微滴式數字PCR定量檢測雞毒支原體方法的建立

謝志勤，謝芝勛，張艷芳，范 晴，謝麗基，萬麗軍，羅思思，李 孟，張民秀，曾婷婷，黃嬌玲，王 盛，李 丹，韋 悠，李小鳳，任紅玉，阮志華

（廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西南寧 530001）

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）主要侵害雞，引起不同日齡、不同品種雞發生慢性呼吸道病，輕者咳嗽、流鼻液，重者竇部腫脹、呼吸困難。MG 對雛雞危害極大，除可導致呼吸道疾病外，還可引起雛雞生長遲緩，發育不全，淘汰率非常高。MG 可引起蛋雞產蛋減少[1-2]。種雞感染MG 后可在體內長期帶有病原。MG 一旦感染雞群就很難被徹底清除[3-4]，可在雞群中長期存在并可擴散至其他雞群，極易繼發或并發大腸桿菌、傳染性支氣管炎病毒等病原體感染，導致雞群死亡，給養禽業帶來重大經濟損失[5-6]。

雞MG 感染很普遍，正呈世界性流行態勢。MG 引發的癥狀與其他病原如H9N2 亞型禽流感病毒、雞新城疫病毒引起的癥狀很相似，臨床上很難區分，需要通過實驗室方法進行診斷。常用的實驗室鑒別MG 方法有病原分離鑒定[7]、PCR 方法[8]、熒光定量PCR 方法[9-10]、LAMP 方法[11]等。但這些方法都或多或少存在不足，不能滿足低拷貝數MG，如MG 感染早期的定量檢測需求。例如：病原分離鑒定方法雖準確，但操作繁瑣，費時費力；普通PCR 方法檢測不夠靈敏，且需要電泳；熒光定量PCR 方法能進行相對定量檢測，檢測MG 的靈敏度達100 拷貝/μL，但每次檢測結果會因熒光定量PCR 內參的穩定性及擴增Ct 值的變化而變化；LAMP 方法雖敏感，但操作中易受污染，假陽性較多。目前缺乏絕對定量檢測MG 的方法，需要建立一種更敏感的絕對定量檢測方法，特別是針低拷貝數樣品，如MG 早期感染的絕對定量檢測，這對準確診斷防控MG 感染有重要意義。

微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近幾年發展應用起來的一種新技術，其將反應液通過油包水方式、分為數萬個獨立的納米反應微滴，根據每個反應微滴信號統計陽性拷貝數。目前該技術在很多領域包括動物疫病病原檢測方面已有成功應用，證明其在動物疫病病原檢測方面敏感性好，能實現絕對定量檢測[12-13]。目前還沒有建立ddPCR 檢測MG 方法的報道。本研究以MGmgpc基因為靶基因，建立ddPCR 定量檢測MG 方法，旨在為更加準確定量檢測MG 提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 病原及臨床樣品

MG 株（MG S6、MG K2221、MG A5969）、雞滑液囊支原體（MS）K1415 株、禽衣阿華支原體（MI）K-1805 株、禽腦脊髓炎病毒（AEV）Van 株，由美國康涅狄格洲州立大學Khan Mazhar I.教授惠贈；禽偏肺炎病毒（APV）MN-10 株，由美國濱夕法尼亞州立大學Lu Huagang 教授惠贈；雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）Mass 41 株、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）BJ 株、雞新城疫病毒（NDV）LaSota 株、禽呼腸孤病毒（ARV）S1133株、H9N2 亞型禽流感病毒（H9N2 AIV）066C 株，由廣西壯族自治區獸醫研究所實驗室鑒定保存；雞白痢沙門氏菌（SP）C79-13 株和雞大腸桿菌（E.coli）O2 株，購自國家獸醫微生物菌株保藏管理中心；60 份病雞喉拭子、氣囊拭子及肺樣品，于2021 年1—12 月從廣西7 個雞場采集并保存于-80 ℃。

