玫瑰黃鏈霉菌活性代謝產物誘導煙草灰霉病抗性機制研究

劉海濤，王 嬌，劉大群，2，李亞寧*

（1河北農業大學植物保護學院/河北省農作物病蟲害生物防治技術創新中心/國家北方山區農業工程技術研究中心，河北保定 071001；2中國農業科學院研究生院，北京 100081）

0 引言

【研究意義】煙草灰霉病是煙草整個生長期尤其是育苗期常發的世界性真菌病害（盧燕回等，2012），近年來，由于育苗集中化，該病害發生越發頻繁，適宜條件下短時間內即可造成大面積傳播和流行（陳宇春等，2020），嚴重時發病率可達100%，造成嚴重的經濟損失。其病原為灰葡萄孢（）（董金皋，2007），可引起煙苗黑莖、枯萎和葉斑等癥狀，濕度大時葉斑及病莖上密生灰色霉層。該病具有潛伏期較短、傳播速度較快、易感染易發病等特點，且病原菌侵染煙草葉片可造成煙葉組織壞死、腐爛，對煙葉產量和品質造成一定影響（鄧真等，2012）。世界上至少有97個國家和地區種植煙草，而我國煙葉產量約占世界煙葉總產量的36%，是最大的產煙國（張紅濤等，2020），且我國各大煙區的氣候及煙草種植品種等各不同，其中福建（鄧真等，2012）、廣西（譚海文，2012）、陜西（田佳等，2016）和黑龍江（周浩等，2019）等地煙草灰霉病發生較普遍。因此，煙草灰霉病防治是煙草生產中重要一環，對煙草產業的健康可持續發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】生產上防治煙草灰霉病的常用藥劑有多菌靈、甲基硫菌靈、異菌脲、乙烯菌核利和嘧菌環胺等（張銳，2017），但化學農藥的大量使用容易引起農藥殘留、病原菌產生抗藥性等問題（鄭媛萍，2018；宋郝棋等，2022），因此，煙草綠色防控技術越來越受到人們的重視（曾濤等，2022），主要包括煙草抗病性誘導（Naidu，2001）、拮抗微生物（陳磊，2021；張蒙蒙等，2022）、生物農藥（王軍等，2018；杜傳印等，2019；Tang et al.，2022）等。利用物理、化學和生物方法預先處理植物，使感病反應產生局部或系統的抗性稱為誘導抗病性（張元恩，1987）。誘導系統抗病性（Induced systemic resistance，ISR）可有效提高植株抗病能力（Kloepper et al.，2004），芽孢桿菌、木霉菌和鏈霉菌等生防微生物均可引起ISR。在擬南芥上發現假單胞菌可誘導植株產生ISR（van Loon et al.，1998）。煙草誘導抗病性對環境毒副作用小，是一種有潛力的煙草病害防治手段（李巧玲等，2015）。楊獻營（1993）系統總結了用誘導抗病性的方法防治煙草病害的途徑；張莉等（2017）用易脆毛霉多糖抑制煙草花葉病毒，防效達62%。脂氧合酶（LOX）、過氧化氫酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶與植物的抗病性密切相關，可作為衡量誘導抗病性的重要指標；此外，植物受到誘導物的刺激后，也會引發活性氧暴發、胼胝質沉積和抗病相關基因上調（Lu et al.，2019；鳳琦和張晶鈺，2020），以及抗病相關蛋白PR蛋白的產生（梁穎博等，2019）。目前研究較多的PR基因有、和等，基因超量表達可誘導植物產生系統抗病性（van Loon and van Strien，1999；田華，2016），基因表達產生的類甜蛋白可降解真菌細胞壁，起到抗病作用（李白，2011）?；虮磉_植物苯丙烷類代謝限速酶，可調控植保素等的合成（朱海生等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c】玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63是分離自馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤的生防鏈霉菌（Liu，1992），李亞寧等（2017）從該生防菌發酵液中提取到一組具有抑菌活性的多烯大環內酯類代謝產物Roflamycoin和Menmyco-A（簡稱R&M）。本課題組前期研究表明R&M可誘導黃瓜植株產生對白粉病的抗性（甄丹妹等，2019）、煙草植株產生對煙草灰霉病的抗性，但R&M誘導的煙草植株產生對灰霉病抗性的作用機制尚待進一步探究?！緮M解決的關鍵問題】在實驗室條件下，采用生理生化及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測的方法，對4～5葉期本生煙草經R&M誘導處理后植株非R&M接觸煙葉不同時間的抗病相關酶活性、抗病相關物質含量及抗病相關基因的表達量進行測定分析，旨在為利用R&M綠色防控植物灰霉病等重要病害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：本生煙（），由河北農業大學植物保護學院農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心保存提供。供試菌株：煙草灰霉病菌，采集自田間發病的煙草植株，用PDA培養基進行病原菌的單孢純化，4 ℃保存備用；使用前在PDA培養基上保濕培養5～7 d。供試藥劑：玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產物R&M（河北農業大學植物保護學院農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心自制）。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試煙草種植 溫室內將本生煙播種于育苗穴盤中，25～30 ℃、光照14 h條件下土培（營養土∶蛭石=2∶1）種植，待長至2～3葉齡時移栽至直徑為13 cm的花盆中，每盆1株，4～5葉期時用于后續試驗。

