北美鵝掌楸LtAGO1基因的克隆、表達及其啟動子分析

魏靈敏， 溫少瑩， 馬際凱， 夏 輝， 李嘉昱， 吳栩佳， 李火根

( 南京林業大學 林木遺傳與生物技術教育部重點實驗室， 南京林業大學 南方現代林業創新中心， 南京 210037 )

葉是高等植物進行光合作用和蒸騰作用的主要器官，葉原基起源于莖頂端分生組織(shoot apical meristem, SAM)的周邊區。在控制細胞由分裂轉入生長的形態建成過程中，葉原基發生了極性分化(Bowman & Eshed, 2000)。1基因的突變將會影響葉原基分化及器官極性的選擇等一系列發育進程(Wu et al.，2009； Liu & Nonomura, 2016)。王永益(2019)通過點突變能獲得擬南芥針狀葉的1-27突變體和卷曲芽狀復葉的1-38 突變體。李素芬等(2014)對1超表達得到了葉緣呈鋸齒狀的擬南芥。在模式植物水稻和玉米中，采用敲除、過表達1基因及互補缺陷突變體的方法，初步明確1基因的缺失會降低水稻的結實率和花粉育性，而1基因的過表達能使葉片正面卷曲、株高降低(徐東東， 2014；Li et al.，2019)。番茄168靶向調控1基因的表達，增強了番茄對低鉀脅迫的抗性(Liu et al.，2020)；擬南芥1-27比野生型對淹水更敏感，且在低氧條件下和4共同調控該脅迫信號的的傳遞(Elena et al.，2020)。姚曉華等(2021)發現，青稞1編碼的蛋白在抗條紋病的調控通路中發揮重要作用。近期研究發現，1是通過誘導茉莉酸(JA)信號通路中相關基因的產生并激活JA反應來響應脅迫(Liu et al.，2018)?？梢?，1通過多種途徑參與植物抗逆的響應及調節過程。此外，1參與小麥花藥和花粉粒的發育(馮楠，2018)，擬南芥根分生組織需要1的活性來維持細胞的增殖(Adrien et al.，2019)。1基因在植物器官極性選擇、分生組織分化、花器官發育和脅迫響應等多方面起重要調控作用。

北美鵝掌楸與鵝掌楸都是以葉形奇特、干型優美為特色的具有觀賞價值的園林樹種，其葉片具有三裂和五裂的形態差異，是研究觀葉樹種葉形多樣性及品種改良的理想材料。近年來，楊穎等(2014)證實北美鵝掌楸中有9個基因參與葉片的衰老進程。Ma等(2018，2019)探明鵝掌楸從葉原基分化成葉片4個階段的形態發育過程，從轉錄組中篩選驗證10條與葉發育相關的差異基因，發現6基因可使擬南芥葉序紊亂、葉片深裂及不育。然而，目前對于北美鵝掌楸奇特葉形的形成機制仍不清楚，1基因是否參與了葉形發育的調控進程，與北美鵝掌楸葉芽和花芽孕育的關系也尚未明確。

高等植物的生長發育過程受基因的表達量控制，基因的轉錄水平受包含順式作用元件的啟動子影響(Dey et al.，2015)。擬南芥和啟動子可調控花和花藥的發育 (Shih et al.，2014；Dai et al.，2019)，表明啟動子在影響植物的性狀和調控方式上發揮重要作用。本研究采用RACE克隆技術獲得北美鵝掌楸1基因的全長cDNA，并對其進行生物信息學預測及組織差異表達分析，初步了解該基因功能，并重點關注1基因啟動子序列的分析和組織表達特異性，旨在為1基因啟動子對相關基因的調控機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同組織的取樣 在南京林業大學的鵝掌楸種源試驗林中，選取物候期基本一致的北美鵝掌楸(美國南卡羅來納州種源)和鵝掌楸(中國武夷山種源)作為供試材料。2018年4月，分別采集長勢良好的3個株系幼嫩葉片的3個部位(葉緣、葉基部和葉中部)，具體參考沈宗根等(2003)的方法。同時，采集北美鵝掌楸同一時期的8個組織樣品(葉片、莖、雄蕊、雌蕊、花芽、花萼、葉芽和花瓣)。2018年3—8月期間，分別采集北美鵝掌楸葉芽萌動期、幼葉期、葉成熟期和葉衰老期的葉片，具體參考肖懷娟(2014)的方法?？蓪⑵鋭澐譃?個部分，即a、c和e為葉緣凸出部分，b和d為葉緣凹陷部分，f為葉柄，g為葉中間部分。據前期的物候觀察發現，在7月，北美鵝掌楸葉片的形態變異最大。因此，本研究于2018年7月采集北美鵝掌楸不同大小的葉片，用消毒的剪刀分離樣品至1 g，具體參考李四游(2015)的方法。所有樣品重復取樣3次，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于提取RNA。