1.2 主要試劑及儀器

Supermix for Probe ddPCR（No dUTP，貨號1863024）、Droplet generation oil for Probes ddPCR（貨號1863005）、Droplet Reader Oil（貨號1863004）、DG8 Cartridges（貨號1863008）、DG8 Gaskets（貨號1863009）、Pierceable Foil Heat Seal（貨號1814040），購自美國Bio-rad 公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit（貨號N20527），購自北京全式金生物技術有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit，購自天根生化科技（北京）有限公司；RT-PCR 擴增試劑盒、Premix ExTaq試劑盒、100 bp DNA Ladder、pMD18-T 載體、大腸桿菌DH5α、T4 連接試劑盒、凝膠回收試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；微滴生成儀（QX200 Droplet generator）、熱封儀（PX1）、微滴數字讀取儀（QX200 Droplet Reader）、梯度PCR 擴增儀（T-100），購自美國Bio-rad 公司；熒光PCR 儀（quantStudio 5）、分光光度計（Nanodrop 2000），購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 引物設計與合成

根據已發表的MGmgpc基因（No.JX869132.1）序列，利用在線https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/軟件，設計ddPCR 特異性引物和探針，并在線進行BLAST 分析。在探針序列5'端添加FAM 熒光基團，3'端添加BHQ1 淬滅基團。引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并經HPLC 純化。所設計的引物和探針序列見表1。

表1 所用的引物和探針序列

1.4 病原核酸提取

按EasyPure Viral DNA/RNA Kit 說明書提取1.1 中的病毒株DNA/RNA，按TIANamp Bacteria DNA Kit 說明書提取MG S6、MG K2221、MG A5969 以及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli等菌株的DNA，提取的DNA/RNA 直接用于擴增或于-80 ℃保存備用。

1.5 重組質粒標準模板構建與鑒定

提取MG S6 總DNA 后作為模板，用引物MG F/MG R 擴增后，克隆至與pMD18-T 載體構建重組質粒pMD18-MG，經PCR 鑒定后由寶生物工程（大連）有限公司測序，測序正確的質粒DNA用分光光度儀測定D260nm/D280nm值，并按公式計算拷貝數?？截悢?（濃度×阿伏加德羅常數）/（1 個堿基對的平均相對分子質量×總長度）。

1.6 ddPCR 反應體系建立及條件優化

20 μL 反應體系：2×Supermix 10 μL，5～40 μmol/μL 的 MG F/MG R 各 1 μL，2.5～40.0 μmol/μL MG Pro 1 μL，標準質粒模板2 μL，加滅菌 ddH2O 補足至20 μL。微滴生成：在DG8 Cartridges 的第二排孔分別加入上述反應液20 μL，第三排孔每孔加入droplet generation oil 70 μL，蓋上DG8 Gaskets，置微滴生成儀上自動生成微滴于第一排孔。封膜：吸取生成的微滴至96 孔板內，加鋁膜Pierceable Foil Heat Seal 置PX1熱封儀上，程序設置為180 ℃ 10 s 進行封膜。PCR擴增：封膜的96 孔板放入PCR 擴增儀上進行擴增。設計反應程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火溫度設置50～60 ℃ 1 min（2 ℃/s），共進行40 個循環；98 ℃ 10 min，4 ℃結束。數據讀取及分析：反應結束后，將96 孔板置QX200 Droplet Reader上讀取信號并進行數據分析。

1.7 ddPCR 特異性測定

提取NDV、H9N2 AIV、IBV、ARV、AEV、APV 的總RNA 并反轉錄為cDNA，提取MG S6、MG K2221、MG A5969 以及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli的DNA 分別作為模板，按照優化的ddPCR 方法進行檢測，評估該方法的特異性。

1.8 ddPCR 靈敏度測定

測定重組質粒標準品濃度并進行10 倍倍比稀釋（10-4～10-11）后作為模板，按照優化的ddPCR方法檢測，評估該ddPCR 方法的敏感性。同時采用熒光定量PCR 方法，用同樣的引物探針，對相同質粒標準品濃度進行平行檢測，比較兩種方法的靈敏度。同時取5 個稀釋度進行4 次平行試驗，分析ddPCR 檢測的線性區間。