1.2.2 玫瑰黃鏈霉菌發酵液的制備及R&M提取按照張艷（2006）的方法進行玫瑰黃鏈霉菌發酵液的制備，按照趙志泉等（2007）的方法進行玫瑰黃鏈霉菌活性代謝產物R&M的提取。

1.2.3 過敏反應（HR）的染色驗證 采用0.4%臺盼藍染色法進行驗證。依據本課題組前期R&M對煙草灰霉病誘導抗病性最佳誘抗濃度試驗結果，將80 mg/L的R&M注射于4～5葉期本生煙葉片中，以清水作對照（CK），每處理1株，3次重復，處理12 h后觀察，待有明顯壞死斑出現后將葉片剪下，與對照組一起放入抽濾瓶中，加入0.4%臺盼藍染色液，真空抽濾5 min，用95%乙醇脫色至組織透明，于顯微鏡下觀察。

1.2.4 R&M誘導抗病標志基因的表達 依據本課題組前期R&M對黃瓜白粉病誘導抗病性最佳誘抗濃度試驗結果，將100 mg/L的R&M注射于4～5葉期本生煙葉片中，以清水作對照（CK），每處理1株，3次重復，處理后4 h剪下處理葉片（約100 mg），用錫箔紙包裹后，迅速放入液氮中冷凍，-80 ℃保存備用。采用半定量的方法檢測基因的表達情況。PCR擴增引物序列見表1。PCR反應體系20.0 μL：2×PCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 模板2.0 μL，ddHO 6.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，進行30個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.5 非藥劑接觸煙葉中CAT和LOX活性及過氧化氫（HO）含量測定 將溫室種植的4～5葉期本生煙幼苗分成2組，每組處理18株，3次重復，一組植株的一側全部葉片進行套袋，不進行任何藥劑處理，另一側葉片進行噴施80 mg/L R&M藥劑處理；對照組植株的一側全部葉片進行套袋，不進行任何藥劑處理，另一側葉片進行噴施清水處理（CK）。分別于處理0、1、2、3、5和7 d時取本生煙幼苗非藥劑接觸葉片（即套袋一側無R&M接觸葉片）（胡能等，2017），采用北京索萊寶生物技術有限公司的相關試劑盒測定CAT和LOX活性及HO含量。

1.2.6 木質素合成基因及病程相關蛋白基因和相對表達量測定 將溫室種植的4～5葉期本生煙幼苗分成2組，每組處理10株，3次重復，一組用100 mL濃度為80 mg/L的R&M溶液灌根處理2 d后，于上部第3片葉采用灰霉菌孢子懸浮液進行摩擦接種；對照組用100 mL清水灌根處理2 d后，于上部第3片葉采用清水進行摩擦接種（CK）。接種處理后1、12、24、48、72和120 h，用去酶、滅菌剪刀剪下各處理組煙苗對應時間段的非接種灰霉病菌葉片的相同部位（約100 mg），采后立即稱重，并放入-80 ℃冰箱中低溫保存。采用實時熒光定量PCR檢測樣品、和基因的相對表達量。qRT-PCR擴增引物序列見表1，試驗所用試劑均購自TaKaRa公司。PCR反應體系20.0 μL：2×TransStartR Top Green qPCR SuperMix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddHO 7.2 μL。擴增程序：94 ℃預變性0.5 min；94 ℃5 s，56 ℃15 s，72 ℃10 s，進行40個循環，設置熔解曲線。反應結束后，查看結果，導出數據，基因的相對表達量利用2方法分析基因轉錄的差異。

