煙草附球菌葉斑病的病原及生物學特性

何世芳，孫光軍，曾隕濤，潘忠梅，陳興江，桑維鈞，曹 毅*

（1貴州省煙草科學研究院，貴州貴陽 550081；2貴州大學煙草學院，貴州貴陽 550025；3中國煙草總公司貴州省公司煙葉處，貴州貴陽 550004）

0 引言

【研究意義】貴州煙草種植歷史悠久，近5年來，年均種植面積達12余萬ha（閆新甫等，2021），為我國煙草生產第二大省份?？緹熥鳛橘F州最重要的經濟作物之一，在全省財政收入及脫貧致富方面發揮十分顯著的作用（馬云飛等，2020）。近年來，由于氣候條件變化、種植品種單一和煙田連作比例較高等原因，導致烤煙病害發生呈上升趨勢（商勝華等，2016）?？緹熞允斋@葉片為主，葉斑類病害是影響其產、質量最重要的因素之一。附球菌屬真菌是一種重要的植物病原菌，其在煙草上可危害大田期成熟煙葉（Guo et al.，2020），也可侵染烤煙根部引起根腐?。℅ai et al.，2020）。煙草附球菌葉斑病在貴州的危害有上升趨勢，因此，明確貴州省內該病害的病原菌種類及生物學特性，對其有效防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】附球菌屬（）隸屬子囊菌門（Ascomycota）座囊菌綱（Dothideomycetes）格孢腔菌目（Pleosporales）亞隔孢殼科（Didymellaceae），該屬真菌寄主范圍廣，可侵染火龍果、高粱、獼猴桃和燕麥等多種作物（王俊麗等，2014；Stokholm et al.，2016；聶秀美等，2019；張國輝等，2021），引起根腐、葉斑、枝枯和果腐爛等癥狀，造成嚴重的經濟損失。是2017年發表的新種，被認為屬于內生菌、腐生菌或半寄生菌，但對該菌病理學方面的研究較少（Chen et al.，2017）；方麗等（2021）于2018—2019年調查浙江省桐鄉、武義等地的杭白菊種植基地的病蟲害發生種類，發現sp.可引起杭白菊葉斑病，但未明確其菌株的分類地位。目前有關煙草附球菌葉斑病的研究主要集中在病害發生及病原鑒定方面，付景圓（2014）首次報道重慶地區煙草附球菌葉斑病，使用形態學觀察以及rDNA-ITS和2種序列鑒定病原菌種類，但未能鑒定到種級；Guo等（2020）報道了貴州由附球菌屬引起的煙草葉斑病，通過多基因系統發育分析，將其病原菌鑒定為；同年云南報道了由引起的煙草根腐?。℅ai et al.，2020）?！颈狙芯壳腥朦c】2020年本課題組在對貴州主產煙區煙草葉斑類病害調查時發現煙草附球菌葉斑病類似癥狀病葉，通過鏡檢測定初步判斷病原菌為附球菌屬；現有關于煙草附球菌葉斑病的報道主要集中在癥狀描述和病原鑒定上，尚無針對煙草附球菌葉斑病病原菌生物學特性的相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】對采集自貴州省的煙草附球菌葉斑病病葉進行分離、Koch’s法則驗證，使用形態學特征結合核糖體內轉錄間隔區（ITS）、28S rRNA（LSU）、-微管蛋白（）和RNA聚合酶II第二大亞基（）部分序列的多核苷酸序列系統學分析等方法對病原菌進行鑒定，從而明確貴州煙草附球菌葉斑病的病原菌種類及生物學特性，為煙草附球菌葉斑病的綜合防治及抗病育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年在貴州省興義市種植的云煙87采集到煙草葉斑病標本，保濕后將其帶回實驗室進行病原菌分離純化。

供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、玉米粉瓊脂（CMA）、麥芽汁瓊脂（MEA）、燕麥瓊脂（OA）、察氏瓊脂（CDA）、高氏合成1號瓊脂（GSA）、水瓊脂（WA：瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）、煙葉煎汁瓊脂（TA：新鮮煙葉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、胡蘿卜瓊脂（CA：胡蘿卜200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）、營養瓊脂（NA）和松針瓊脂（PNA：新鮮松針葉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL）共12種培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離純化及鑒定 病原菌的分離純化及形態學鑒定：采用常規組織分離法對煙草附球菌葉斑病病原菌進行分離和純化（方中達，1998），純化鑒定的菌株保存于貴州省煙草科學研究院真菌實驗室，菌株編號YC1105。將純化菌株分別接種于PDA、OA和MEA培養基上，25 ℃培養7 d后，在顯微鏡下觀察菌落和菌絲形態，同時在菌落邊緣滴加2滴1 mol/L NaOH溶液10 min后開始觀察，并記錄培養基的顏色變化（韓帥等，2019），繼續培養菌株待產生分生孢子后，挑取分生孢子在顯微鏡下觀察病原菌的產孢結構、分生孢子等形態，并參照Boerema等（2004）的方法進行形態學鑒定。