1.9 ddPCR 重復性測定

取10-5～10-73 個連續稀釋度的質粒標準品為模板進行3 次ddPCR 擴增反應，通過計算3 次反應結果的變異系數來驗證ddPCR 的重復性。

科學技術是經濟發展的第一生產力，也是推動實現全面持續發展的必然要求，人才是發展科學技術不可或缺的部分，因此必須注重對人才的培養，尤其是對企業內部高層管理人員素質的培養，通過這種方法使得企業能夠在面對各種情況時更好地決策，更好地發揮產業園區的內部優勢，為企業的長遠發展做出貢獻，從而促進當地的產業發展，推動經濟向著更加合理、穩定、高效的方向發展。

1.10 臨床樣品檢測

取約5 g 肺樣品，按質量比1:8 加入無血清的DMEM 培養液研磨，在喉及氣囊拭子中，分別加入2 mL 無血清的DMEM 培養液混勻，-70 ℃反復凍融3 次，4 000 r/min 離心5 min，取上清，14 000 r/min 離心10 min，棄上清，按TIANamp Bacteria DNA Kit 說明書步驟提取沉淀中的總DNA。用建立的ddPCR 方法進行檢測，同時用文獻[10]中的熒光定量PCR 方法進行檢測，比較兩種檢測方法檢測效果的符合率。

2 結果與分析

2.1 重組質粒標準品鑒定

挑取重組質粒pMD18-MG 進行PCR 鑒定，結果擴增出大小約198 bp 的明亮條帶；送寶生物工程（大連）有限公司進行測序，用MegAlign 軟件將測定的序列與MGmgpc基因（No.JX869132.1）序列進行Clustal W Method 分析，結果發現測定的序列與MGmgpc基因100%同源，序列正確；用分光光度儀測定的重組質粒pMD18-MG 標準品D260nm/D280nm值為1.90，按公式計算的拷貝濃度為1.35×1010拷貝/μL。

2.2 ddPCR 反應條件優化

ddPCR 反應中，對不同引物濃度和探針濃度進行優化，當MG F/MG R 引物濃度和MG Pro 濃度分別為20 和10 μmol/μL 時，即MG F 和MG R終濃度為1 μmol/μL，MG Pro 為0.5 μmol/μL 時，陽性微滴信號高，陽性微滴與陰性微滴之間的熒光信號區分明顯，此時的引物、探針濃度為最佳反應濃度。用最佳引物濃度和探針濃度，退火溫度設50、51、52、54、55、56、58、60 ℃共8 個不同梯度，對相同模板濃度進行ddPCR 反應擴增，結果退火溫度為55 ℃時，陽性微滴信號（顯示為藍色）和陰性微滴信號（顯示為黑色）之間的熒光信號區分明顯，擴增獲得的陽性微滴數最高，此時的退火溫度55 ℃即為最佳退火溫度。

2.3 優化后的ddPCR 反應體系及程序

20 μL 反應體系：2×Supermix for probe（No dUTP）10 μL，20 μmol/μLMG F/MG R 引物各1 μL，10 μmol/μLMG Pro 1 μL，DNA/RNA 模板2 μL，用 ddH2O 補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，設置退火溫度55 ℃1 min（2 ℃/s），40 個循環；98 ℃ 10 min，4 ℃結束。

2.4 ddPCR 反應特異性測試

將NDV、H9N2 AIV、IBV、ARV、AEV、APV 的總RNA 并反轉錄為cDNA，然后與MG S6、MG K2221、MG A5969 以 及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli的DNA 一起分別加入已優化好的ddPCR 反應體系中進行特異性檢測。結果顯示，每孔擴增總微滴的生成量均達1 萬以上，且較均衡，說明微滴擴增反應成立。出現陽性微滴的病原有MG S6、K2221、A5969，其他病原無陽性微滴出現，與MG 株也沒有出現交叉反應（圖1），表明該方法的特異性強。