1.1.2 生化試劑 植物總RNA提取試劑盒購自天根(TIANGEN)生物公司，PrimeScriptRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒、3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptRTase試劑盒、SMARTerRACE 5′/3′ Kit 反轉錄試劑盒、PrimeSTARMax DNA Polymerase高保真酶、DL 2 000 DNA marker和SYBR Premix Ex Taq酶均購自Takara公司，核酸染料Gel Stain、Easy Pure Quick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒和Blunt載體均購自北京全式金生物技術有限公司，ClonExpressUltra One Step Cloning Kit重組酶購自諾唯贊生物公司，大腸桿菌()T1與農桿菌()GV3101購自上海唯地生物公司，過表達載體PBI121-GUS由本實驗室提供，引物合成由南京金斯瑞公司完成，其編號及序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據北美鵝掌楸()轉錄組數據庫(http://ancangio.uga.edu/content/liriodendron-tulipifera)，篩選出注釋名為1基因的EST序列，通過Oligo 7軟件設計PCR擴增引物，以北美鵝掌楸葉芽的cDNA、3′-RACE和5′-RACE為模板，擴增1基因的3個目的片段。PCR體系為50 μL，擴增程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃徹底延伸5 min。將目的片段連接至Blunt載體后轉化大腸桿菌T1感受態細胞，挑菌送測。利用DNAMAN軟件拼接后獲得全長cDNA序列，使用NCBI ORF Finder 在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測開放閱讀框并設計引物，驗證基因克隆的正確性。依據驗證成功的1基因CDS序列，查找其上游啟動子序列。該啟動子序列信息來自鵝掌楸(廬山種源)NJFU-Lchi-2.0基因組測序結果(Chen et al.，2019)，利用同源克隆法設計驗證引物，引物序列見表1。使用改良CTAB法(馬明等，2007)提取采樣組織的DNA，以此為模板擴增出約2 000 bp的啟動子序列并測序確認。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.21基因的生物信息學分析 使用NCBI conserved domain在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預測LtAGO1蛋白的保守結構域。使用ExPASy中的Protparam工具(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析蛋白質理化性質，使用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和Phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分別預測蛋白質二、三級結構，使用SignalP 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白是否含信號肽，使用PSORT在線軟件(https://wolfpsort.hgc.jp/)預測蛋白亞細胞的定位情況。在NCBI數據庫BLASTx中查找同源序列，使用Clustal X軟件分析LtAGO1蛋白同源性和 MEGA 7軟件構建Neighbor-Joining系統進化樹。使用PlantCARE 數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對克隆得到的啟動子序列進行順式作用元件分析。

1.2.31基因的表達分析 使用植物總RNA提取試劑盒分別提取鵝掌楸屬不同發育時期的葉片及不同組織的總RNA，并反轉錄合成cDNA的第一鏈，稀釋20倍后作為RT-qPCR模板。通過Oligo 7軟件設計熒光定量PCR引物，參考本實驗室鵝掌楸內參基因97(Tu et al.，2019)進行實時定量qPCR反應，引物序列見表1。反應體系為20 μL，分別為 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，上下游引物各0.4 μL(5 μmol·L)，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ0.4 μL，模板(100 ng)2 μL，RNAase-free ddH0 6.8 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環。試驗進行3次生物學重復，用2法(Livak et al.，2001)計算并分析基因的相對表達量。