1.3 統計分析

運用SPSS 21.0和Excel 2016進行試驗數據處理和統計分析，應用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 R&M誘導抗病性驗證結果

2.1.1 HR反應染色結果 將80 mg/L的R&M注射于4～5葉期本生煙葉片中，以清水作對照。參照郭景紅等（2018）的方法進行樣品的采集、處理、顯微觀察。結果（圖1-a和圖1-b）顯示，經R&M處理的煙草葉片在臺盼藍作用下被染成藍色，CK的煙草葉片未能被染色，表明出現了micro-HR反應，R&M能使煙葉細胞發生程序性死亡。

2.1.2 抗病標志基因的表達 植株受到病蟲害等外界刺激后，常出現一系列生理反應，在受害部位出現壞死斑，伴隨HR反應的標志基因的表達。由圖1可知，100 mg/L R&M處理后，經RTPCR檢測發現，煙草葉片中基因明顯上調表達，而清水對照中基因不表達，表明R&M可誘導煙草葉片出現過敏反應。

2.2 R&M處理后煙草葉片中CAT和LOX活性及H2O2含量變化

2.2.1 CAT活性變化 CAT是一種誘導酶，由生物刺激素引起的植物體內CAT活性的增強與植株抗病性呈正相關。由圖2可知，噴施R&M 2 d后CAT活性一直處于增強狀態，且活性始終顯著高于CK（＜0.05，下同），表明噴施R&M可誘導煙葉CAT活性增高，從而提高植物抗病性。

2.2.2 LOX活性變化 圖3顯示，噴施R&M后第3 d ，煙草葉片中LOX活性開始顯著高于CK，第7 d達最高值，為3600 U/g，是對照的1.66倍。LOX是茉莉酸（JA）形成的關鍵酶，推測R&M通過誘導煙葉LOX活性增強而參與JA合成的信號轉導途徑，從而提高植物抗病性。

2.2.3 HO含量變化 活性氧暴發在HR反應中起著非常重要的作用，活性氧主要有超氧陰離子、羥自由基和HO。由圖4可看出，噴施R&M后第1 d，煙葉中HO含量迅速達最高值，為CK的1.13倍；噴施R&M 3 d后，可能由于體內防御酶活性增高，將HO分解為水，導致HO含量降低，且第2 d后HO含量逐漸降低，使植物避免了活性氧含量長時間過高對細胞的損害。

2.3 R&M處理后PAL、PR1和PR5基因相對表達量變化

2.3.1基因相對表達量變化基因是植物體內控制木質素合成的關鍵基因，其表達的苯丙氨酸解氨酶可促進酚類相關物質的合成，以及合成與抗病相關的木質素（朱海生等，2018）。如圖5所示，R&M處理葉片中基因的相對表達量在處理后24 h達最高值，為CK的25.37倍，此后基因表達量下降；在1～120 h，R&M處理的基因表達量均顯著高于CK。表明R&M可誘導煙草抗病相關基因的表達，從而增強植株系統抗病性。

2.3.2相對表達量的變化基因表達產物為類似β-1，3-葡聚糖酶活性的PR1蛋白，在抗真菌病害中發揮重要作用（Somssich et al.，1988）。由圖6可見，R&M處理葉片中基因的相對表達量在處理后24 h達最高值，為CK的11.23倍。表明R&M通過增強基因的表達而提高煙草植株對灰霉病菌的抗性。

2.3.3基因相對表達量變化基因產物為類甜蛋白，可降解真菌細胞壁，起到抗真菌病害的作用（李白，2011）。由圖7可見，R&M處理葉片中基因的相對表達量在處理后72 h達最高值，為CK的11.17倍。表明R&M通過增強基因的表達而提高煙草植株對灰霉病菌的抗性。

3 討論

在生產實際中，通過誘導植物產生抗病性防控植物真菌病害是一種安全有效、經濟環保的病害防治途徑，已受到研究者們的關注和重視，如化學誘抗劑BABA、BTH和CTS等的使用（朱路路，2014）。農用抗生素誘導植株產生抗病性，其誘抗效果可通過植株內相關防御酶活性變化、防御物質含量變化及抗病相關基因表達量變化等反映出來（Lu et al.，2019；鳳琦和張晶鈺，2020）。甄丹妹等（2019）研究了R&M誘導黃瓜白粉病抗性，發現這種誘導作用在病原菌侵染的條件下表現得更明顯。