2.5 ddPCR 靈敏度測定

取10-4～10-11稀釋的pMD18-MG 重組質粒標準品各2 μL 作為模板，分別按照優化的ddPCR 和熒光定量PCR 進行檢測。結果顯示，ddPCR 對質粒標準品的最低檢測限為3.9 拷貝/μL（10-8稀釋，圖2-A），而熒光定量PCR 只檢測到10-7稀釋的質粒標準品（40.6 拷貝/μL，圖2-B），10-8稀釋的質粒標準品沒有被檢出。用5 個連續稀釋的MG重組質粒標準品及檢測陽性拷貝數的對數值，繪制ddPCR 絕對定量曲線，結果為線性。線性方程為y=-1.007x+8.63，斜率為-1.007，R2為0.999（圖3）。

2.6 ddPCR 重復性測定

表2 ddPCR 重復試驗結果

2.7 臨床樣品檢測

對60 份病雞喉拭子、氣囊拭子及肺樣品進行檢測，ddPCR 檢測結果為MG 陽性9 份，分別為喉拭子樣品2 份、氣囊拭子樣品6 份及肺樣品1 份，樣品中檢出的MG 拷貝數濃度為12.2～972.0 拷貝/μL，陽性檢出率為15.0%（9/60）；熒光定量PCR 檢測結果為MG 陽性8 份，分別為喉拭子樣品2 份及氣囊拭子樣品6 份，陽性檢出率為13.3%（8/60）。從檢測結果看出，ddPCR 檢出率高于熒光定量PCR。部分樣品檢測結果見圖4 和表3。

表3 60 份臨床樣品檢測結果 單位：份

3 討論

雞MG 感染較為普遍，感染率高，難以清除。準確診斷是防控MG 感染的重要手段。目前在眾多的檢測診斷方法中，沒有一種方法能及時準確對MG 早期感染進行絕對定量檢測。本ddPCR 檢測方法的建立，實現了對低拷貝數MG，如MG 早期感染的準確絕對定量檢測。經特異性檢測驗證，本方法只檢出MG，沒有檢出其他常見禽病病原，也沒有發生交叉反應，說明本方法具有很好的特異性。

dPCR 方法雖然是在熒光定量PCR 的基礎上發展而來的，但這兩種檢測方法有所不同。ddPCR方法是通過直接計算反應的微滴數來實現對拷貝數的絕對定量檢測，受擴增效率影響較小[11]，可直接讀取結果且結果直觀準確；而熒光定量PCR 需要通過標準曲線及擴增的Ct 值來計算標準品的拷貝數，常因檢測的內參穩定性及Ct 值變化而影響結果。在敏感性檢測方面，已有報道認為ddPCR方法比熒光定量PCR 方法敏感，如劉洋等[14]建立的ddPCR 檢測方法比熒光定量PCR 方法靈敏度高10 倍。本研究建立的方法經靈敏度檢測，證明檢測限為3.9 拷貝/μL 的MG 重組質粒標準品模板，而熒光定量PCR 方法只檢測到40.6 拷貝/μL。這一結果進一步證明了ddPCR 檢測方法比熒光定量PCR 方法靈敏度高10 倍。由此表明，本研究建立的方法靈敏度，可實現個位拷貝數的絕對定量檢測，這將有助于對低拷貝數MG 的定量檢測。

用本研究建立的方法，對采集的臨床樣品進行檢測，采用ddPCR 方法檢出MG 陽性9 份，陽性檢出率為15%，熒光定量PCR 方法檢出MG 陽性8 份，拷貝數濃度為12.2 拷貝/μL 的樣品沒有檢出，陽性檢出率為13%。從檢測樣品的結果分析，ddPCR 方法的陽性檢出率高于熒光定量PCR 方法，而且ddPCR 方法可以直接顯示檢測出的拷貝數，結果直觀準確，實現了對低拷貝數MG 或需要絕對定量樣品的檢測，為定量檢測MG 提供了更加準確的方法。

目前ddPCR 技術在各領域已得到廣泛應用，在動物疫病檢測方面也發揮了重要作用[15-16]。目前制約國內ddPCR 技術廣泛應用的主要問題是儀器設備需要進口，試劑昂貴，且操作步驟復雜，要求高。相信不久的將來，會實現儀器及試劑的國產化，這樣ddPCR 技術將隨著檢測成本的大幅降低而得到更廣泛應用。