1.2.4 構建載體及轉化、篩選 使用I和Ⅲ 酶分別酶切超表達載體PBI121質粒，經電泳跑膠確定目標產物后切膠， 并回收目的片段1。利用諾唯贊同源重組酶將帶酶切位點的PCR目的產物構建到酶切后的表達載體PBI121上，并轉入大腸桿菌中擴增， 獲得GUS表達載體PBI121-1-GUS。將經PCR、酶切及測序后鑒定正確的GUS表達載體質粒轉進農桿菌GV3101，并通過花序浸染法(Clough & Bent, 1998)轉染到野生型擬南芥中。將收種得到的T0代擬南芥種子播種在含有50 mg·L卡那霉素(Kanamycin)的1/2MS培養基上，篩選出具有抗卡那霉素的轉基因植株，利用啟動子測序引物對T1代擬南芥葉片的DNA進行PCR鑒定，以野生型植株為陰性對照。將符合預期結果的轉基因植株繼代篩選至T2代，用于GUS染色分析。

1.2.5 轉基因擬南芥植株表型觀察 轉基因株系和野生型擬南芥的種子先后經75%酒精、10%次氯酸鈉消毒和3次無菌水洗滌，之后播種在1/2MS培養基(pH=5.8)中，4 ℃春化2 d后，置于溫度為25 ℃、光周期為16 h光照/8 h黑暗、光照強度為5 000 lx的人工光照培養箱內。光照培養10 d后，測量擬南芥幼苗根長并記錄，5次重復。

1.2.6 轉基因擬南芥植株GUS組織化學染色 參照Solarbio 公司即用型GUS試劑盒說明書，分別選取在1/2MS培養基上生長4、6、9、12、16、20、25 d等不同時期及不同組織的轉1∷GUS的T2代擬南芥轉化株，按Jefferson(1987)的方法放到染色液中染色，37 ℃過夜孵育，75%酒精洗滌脫色5～6次后在體視顯微鏡下拍照。以GV3101空菌株浸染野生型擬南芥為陰性對照，35S∷GUS空載體浸染的擬南芥為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 LtAGO1基因全長cDNA的獲得

從北美鵝掌楸葉芽中獲得1中間片段長度為3 592 bp，利用RACE克隆獲得長度為440 bp和636 bp的5′端和3′端序列(圖2：A)，經拼接得到4 258 bp的cDNA全長序列。經ORF finder預測到5′ -UTR序列長度為78 bp，3′-UTR序列長度為880 bp，含13個polyA，ORF長度為3 300 bp，共編碼1 100個氨基酸。對ORF兩端設計引物擴增并測序驗證，結果顯示開放閱讀框序列長度大小與拼接序列一致，且無變異位點。蛋白結構分析得到該蛋白包含2個保守結構域，即Gly-rich-AGO1和Piwi。其中，Piwi結構域位于AGO1的C端，含有RNA 5′ 端結合位點和對mRNA有切割作用的活性位點(圖2：B)。以上結果驗證了所得cDNA序列的正確性，故將該基因命名為1。

圖 1 北美鵝掌楸和鵝掌楸的葉片和采樣部位Fig. 1 Leaves and sampling parts of Liriodendron chinense and L. tulipifera

A. a. 5′-RACE; b. 3′-RACE; c. 中間片段; d. 開放閱讀框; M1. Maker 2 000; M2. Maker 5 000; B. 保守結構域; C. 二級結構; D. 三級結構。A. a. 5′-RACE segment; b. 3′-RACE segment; c. Middle segment; d. Open reading frame(ORF) fragment; M1. Maker 2 000; M2 . Maker 5 000; B. Conserved domain; C. Secondary structure; D. Tertiary structure.圖 2 LtAGO1的克隆與結構分析Fig. 2 Cloning and structure analysis of LtAGO1 proteins

2.2 LtAGO1蛋白二級、三級結構和功能預測

圖2：C顯示，該蛋白由延伸鏈(extended strand)、α螺旋(h)、β轉角(t)和無規則卷曲(c)組成，其中無規則卷曲最多，占52.14%；此外，占氨基酸序列較多的是α螺旋(28.57%)和延伸鏈(13.83%)，β轉角最少(5.46%)。為深入了解蛋白結構，對LtAGO1預測并模擬蛋白三級結構(圖2：D)，結果顯示LtAGO1蛋白結構與AGO2蛋白最為相似，且置信度達100%。利用SignalP 5.0 Server 預測得到D值(信號肽均值與Y-max的平均值)較小(0.001 6)，推測該基因編碼的蛋白不含信號肽，為非分泌蛋白。對LtAGO1蛋白亞細胞定位的預測結果顯示，LtAGO1蛋白位于微體、細胞核、細胞質和細胞膜的分值分別為0.3、0.3、0.1和0，說明該蛋白可能定位于細胞核和微體中。