分子生物學鑒定：采用試劑盒（DNeasy Ultra-Clean Microbial Kit，Qiagen）提取病原菌DNA，詳細操作參照使用說明書；將提取的DNA作為模板，使用表1引物（上海捷瑞生物工程有限公司合成）擴增菌株序列，反應體系和擴增條件參照Chen等（2015b）的方法進行。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將所得到的核苷酸序列通過BLAST進行序列比較，依據比對結果下載相關序列，使用MAFF（http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）和Trim AI（v.1.3）分別對序列進行比對和剪切（Chen et al.，2015a），通過raxml-GUI 2.0使用最大似然法（Maximumlikelihood，ML）構建系統發育進化樹（Edler et al.，2020）。

1.2.2 病原菌致病性測定 選取盆栽管理的健康K326煙葉，采用離體葉片刺傷和無傷接種法進行病原菌致病性測試（潘彤彤等，2020）：將菌餅（直徑6 mm）接種于有傷和無傷葉片上，用濕潤滅菌棉花覆蓋菌餅，以接種空白PDA培養基作對照，每處理3次重復，于28 ℃人工氣候箱中培養，3 d后開始觀察并記錄發病情況，選取接種處產生明顯病斑的葉片，根據柯赫氏法則，重新分離純化并鑒定病原菌。

1.3 病原菌生物學測定

1.3.1 培養基對菌株YC1105生長的影響 將培養5 d的菌株使用滅菌打孔器（直徑6 mm）在菌落邊緣打取菌餅，接種至12種培養基上25 ℃恒溫培養，培養基的配制參照吳希禹等（2019）的方法進行，每種培養基重復3次，培養5和7 d后觀察菌落生長情況，使用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.2 碳、氮源對菌株YC1105生長的影響 參照高晉等（2020）的方法測定：以Czapek Dox Agar為基本培養基，以蔗糖為碳源，并用等量的葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、山梨糖醇和可溶性淀粉代替蔗糖；同理，以硝酸鈉為氮源，用等量的蛋白胨、牛肉浸粉、氯化銨、尿素、甘氨酸、丙氨酸和酵母浸粉代替硝酸鈉，以制備含有不同碳源和氮源的培養基。在含有不同碳、氮源的培養基上接種6 mm菌餅，每處理重復3次，25 ℃暗培養，5和7 d后測量菌落直徑。

1.3.3 溫度對菌株YC1105生長的影響 參照郭強等（2019）的方法測定溫度對病原菌生長的影響，設5、10、15、20、25、28、30和35 ℃等8個處理，將6 mm菌餅接種于PDA培養基上，每個溫度重復3次，分別置于供試溫度的恒溫箱中培養，5和7 d后測量菌落直徑。

1.3.4 pH對菌株YC1105生長的影響 以PDA培養基為基礎，pH設定為4、5、6、7、8、9和10，共7個處理，3次重復。用1 mol/LHCl和1 mol/LNaOH溶液調節培養基pH，將6 mm菌餅接種于培養基上，25 ℃暗培養，5和7 d后測量菌落直徑。

1.3.5 光照對菌株YC1105生長的影響 將6 mm菌餅接種于PDA培養基，設連續黑暗、連續光照和12 h/12 h光暗交替3種處理，每處理重復3次，25 ℃培養，5和7 d后測量菌落直徑。

1.3.6 菌絲體致死溫度測定 致死溫度參照劉思睿等（2019）的方法進行測定：將6 mm菌餅放入無菌試管中，并加入2 mL無菌水，以45 ℃為基礎溫度，1 ℃為一個梯度，50 ℃為最高溫度，將其放入水浴鍋中處理10 min后迅速冷卻，轉接至PDA培養基培養5 d，觀察各處理菌絲生長情況。

1.4 統計分析

采用Excel 2010和SPSS 18.0進行數據分析，多重比較采用Duncan’s新復極差法。

2 結果與分析

2.1 癥狀描述

病害發生于烤煙成熟期，主要危害葉片，主要癥狀為褐色病斑，圓形或橢圓形，病斑邊緣伴有黃色暈圈（圖1-A），病斑直徑0.45～0.60 cm，嚴重時病斑融合呈枯焦葉或碎葉。

