。擴增完成后，向50 μL的反應體系中加入100 ng基因組DNA，加入后再次添加入10倍緩沖液(含15 mmol/L MgCl2)5 μL，之后使用5 μL 10倍脫氧核苷三磷酸，取2.5 μL濃度為2 μmol/L的上下游引物，并向其中加入1 μL DNA聚合酶。PCR反應于熱循環儀(美國ABI生物公司)進行。反應條件設置如下：94 ℃條件下5 min，隨后再放置30 s，完成后將其置于58 ℃條件下放置30 s，最后將其置于72 ℃條件下30 s，共對其進行30次循環反應，最后將其置于72 ℃條件下，使其反應5 min。擴增產物于4 ℃下冷藏保存。取4 μL PCR產物，采用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，得擴增片段長944 bp。GJB2、GJB3測序結果分析在DNAstar軟件上完成。序列：GJB2上游引物5’-AGAGAATGGAGAGTGAGGCTACC-3’，下游引物5’-CCAGGCATGGACAGAGGGAT-3’；GJB3上游引物5’-TCGTGGGTCGTGTCTTGTGTTGC-3’，下游引物5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.3 觀察指標

①觀察兩組兒童GJB2、GJB3基因檢測結果；②觀察研究組患兒耳聾程度；③觀察研究組不同程度聾患兒GJB2、GJB3基因突變率檢測情況及突變位點情況；④觀察研究組患兒雙親GJB2、GJB3基因突變檢測情況。

1.4 統計學方法

將數據進行匯總整理，建立數據庫，使用SPSS 24.0軟件進行統計學分析，對所得數據進行正態性和方差齊性檢驗，以百分比(%)表示計數資料，采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兒童基因檢測結果

研究組患兒中存在5種GJB2基因致病突變，分別為235delC、35insG、176-191del16、257C>G、95G>A，其中GJB2基因突變共50例，占33.33%(50/150)，40例與235delC突變相關，占攜帶GJB2基因突變患者總數的80.00%；多態性基因改變3種，共95例(79G>A、341A>G、427C>T)。GJB3基因突變共5例，占比3.33%(5/150)，包括538C→T和547G→A。對照組150例兒童發現GJB2基因突變共計3例，占2.00%(3/150)，發生致病突變有兩種，分別為95G>A和235delC，均為雜合突變；發生多態性基因改變有兩種，即79G>A和341A>G，未發現GJB3基因突變。研究組兒童235delC突變率顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 等位基因染色體突變譜 (條)

2.2 研究組兒童耳聾程度檢查結果

對研究組所有患兒進行純音測聽檢查和聽性腦干反應檢查，根據WHO聽力減退分級標準劃分[7]，檢測結果發現輕度(26～40 dBHL)25例、中度(41～60 dBHL)36例、重度(61～90 dBHL)49例、極重度(≥90 dBHL)40例。

2.3 研究組不同程度聾患兒GJB2、GJB3基因突變率檢測

研究組150例患兒中，極重度患兒GJB2、GJB3耳聾基因突變陽性檢出率較高，占比分別為33.33%和7.5%，見表2。

表2 研究組不同程度聾患兒GJB2、GJB3基因突變率檢測 [例(%)]

2.4 研究組不同程度聾患兒GJB2、GJB3基因突變位點情況

重度和危重度組致病突變位點例數顯著高于輕中度組，多態性改變例數低于輕中度組(P均<0.05)，見表3。

表3 研究組不同程度聾患兒GJB2、GJB3基因突變位點情況 [例(%)]

2.5 研究組患兒雙親GJB2、GJB3基因突變檢測

研究組150例患兒父母(共300人)中發現父親GJB2基因突變17例，占比5.67%；母親基因突變25例，占比8.33%。GJB3基因突變父親3例，占比1.00%，母親1例，占比0.33%，且對應患兒均檢出GJB2基因突變陽性，但父母親均未發現純合突變和復合雜交突變及GJB3突變，與常染色體隱性遺傳相符，見表4。

表4 研究組雙親GJB2、GJB3基因突變檢測 (例)