2.3 LtAGO1蛋白同源性比對及進化樹分析

將1編碼的氨基酸序列與NCBI數據庫中的序列比對發現，與沉水樟()、海棗()和小果野蕉()等的AGO1蛋白同源，且相似性較高(72.97%～76.33%)。經多序列比對發現LtAGO1蛋白與其他物種AGO1同源蛋白總體表現為C端較保守，N端保守性較差，且同源序列中均存在一個保守的Piwi結構域(圖3)。LtAGO1蛋白與不同種類植物AGO1蛋白序列一致性較高，說明該基因在植物進化過程中比較保守。通過與其他物種AGO1同源蛋白比對及構建的進化樹發現，北美鵝掌楸與樟科的沉水樟AGO1蛋白(RWR84608.1)聚在一起，親緣關系最近，與海棗(XP_008812792.1)、小果野蕉(XP_009386429.1)的親緣關系較近，與麻風樹(XP_012079244.1)和橡膠樹(XP_021670505.1)的親緣關系相對較遠(圖4)。

圖 3 LtAGO1蛋白同源性分析Fig. 3 Homology analysis of LtAGO1 protein

圖 4 LtAGO1蛋白系統進化分析Fig. 4 Homology and phylogenetic analysis of LtAGO1 protein

2.4 LtAGO1的時空表達差異分析

利用RT-qPCR檢測分析1在北美鵝掌楸8個組織中的表達量，結果如圖5：A所示，1在北美鵝掌楸所有的組織中均有表達，但表達量存在一定差異。其中，雄蕊和花芽的相對表達量較高，顯著高于其他組織，其次是花瓣，在花萼、花芽、葉片、葉芽和雌蕊中的表達量較低，1在北美鵝掌楸不同組織間的相對表達量為雄蕊>花芽>花瓣>花萼>葉片>雌蕊>葉芽>莖。該基因在花器官中特異表達，推測1可能在花器官發育過程中發揮著重要作用。

對葉基部、葉中部和葉緣進行RT-qPCR檢測，結果如圖5：B所示，在北美鵝掌楸中，1的相對表達量為葉緣>葉中部>葉基部；在鵝掌楸中，1的相對表達量為葉緣>葉基部>葉中部。由此可見，1主要在鵝掌楸和北美鵝掌楸葉片中的葉緣部位表達，且該基因在鵝掌楸葉片所有部位的相對表達量均高于北美鵝掌楸的相對表達量，尤其是鵝掌楸葉中部和葉基部的表達量是北美鵝掌楸的4.5～7.5倍，說明1在兩個種間葉片的空間分布上存在差異。

A. AGO1在北美鵝掌楸不同組織中的表達; B. AGO1在鵝掌楸屬不同組織中的表達; C. AGO1在北美鵝掌楸不同發育時期葉中的表達; D. AGO1在北美鵝掌楸葉不同部位中的表達。 表示差異極顯著(P<0.01)。A. AGO1 gene expressions of different tissues in L.tulipifera; B. AGO1 gene expressions of different tissues in Liriodendron; C. AGO1 gene expressions of different times of leaf in L.tulipifera; D. AGO1 gene expressions of different parts of leaf in L.tulipifera. means extremely significant differences(P<0.01).圖 5 AGO1基因在鵝掌楸屬不同組織中的表達模式Fig. 5 Expression patterns of AGO1 gene in different tissues of Liriodendron L.

對葉芽萌動期(時期1和時期2)、幼葉期(時期3)、成熟期(時期4至時期6)和衰老期(時期7)的葉片進行RT-qPCR檢測，結果如圖5：C所示：在葉芽萌動期至展葉期，1的表達量隨著葉芽的逐漸膨大而降低；在生長期，1的表達量與葉片大小呈負相關的關系，且在葉面積最大時達到最低值；當葉片進入衰老期，1的表達量比生長后期的表達量高，但比展葉期的低，且在葉原基形成的過程中，1的表達量遠高于葉成熟期的表達量。1在北美鵝掌楸葉片不同發育階段的相對表達量為葉芽萌動期>幼葉期>衰老期>成熟期，說明1在北美鵝掌楸分生組織生長較旺盛的時期表達。

