早發冠心病患者載脂蛋白E基因多態性分析及其與冠狀動脈病變嚴重程度關系研究

許 璐，白春英，陳士萍，韓旭晨

(1.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學院附屬醫院心血管內科，內蒙古 赤峰 024000；3.赤峰學院內蒙古人類遺傳病研究重點實驗室，內蒙古 赤峰 024000)

早發冠心病(Premature coronary artery disease，PCAD)是一種特殊的冠心病類型，指男性在55歲前、女性在65歲前發病。研究[1]顯示，冠心病雖更易出現在老年人中，但目前PCAD發病率呈逐年上升趨勢，冠心病發病年齡也有提早的趨勢。PCAD是由各種原因引起冠狀動脈粥樣硬化，當血管管腔狹窄達到一定程度后引起心臟供血不足，心肌缺血、缺氧。相關研究[2]顯示，血脂異常與PCAD的發生有關。高密度脂蛋白降低或低密度脂蛋白升高可影響脂質轉運及其抗動脈粥樣硬化作用，可增加PCAD發生的危險性。有報道[3]指出，人類載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)基因與冠心病的發生存在密切關聯。ApoE基因可作為脂蛋白結構和功能蛋白，對血脂代謝起到主要作用[4]?；诖?，本研究探究PCAD患者ApoE基因多態性并分析其與冠狀動脈病變嚴重程度的關系，為該疾病的臨床評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2020年1月至2021年4月于我院心血管內科就診的冠心病患者279例為研究對象。根據發病年齡將其分為早發組(男性發病年齡≤55歲或女性發病年齡≤65歲，91例)和遲發組(男性發病年齡>55歲或女性發病年齡>65歲，188例)。兩組患者除年齡外，病程、體重指數等比較差異無統計學意義(均P>0.05)，見表1。病例納入標準：符合冠心病診斷標準[5]；臨床資料完整。排除標準：合并先天性心臟病、心肌病或充血性心力衰竭；合并嚴重肝、腎功能不全；合并惡性腫瘤；合并嚴重急性感染性疾??；合并結締組織疾病。本研究經醫院倫理委員會審核批準，且患者均已簽署知情同意書。

表1 早發組與遲發組患者一般資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 ApoE基因多態性分析：采集患者空腹靜脈血3 ml于含EDTA的抗凝劑采血管中，應用Eppendorf公司Centrifuge 5804R型高速離心機以1500 r/min離心5 min，去除上清液后將剩余物加入至0.2%氯化鈉溶液10 ml中混勻，在室溫下以2500 r/min離心5 min，分離底層白細胞。應用凱普生物公司的DNA提取試劑盒提取基因組DNA后，應用Thermo公司ABI7500型實時熒光定量PCR儀對樣本中DNA進行擴增處理，引物序列(正向5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCAAGGA-3’；反向5’-AGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’)由上海生工生物工程有限公司合成，擴增條件：37 ℃條件下尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)處理10 min，95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個循環。取10 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(0.2%溴酚藍、30%甘油)處理，采用豎式電泳槽電泳，在50 mV恒壓下電泳1～1.5 h，至溴酚藍接近玻板底部2 cm時終止電泳。將電泳后的PAGE凝膠置于0.5 μg/ml溴乙錠中染色10 min，經特異性限制內切酶消化后得到6種基因型(E2/E2、E2/E3、E3/E3、E2/E4、E3/E4、E4/E4)，在Beckman公司Du-640型紫外分光光度儀下觀察結果。

1.2.2 冠狀動脈病變程度評估：參考文獻[6]以Gensini積分評估冠狀動脈病變并對早發組患者進行分組。Gensini積分<7分者納入輕度組(39例)，7～14分者納入中度組(29例)，>14分者納入重度組(23例)。

1.3 觀察指標 ①比較早發組及遲發組的ApoE基因多態性，分析其與PCAD發生的關系；②比較輕度組、中度組、重度組患者的ApoE基因多態性，分析其對PCAD患者冠狀動脈病變嚴重程度的評估價值。

2 結 果

2.1 早發組與遲發組患者ApoE基因多態性分析 見表2。早發組ApoE基因E3/E3型檢出率高于遲發組(P<0.05)。兩組ApoE基因E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E4及E4/E4檢出率比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

表2 早發組與遲發組患者ApoE基因多態性分析[例(%)]