3 討論

雙耳感音神經性聾一方面是機體耳蝸的螺旋器發生病變，正常耳蝸螺旋器可以將接受的聲波轉變成神經興奮，而發生病變的耳蝸螺旋器則失去該項功能；另一方面是由于機體的神經或中樞神經出現障礙，無法將接收的外界神經興奮正常傳入[8-9]。有研究指出，當患者的大腦皮質中樞發生病變后，無法將語言進行分別，而經初步的聽力檢查也無法將感音性聾、神經性聾、中樞性聾進行詳細的區分，因此患者均屬于雙耳感音神經性聾[10]。對耳聾患兒而言，其生長和發育受到嚴重影響，甚至會導致兒童出現終生殘疾，所以臨床中合理有效的早期診斷和治療對兒童的預后具有重要意義[11]。

GJB2基因突變是隱性遺傳耳聾的首要危險因子，該突變的臨床分型包括錯義突變、移碼突變、無義突變等[12]。由GJB2基因突變而導致的雙耳感音神經性聾患者，大多為雙側對稱性耳聾，對于機體聽力的損傷較為嚴重，大多患者臨床表現為重度或極重度耳聾[13]。相較于其他基因，GJB2基因突變具有較為豐富的多態性表達，因此，明確GJB2基因突變的類型，分析其屬于致病突變還是多態性表達對臨床診治具有很高的價值，本次研究中通過對150例雙耳感音神經性聾兒童父母進行分析，發現父母親均未發現純合突變和復合雜交突變，因GJB2基因發生突變的主要原因是由于機體多數常染色體發生異常，其表現為隱性遺傳性耳聾，所以本研究結果符合常染色體隱性遺傳[14]。劉閩等[15]研究報道指出GJB2基因的突變在我國不同地區的雙耳感音神經性聾檢測中占4%～35%，主要突變為235delC。與本研究結果一致，在本次研究中，GJB2基因突變共50例，其中42例與235delC突變相關，占攜帶GJB2基因突變患者總數的84.00%，多態性基因改變3種(79G>A、341A>G、427C>T)。本次研究中還對GJB3基因進行分析，發現GJB3基因突變共6例，包括538C→T和547G→A，占4.00%，顯著低于GJB2基因突變，此外，本研究發現150例雙耳感音神經性聾兒童父母中父親GJB2基因突變17例(5.67%)，母親基因突變25例(8.33%)；GJB3基因突變父親3例(1.00%)，母親1例(0.33%)，分析其原因主要是由于遺傳基因多態性會伴有一定遺傳性狀，對于個體而言，其體內的DNA分子結構均不同，但這對于機體的基因功能和表達性狀不會產生影響[16]。雖然本研究發現多種多態性基因，但在基因序列中一些區域的突變僅會導致基因出現多態性，僅產生獨立作用，不會引起機體異常，如不參與蛋白質合成的片段或對機體的調節無顯著作用的片段等[17]。

GJB3基因的突變在一定程度上可能會引起機體常染色體顯性或隱性遺傳性神經性耳聾，該基因的突變將會改變GJB3中的第二細胞區出現改變，主要表現為語后聽力感音神經性耳聾[18]。本研究通過對不同程度耳聾的兒童進行基因檢測，發現GJB2、GJB3基因突變極重度陽性檢出率較高，占比分別為22.50%和7.5%，且重度和危重度組致病突變位點例數顯著高于輕中度組，多態性改變例數低于輕中度組(P均<0.05)，提示臨床醫生不應忽視輕度和中度感音神經性聾兒童遺傳學基因的檢測。還有研究指出，GJB2基因突變對不同種族的人群具有差異性，即不同人群GJB2基因各種類別突變發生頻率具有較大差異[19-20]，但本次研究由于地域和時間等限制，未對不同種族人群進行GJB2基因突變的分析，今后研究中可以將患者的選取范圍進一步擴大，對不同種族人群的GJB2、GJB3基因進行分析，探究不同種族兒童雙耳感音神經性聾GJB2、GJB3基因突變情況，為患兒的治療和診斷提供依據。

GJB2、GJB3基因突變檢測可以作為產前診斷的一種方法，利于有效診斷耳聾的發生率，從而做到盡早干預，值得在臨床推廣應用。