對葉緣凸出部分(即葉尖，a, c和e)和凹陷部分(b和d)進行RT-qPCR檢測，結果如圖5：D所示，1在葉柄的相對表達量遠高于其他部位的表達量，相較而言，該基因在凹陷部位(b)的相對表達量高于凸出部位(c)，此外在其他部位基本不表達。因此，1在北美鵝掌楸葉片中的相對表達量為葉柄>葉凹陷>葉尖，說明1可能在葉柄的形成中起著重要作用。

2.5 LtAGO1蛋白共表達網絡

LtAGO1蛋白共表達網絡顯示(圖6)，1不僅與逆境應激響應基因、6 和3發生互作， 還與介導miRNA葉極性分化的1和1基因發生互作。 據報道，長度20～24 nt的小RNA(sRNA)能響應多種逆境脅迫(Chen et al.，2002；Zhang et al.，2008)，其sRNA的產生主要依賴、和基因家族所編碼的蛋白(Saito & Siomi , 2010 )。3與6協同作用能將單鏈RNA轉錄為dsRNA，誘導產生轉錄后基因沉默，降低病原菌的危害(Yoshikawa et al.，2013)。此外，6還與7、3和4共同調控trans-acting siRNA通路，其下游靶基因是參與葉形遠軸化的生長素響應因子(Peragine et al.，2004)。在煙草中，1的沉默導致植株矮小，葉片畸形。1通過介導miRNA來調節-Ⅲ 基因的表達，從而維持葉的平展發育(Yu et al.，2005)。1最早被發現和花器官發育相關(Chen et al.，2002)，擬南芥中絕大部分miRNA均受到1的調控(Yu et al.，2006)，和1-3一樣，1既能調控發育，又能參與ABA信號通路的調控(Park et al.，2002)。1與這些基因相互作用，協同發揮抗逆及發育的調控作用。

圖 6 LtAGO1蛋白共表達網絡Fig. 6 Co-expression network of LtAGO1 protein

2.6 LtAGO1啟動子克隆、表達載體的構建及鑒定

以北美鵝掌楸基因組DNA為模板進行RT-PCR擴增，將擴增產物進行測序，得到2 001 bp的1啟動子序列(圖7：A)。將啟動子擴增產物1連接到植物表達載體PBI121上(圖7：D)，連接產物經菌落PCR發現，大腸桿菌PCR擴增產物大小為2 000 bp左右，與陽性對照條帶大小相一致(圖7：B)，檢測后的測序結果與數據庫序列一致。經雙酶切電泳后的結果(圖7：C)顯示，重組的質粒被酶切成兩條條帶，一條大小為12 758 bp的條帶，另一條幾乎與1大小一致的序列條帶，說明1啟動子成功構建到PBI121表達載體中。

A. M. DNA marker DL5 000; ProAGO1. LtAGO1啟動子序列; B. 菌液PCR檢測; C. M1. DNA marker DL15 000; 1. Hind Ⅲ 單酶切; 2. Hind Ⅲ和XbarⅠ雙酶切; + . LtAGO1啟動子序列; D. PBI121-ProAGO1-GUS表達載體的構建。A. M. DNA marker DL5 000; ProAGO1. LtAGO1 promoter sequence; B. PCR detection of Escherichia coli; C. M1. DNA marker DL15 000; 1. Single-digestion products by Hind Ⅲ; 2. Double-digestion products by Hind Ⅲ and XbarⅠ; +. LtAGO1 promoter sequence; D. PBI121-ProAGO1-GUS vector construction.圖 7 LtAGO1啟動子的克隆及載體構建Fig. 7 Cloning and vector construction of LtAGO1 promoter

2.7 LtAGO1啟動子順式作用元件分析

利用PlantCARE軟件對1啟動子序列進行分析，結果如表2所示，1啟動子中含有RNA聚合酶Ⅱ起始轉錄所必需的CAAT-box、TATA-box元件和較多的光響應元件(如Box 4 、G-box、GT1-motif和 MYB等)，此外還包含與防御相關的響應元件(如防御與應激元件TC-rich repeats，茉莉酸甲酯響應調節元件CGTCA/TGACG-motif，水楊酸響應元件TCA-element，ABA響應元件MYC，冷脅迫相關元件as-1，厭氧誘導調控元件ARE)和生長調控相關元件(如分生組織表達調控元件CCGTCC-box、玉米醇溶蛋白代謝調控元件O-site)。

表 2 LtAGO1啟動子中的順式作用元件預測Table 2 The cis-acting elements in promoter sequence of LtAGO1