2.2 ApoE基因多態性與PCAD發生關系的Logistic分析 見表3。Logistic回歸分析顯示，ApoE基因E3/E3型是影響PCAD發生的危險因素(P<0.05)。

表3 ApoE基因多態性與PCAD發生關系的Logistic回歸分析

2.3 不同冠狀動脈病變嚴重程度患者ApoE基因多態性分析 見表4。PCAD患者ApoE基因E3/E4型檢出率隨冠狀動脈病變嚴重程度的加重而升高(P<0.05)。

表4 不同冠狀動脈病變嚴重程度患者ApoE基因多態性分析

2.4 ApoE基因多態性對PCAD患者冠狀動脈病變嚴重程度的評估價值 見表5。ROC曲線分析顯示，ApoE基因E2/E3、E3/E3和E3/E4型對PCAD患者冠狀動脈病變嚴重程度具有一定的評估價值，且各基因型聯合評估的曲線下面積(AUC)更高(均P<0.05)。

表5 ApoE基因多態性對PCAD患者冠狀動脈病變嚴重程度的評估價值

3 討 論

近年來，冠心病的發病日益年輕化，患者在患病后易喪失勞動力，造成了巨大的社會經濟損失[7]。臨床資料[8]顯示，PCAD患者多存在脂質代謝紊亂。研究[9]發現，PCAD患者與遲發性冠心病的高密度脂蛋白及甘油三酯水平均存在差異，表明早發性及遲發性冠心病的血脂代謝存在差異。冠心病是一種多種內在遺傳因子和外在環境相互作用導致的疾病。

相關報道[10]指出，ApoE基因可通過誘發血脂代謝異常而導致冠心病的發生。ApoE是一種多態性蛋白，主要分布于乳糜微粒、低密度脂蛋白等表面，通過與低密度脂蛋白受體結合調節體內的血脂水平，從而影響冠狀動脈粥樣硬化程度及冠心病的發病率[11]。ApoE基因位于19號染色體長臂，屬于常染色體顯性遺傳基因，含有3種等位基因，其不同基因與受體的結合活性有較大差異，從而對血脂、脂蛋白代謝產生較大的影響。亦有報道[12-13]發現，ApoE基因多態性可決定血脂水平，從而影響動脈粥樣硬化病變的發生與發展。本研究發現，早發組ApoE基因E3/E3型檢出率高于遲發組，提示ApoE基因E3/E3型或與冠心病發生時間有關。本研究進一步分析發現，ApoE基因E3/E3型是影響PCAD發生的危險因素，提示ApoE基因E3/E3型或可誘導PCAD的發生，這可能與E3/E3型可加重機體血脂代謝異常、促進動脈粥樣硬化進展有關。但有研究[14]指出，PCAD患者ApoE基因E4等位基因與遲發性冠心病患者相比明顯增高，與本研究結果不符，這可能與本研究樣本量較少有關，故后期需增加樣本量以進一步分析。

血脂異常是動脈粥樣硬化進展的重要因素，而動脈粥樣硬化是冠心病發生的病理基礎，故目前認為血脂代謝與冠心病的發生密切相關[15]。ApoE是一種由星形膠質細胞產生、神經元和小神經膠質細胞參與合成的中樞神經系統重要載脂蛋白[16]。目前，對于ApoE基因與冠狀動脈病變程度的關系尚存在爭議。有報道[17-18]發現，ApoE基因多態性因與血脂代謝有關，或與冠狀動脈病變也存在密切關聯。但有研究[19-20]指出，ApoE基因多態性與冠心病患者冠狀動脈受累數目無關。因此，本研究進行了相關研究，發現PCAD患者ApoE基因E3/E4型檢出率隨冠狀動脈病變嚴重程度的加重而升高，表明患者ApoE基因多態性與冠狀動脈病變嚴重程度相關，這主要是因為ApoE基因多態性可導致血脂異常，抑制內皮一氧化氮合酶活性，改變血管內皮功能，從而加重冠狀動脈病變程度。本研究結果顯示，ApoE基因E2/E3、E3/E3和E3/E4型對PCAD患者冠狀動脈病變嚴重程度具有一定的評估價值，且各基因型聯合評估的AUC更高，因此ApoE基因多態性分析對PCAD患者冠狀動脈病變嚴重程度具有較好的評估價值。

綜上所述，PCAD患者ApoE基因以E3/E3型為主，E3/E4型或與冠狀動脈病變嚴重程度有關，且ApoE基因多態性分析對PCAD患者冠狀動脈病變嚴重程度具有較好的評估價值。