2.2 病原菌致病性

接種6 d后葉片開始發病，葉片上產生直徑0.8～1.6 cm大小病斑，初期病斑呈淡黃色，隨著時間的延長，病斑逐漸變成褐色，外圍伴有黃色暈圈（圖1-B），無傷接種（圖1-B）及針刺接種（圖1-C）均能引起葉片發生病斑；對照葉片未產生病斑（圖1-D）；在發病處重新分離到的菌株與原接種的菌株一致，證明該菌株為煙草附球菌葉斑病致病菌。

2.3 病原菌培養性狀及形態

菌株YC1105在PDA培養基上培養7 d后，菌落直徑為67.5 mm，邊緣規則圓形，菌絲紅色，外緣白色，氈狀，致密，背面有紅色色素沉積（圖2-A）。在OA培養基上培養7 d后，菌落直徑為81.3 mm，菌絲較濃密，絨毛狀，背面無色素沉積（圖2-B）。在MEA培養基上培養7 d后，菌落直徑為76.4 mm，菌絲中央呈灰綠色，外緣白色，氈狀，較PDA培養基上菌絲更濃密，菌落背面中心呈墨綠色，外圍淺黃色（圖2-C）。使用1 mol/L NaOH溶液處理MEA培養基20 min后，培養基顏色變為墨綠色，之后逐漸變為棕色，為陽性反應。分生孢子無色、無隔、橢圓形，單胞（圖2-E），大小為4.35～6.44 μm×2.10～3.27 μm，分生孢子器橢圓形（圖2-D），無剛毛，埋生或表生于培養基表面，菌絲末端著生淺粉色圓形膨大細胞（圖2-F），結合鑒定手冊描述細則可將菌株YC1105歸入section中。

2.4 病原菌分子鑒定結果

通過ITS、LSU、和基因序列擴增和測序，分別獲得大小約536、1329、341和882 bp基因片段，NCBI 登 錄 號 分 別 為MZ496638、MZ496641、MZ672001和MZ672002。將所得序列與GenBank數據庫中的相似序列進行BLAST比對分析，結果顯示與和相似度高達100%，但未能準確鑒定到種。將NCBI下載的對應18條模式菌株基因序列與供試菌株序列構建系統發育進化樹，從圖3可看出，供試菌株與（NCBI登錄號分別為：KY742102、KY742256、KY742344和KY742175）的遺傳距離最近，聚于同一分支，且支持率為100%。結合形態特征及分子生物學鑒定結果，將煙草附球菌葉斑病致病菌鑒定為。

2.5 病原菌生物學特性分析結果

2.5.1 培養基對菌株YC1105生長的影響 從表2可看出，菌株YC1105在12種培養基上均可生長，但生長速度有所不同。該菌株在CA培養基上生長最快，其次為OA培養基，培養7 d時菌落直徑分別為73.00和63.33 mm；在WA培養基上生長最差，菌絲稀疏，培養7 d時菌落直徑為28.67 mm，顯著小于其他處理菌落直徑（＜0.05，下同），不利于菌絲生長。

2.5.2 碳源對菌株YC1105生長的影響 如表3所示，菌株YC1105均能在供試的8種碳源培養基上生長，其中在麥芽糖和可溶性淀粉培養基上的長勢較好，二者間無顯著差異（＞0.05，下同），培養7 d時菌落直徑分別為69.17和66.67 mm；病原菌在山梨糖醇培養基上的長勢較差，培養7 d時菌落直徑為44.50 mm，顯著小于其他碳源處理。

2.5.3 氮源對菌株YC1105生長的影響 8種氮源對菌株YC1105的生長影響結果（表4）表明，煙草附球菌葉斑病病原菌均能在供試的8種氮源上生長，但存在顯著差異。其中在牛肉浸粉作氮源的培養基上菌絲生長最快，培養7 d后，菌落直徑為69.83 mm；而尿素不利于菌絲生長，培養7 d后菌落直徑為33.00 mm，顯著小于其他處理的菌落直徑。

2.5.4 溫度對菌株YC1105生長的影響 由表5可知，菌株YC1105可在5～35 ℃下生長；在5 ℃條件下培養5 d菌絲不生長，培養7 d后菌絲開始生長，菌落直徑為6.67 mm；病原菌最適宜生長溫度為28 ℃，培養5和7 d的菌落直徑均最大，分別為54.50和71.00 mm；當溫度超過28 ℃后，菌絲生長速度開始下降。5和10 ℃菌絲生長較慢。