2.8 轉基因植株的檢測及表型觀察

經PCR檢測后，共獲得1∷GUS轉基因陽性植株11株(圖8：C)。收種并播下T2代轉基因植株，發現野生型的根長為(1.5±0.2)cm，轉基因的根長為(0.5±0.2)cm，且須根和主根一樣發達(圖8：D)，葉面積較野生型小，第二對真葉的頂端出現凹形缺刻和白化。30 d時，鑒別出兩種表型的株系，主要特征如下：植株矮小(圖8：F)，抽薹較晚，且出現不育的重瓣花，大部分蓮座葉表面積較野生型小(圖8：E)。其中，株系1有1片向中-側軸方向延伸生長的葉片，葉基部狹窄，葉形呈扇形，其他葉片表面積是野生型的一半，且呈葉基歪斜、葉柄彎曲、中-側軸向和基-頂軸向的不對稱發育。株系2的蓮座葉數量較野生型少2片，葉形缺刻程度較株系1更深，其中有1片葉的葉面積是其他葉片的5～10倍，葉基楔形，葉頂端凹陷呈心形，其他葉基歪斜，葉的主要生長方向由基部至頂端方向延伸生長，葉形態呈線形或條狀發育，葉柄較短。推測1啟動子從葉原基分化期就開始影響擬南芥的葉片在中-側軸及基-頂軸兩個方向上發生程度各異的極性分化，且隨著時間而加深變異的程度，最終使葉緣缺刻的表型得以維持。

A. 擬南芥葉片和花的表型; B. 擬南芥花不育的表型; C. M為DL 5 000 DNA分子標準量; +. LtAGO1啟動子序列; 1-11. 轉ProAGO1∷GUS擬南芥植株; - . 陰性對照; D. 擬南芥幼苗根的發育; E. 擬南芥蓮座葉的發育; F. 擬南芥花的發育。A. Leaf and flower phenotypes of A. thaliana ; B. Phenotype of floral sterility in A. thaliana; C. M. DNA marker DL 5 000; +. LtAGO1 promoter sequence; 1-11. Transgenic ProAGO1∷GUS in A. thaliana plants; - . Negative control; D. Root development of A. thaliana seedlings; E. Development of rosette leaf in A. thaliana ; F. Flower development in A. thaliana.圖 8 轉ProAGO1∷GUS擬南芥植株的PCR鑒定和表型觀察Fig. 8 PCR identification and phenotype of transgenic ProAGO1∷GUS Arabidopsis thaliana plants

2.9 LtAGO1啟動子活性分析

圖9顯示，由1啟動子控制的基因在植株發育過程中呈階段性表達。在萌發后的第4天和第6天，幼苗的GUS活性不表達(圖9：B1-B2)；在葉芽分化期(第9天至第25天)，1啟動子驅動GUS在葉芽頂端穩定表達，且在新分化的葉柄上啟動活性最強(圖9：B3-B7)。在生殖生長階段，其在主葉脈、葉緣鋸齒尖、果柄、花萼及雌蕊等部位表達，說明1在成熟的花、果莢、葉和莖的維管束中均表達(圖9：B8-B11)。因此，1啟動子的GUS活性強度為葉頂芽>花器官>維管束，屬于分生組織特異性啟動子。

A1-A9. 生長4、6、9、12、16、45 d的野生型植株; B1-B11. 生長4、6、9、12、16、20、25、45 d的轉ProAGO1∷GUS植株; C1-C9. 生長4、6、9、12、16、45 d的轉35S∷GUS植株。A1-A9. Wild A. thaliana seedlings of 4, 6, 9, 12, 16, 45-day-old; B1-B11. Transgenic ProAGO1∷GUS A. thaliana seedlings of 4, 6, 9, 12, 16, 20, 25, 45-day-old; C1-C9. Transgenic 35S∷GUS A. thaliana seedlings of 4, 6, 9, 12, 16, 45-day-old .圖 9 轉基因擬南芥組織GUS染色分析Fig. 9 Promoter-GUS assay of transgenic Arabidopsis thaliana in different parts