正常生長的植株受到誘導處理后，與抗病反應相關的酶活性升高是誘導抗性產生的作用機制之一，其中CAT（Ehret et al.，2010）和LOX（Il' inskaya et al.，2000）活性的變化通常作為衡量植物體內防衛反應抵制病原微生物侵染的重要指標。已有研究表明，CAT活性可由生物刺激素誘導增強，進而誘導植株產生對病原菌的抗病性。本研究表明，溫室條件下，用80 mg/L R&M噴霧處理4～5葉期本生煙草植株，可誘導煙草葉片中CAT和LOX活性增強，噴施R&M 1 d后CAT活性即處于增強狀態，且1～7 d持續顯著高于CK；LOX活性在80 mg/L R&M處理的前2 d活性幾乎無變化，第3 d后LOX活性顯著增強。R&M誘導煙草植株煙葉中CAT和LOX活性增強，與杜亞楠等（2012）研究發現鏈霉菌702中分離純化的新型多烯大環內酯類抗生素農抗702通過誘導增強CAT活性進而增強植株抗病力的結論一致，亦與本課題組甄丹妹等（2019）前期研究發現R&M能誘導黃瓜葉片中CAT活性提高的結論一致。LOX是形成JA的關鍵酶（Oliw，2022），說明R&M也可能通過促使JA的形成，在植物體內充當抗病相關信號分子以促進JA介導的抗病信號轉導途徑，從而起到誘導煙草植株產生抗灰霉病菌的作用。

正常生長的植株受到誘導后，與抗病反應相關的活性物質含量變化是誘導抗性產生的作用機制之一，其中HO含量的變化通常作為衡量植物體內防衛反應抵制病原微生物侵染的重要指標。HO具有毒性，該物質產生的羥基自由基生物活性很強，因此，植株體內過量的HO需要CAT進行適量清除以維持細胞內的穩態（Willekens et al.，1995）。本研究中，溫室條件下，80 mg/L R&M噴霧處理4～5葉期本生煙草植株，煙葉中防御物質HO含量1 d后迅速達最高值，為CK的1.13倍，表明R&M能迅速激發植株細胞內活性氧的產生；在第2～3 d，可能由于體內CAT防御酶活性持續增高，將HO分解為水，導致其含量第2 d后逐漸降低，并逐步穩定在與CK相近水平，避免了植物由于活性氧長時間含量過高而損傷細胞。因此，本研究中80 mg/L R&M處理使煙葉HO含量先升高后降低這一結論符合科學邏輯，且與本課題組甄丹妹等（2019）前期研究發現R&M處理后1～5 d誘導黃瓜葉片中HO含量升高的結論一致，但相比第1張真葉展開和第2張真葉展開2/3時的黃瓜，R&M誘導4～5葉期本生煙草植株HO含量顯著升高出現的時間更早，為誘導處理后第1 d。研究結果充分證明R&M誘導植物抗病性的作用機制之一是由于R&M誘導了本生煙草植株體內HO含量的暴發并最終維持其穩態。

基因控制合成的木質素與植物的抗病性相關聯，可參與植株的抗病防衛反應（朱海生等，2018）?？共∠嚓PPR基因和經過誘導處理后其表達量的上調，可作為植物抗病能力增強的重要指標（van Loon and van Strien，1999；李白，2011；田華，2016）。本研究使用80 mg/L R&M溶液灌根處理4～5葉期本生煙草2 d后接種灰霉菌孢子懸浮液，結果顯示，木質素合成基因及病程相關PR蛋白基因、相對表達量均有不同程度上調，分別在24、24和72 h時相對表達量達最高值，R&M誘導不同時間后的表達量始終顯著高于CK，表明R&M的抗性誘導是玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63防治灰霉病的作用機制之一。

4 結論

R&M通過誘導煙葉產生過敏反應、協調活性氧水平、增強防御酶活性、促進抗病相關基因表達等提高煙草植株抗病性。R&M濃度在80 mg/L時即可誘導煙草植株產生對灰霉病菌的抗病性，藥劑作用方式為噴霧，其操作簡便，發酵易獲得所需藥品。玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63產生的活性代謝產物R&M具有作為植物病害誘抗劑的潛力，有望應用于植物灰霉病等重要病害的綠色防控。