2.5.5 pH對菌株YC1105生長的影響 如表6所示，菌株YC1105在pH 4～10范圍內均能生長，pH為6時，培養5和7 d的菌落直徑均大于其他pH，分別為48.67和61.33 mm；菌絲在偏酸性環境中生長旺盛，培養7 d的菌落直徑顯著大于堿性環境菌落直徑。綜上，菌株在偏堿性條件下生長較緩慢，弱酸性則有利于菌株YC1105生長。

2.5.6 光照對菌株YC1105生長的影響 如表7所示，菌株YC1105在連續光照、連續黑暗和12 h/12 h光暗交替3種條件下菌絲生長無顯著差異，光照對病原菌生長影響不明顯；培養7 d后病原菌在3種光照條件下均未產孢。

2.5.7 致死溫度的測定 菌株YC1105在45～50 ℃水浴10 min處理后菌絲生長情況見表8，48 ℃水浴10 min后仍可見菌絲生長，而49 ℃水浴10 min后未見菌絲生長。因此，推斷菌株YC1105菌絲的致死溫度為49 ℃，水浴10 min。

3 討論

附球菌屬是亞隔孢殼科一類致病性較強的真菌（陳倩，2015），該屬早期鑒定主要采用傳統形態學鑒定及寄主相關命名的方法，導致分類混亂，單靠形態學及ITS基因序列難以對其進行準確鑒定（Deng et al.，2011）。Aveskamp 等（2010）利用4 個 基 因（LSU、、ITS和）對亞隔孢殼科進行系統發育研究，對該科進行分類學修訂，并新建立附球菌屬，將原本屬于廣義莖點霉section部分的、和歸入新建立的附球菌屬中。Chen等（2017）年使用、LSU、ITS和進行多位點系統發育分析，對附球菌屬進行了補充和完善。本研究通過形態學及分子生物學方法，將煙草附球菌葉斑病病原菌鑒定為，其在3種培養基上的菌落直徑、分生孢子器、分生孢子大小，對NaOH反應呈陽性及菌絲末端分化出圓形膨大細胞，與Chen等（2015a）對的描述基本一致，但其菌絲顏色和產生的色素有所不同，可能與寄主、培養條件及生態適應性有關。

在火龍果（肖顯梅等，2018）、山藥（韓帥等，2019）和胡頹子（Qi et al.，2021）等作物上均有報道，但對其生物學特性的研究甚少。本研究生物學特性結果表明，煙草附球菌葉斑病病原菌在胡蘿卜瓊脂（CA）培養基上生長最快，其次為燕麥瓊脂（OA）培養基，與黃鈜琳等（2021）報道茶葉斑病病原菌（）在OA培養基上生長速率最快的結果不一致，出現差異的原因可能與其試驗設計未使用CA培養基有關；病原菌最適pH為6，與肖顯梅等（2018）報道火龍果莖斑病病原菌最適pH為6～7的研究結果基本相似。曾慧蘭等（2018）報道百合葉尖干枯病病原菌生物學特性，表明最適氮源為牛肉浸膏、最適碳源為乳糖和葡萄糖，與本研究得出最適氮源為牛肉浸粉、最適碳源為麥芽糖的結果存在一定差異。煙草附球菌葉斑病病原菌生長最適溫度為28 ℃，與肖顯梅等（2018）報道火龍果莖斑病病原菌最適溫度為26 ℃的結果不一致。上述差異的產生可能與生態環境和寄主不同有關，表明來自不同寄主的生物學特性有所差異。煙草附球菌葉斑病病原菌致死溫度為49 ℃，水浴10 min，因此在生產上，播種前對種子進行溫湯處理，可降低該病害的發生風險。

本研究較系統地對引起貴州煙草附球菌葉斑病病原菌進行了生物學特性分析，旨在為防治該病提供較全面的理論依據。鑒于葉斑病在煙草種植上造成的危害，今后應對該病原菌的藥劑敏感性、發生流行規律及抗病品種的培育等開展系統、深入的研究，以有效控制煙草附球菌葉斑病的危害。

4 結論

本研究通過形態學和分子生物學方法，將分離獲得的煙草附球菌葉斑病病原菌鑒定為；其菌絲生長溫度和pH范圍較寬，最適溫度為28 ℃，弱酸性條件有利于菌絲生長；病原菌能利用多種氮源和碳源，最適碳源為麥芽糖，最適氮源為牛肉浸粉，致死溫度為49 ℃，光照對菌絲生長影響不顯著。