3 討論與結論

本研究克隆得到北美鵝掌楸1基因，通過生物信息學分析發現1和其他物種1的相似性很高，亞細胞定位于細胞核，這些信息與李紅英等(2018)在胡楊中的研究結果相吻合。組織特異性分析發現，1在葉原基分化期的表達量明顯高于成熟期和衰老期，且在幼葉的葉緣部位高含量表達，而在成熟葉中只在葉柄表達；1在玉米的幼葉及吐絲期的雌穗中表達量最高(徐東東，2014)，且在玉米新生葉中的表達量高于老葉(許鑫等，2014)。在北美鵝掌楸生殖生長過程中，1在雄蕊的表達量最高，其次是花芽，與龍眼(楊曼曼，2015)、蘋果(鹿游等，2013)的組織特異性研究結果類似，說明1在幼苗期參與葉原基的分化，而在生殖期普遍存在于細胞分裂生長較旺盛的花器官中。

啟動子是基因轉錄的調控中心，本研究預測到1基因啟動子上含有多個光響應、激素誘導、分生組織表達及多個非生物脅迫響應元件，進一步研究發現1能成功啟動GUS表達，其表達具有時空特異性：GUS在幼苗期的頂端分生組織表達，隨著頂端逐漸分化出新的葉片，該啟動子僅在新分化的葉柄處表達，后期在成熟的花、果莢、葉和莖的維管束中表達。Vaucheret等(2006)對轉1∷GUS的擬南芥分析發現，1在整個發育過程中表達，尤其在分生組織和維管束組織中的表達豐度最高。這說明1的表達不僅在頂端分生組織， 也在側生分生組織中的其他部位，但目前有關相應的表達機理還未見報道。

葉極性分化是原基細胞感受極性分化信號并作出相應反應的過程，而沿著近-遠軸、基-頂軸和中-側軸3個極性方向分化的過程又決定了葉形態的建成過程(Du et al.，2018)。本研究通過轉1∷GUS表達載體得到葉柄彎曲、葉中-側軸向和基-頂軸向極性喪失的擬南芥株系。在番茄中下調1的表達，會導致遠軸面出現與近軸面相同的毛狀體，且葉片小葉柄出現發育缺陷 (Wang et al.，2015)。此外，1啟動子的表達能促使擬南芥在發育過程中發生異位分生組織的活動，致使擬南芥葉基楔形、葉頂端缺刻呈心形。在對1功能缺失突變體的其他研究中，發現1的缺失會促使植物體的葉卷曲、植株矮化及結實率下降(Wu et al.，2009； Liu & Nonomura, 2016)，Kidner等(2005)對過表達1和雙突變的擬南芥分析發現，1是通過激活基因調節干細胞功能從而影響葉的極性效應。由此可知，1基因的缺失和過表達都會不同程度地影響葉極性的喪失，推測1可能是通過兩種不同的調控途徑參與到葉的形態建成中。目前， 對這一分子機制的研究普遍認為，葉原基和葉發育的過程皆需要處于激活狀態，且家族其他基因處于沉默狀態。Yang等(2006)發現1是通過正向調控和抑制的表達而決定葉片和花瓣近-遠軸的發生。Arunika等(2004)研究認為，葉片的形態建成(如葉中孔洞的形成、葉緣的裂痕)均與關鍵部位的細胞發生程序性死亡(PCD)相關，而Zhang等(2009)的研究也證實正向卷曲葉片的發生是因為背面葉肉細胞的程序性死亡。那么，1是否也是通過調控細胞的分化方向和速度而影響葉形的多樣性，且該基因如何響應葉原基分化的起始信號，其具體調控機制有待進一步研究。在生殖發育方面，該研究的表達株系抽薹較晚，花大而重瓣且不育，這一現象與Li等(2019)的研究結果相吻合。究其原因，可能是花器官由頂端分生組織分化形成，1在頂端分生組織中持續而穩定的表達，從而能參與到葉與花器官的形態建成中。但是，兩者之間有無相關的基因共同被1所調控，還有待于進一步研究。

本研究以北美鵝掌楸為研究對象，首次分析了1在不同組織部位的時空表達譜，明確了其啟動子在擬南芥分生組織中的表達模式，初步探索了1對北美鵝掌楸葉形發育的調控作用。下一步我們將會構造1超表達載體轉化楊樹，并將1與葉形發育的關鍵成員家族基因進行蛋白互作研究。本研究結果將為進一步分析1基因在木本植物生長發育過程中的作用提供理論參考，也為促進觀葉樹種的葉形態遺傳改良研究提供良好的實踐意義。