半滑舌鰨黏蛋白樣蛋白基因克隆及其組織分布和時序表達

金歌，費金鵬，胡秀彩，譚靜，呂愛軍，孫敬鋒

（天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）肉質鮮美、出肉率高、營養豐富，受到廣大消費者的青睞[1]，是我國主要分布于渤海、黃海和東海海域特有的名貴經濟海水魚類之一。近年來，我國半滑舌鰨多采用集約化養殖，但由于飼養密度過大、水質環境差，多種細菌性傳染病頻繁發生造成了巨大的經濟損失[2,3]。

魚類生活在比陸地更為復雜的水生環境中，更易接觸病原體，包括細菌、病毒、寄生蟲等[4,5]。魚類皮膚黏液主要由黏蛋白、免疫球蛋白和酶類等組成[6]。黏蛋白作為黏液的主要成分，在魚類抵制病原菌入侵中發揮重要作用。魚類黏蛋白主要分為分泌型黏蛋白和膜結合型黏蛋白兩大類[7,8]。近年來，已陸續在斑馬魚（Danio rerio）[9,10]、鯉（Cyprinus carpio）[11]、金頭鯛（Sparus aurata）[12]、海鱒（Salmo trutta）[13]以及半滑舌鰨[14,15]等硬骨魚類中，發現有MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC13 和MUC18 等黏蛋白。在脊椎動物中還發現一些黏蛋白樣蛋白（Mucin-like protein,MLP）基因[10,16]，與人類MUC2黏蛋白由同一基因編碼[17]。但是，關于半滑舌鰨黏蛋白MLP 基因克隆表達及功能研究，目前尚未見報道。

本研究采用RT-PCR 方法擴增和克隆了半滑舌鰨黏蛋白CsMLP 基因，利用生物信息學方法預測分析了基因蛋白結構，分析CsMLP 在各組織分布和創傷弧菌感染后其在皮膚中的表達模式，以期為深入研究黏蛋白在魚類免疫過程中的功能提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

致病性創傷弧菌ST-6 菌株由本試驗室從發病半滑舌鰨分離純化并保存[2]。半滑舌鰨購自天津某養殖公司，平均體質量（110±10）g，體長為25～30 cm，置于1.2 m×0.8 m×0.6 m 的網箱中室內暫養2周，每天投喂普通飼料2 次、換水1 次，水溫維持在（25±2）℃，鹽度12。確認健康活潑無病后用于后續實驗。

實驗用Trizol 試劑、焦碳酸二乙酯DEPC、Prime Script RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RHaseH Plus）試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；主要檢測儀器有：CFX96 型熒光定量PCR 儀（BIO-RAD）、NanoDrop 2000 分光光度計（Thermo）、瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一儀器廠，DYCP-31BN）、和臺式高速冷凍離心機（Legend Mach 1.6R，賽默飛世爾儀器有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人工感染半滑舌鰨及組織樣品收集

創傷弧菌感染半滑舌鰨實驗，參照胡秀彩等[2]方法進行。取保存于-80℃的創傷弧菌ST-6 菌株，無菌接種于2216E 培養基中，28℃、120 r/min 過夜培養。菌液濃度用比濁法調至1×106CFU/mL 后，給半滑舌鰨腹腔注射，劑量為100 μL。對照組注射等量0.85%的生理鹽水。無菌操作取其皮膚、鰓、肝、脾和腸道；注射6 h、12 h、24 h 和36 h 時皮膚取樣，用生理鹽水沖洗以去除黏液，置于液氮中冷凍保存備用。

1.2.2 組織總RNA 提取與cDNA 第一鏈合成

參照譚靜等[14]的方法，用TRIzol Reagent 抽提RNA，-80℃冰箱保存備用。用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質量，用Nanodrop ND-2000 分光光度計測定其濃度及OD260/OD280。然后以提取的總RNA 為模板，用TaKaRa 反轉錄試劑盒（PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成第一鏈cDNA，合成的cDNA 于-20℃冰箱保存備用。

1.2.3 引物設計及半滑舌鰨CsMLP 基因克隆

參考半滑舌鰨基因組黏蛋白MLP 基因序列（登錄號：XM_025055452）設計2 對黏蛋白特異性引物用于RT-PCR 擴增和1 對引物用于qPCR 擴增（表1），引物由金唯智生物科技有限公司合成。

表1 半滑舌鰨黏蛋白MLP 基因引物序列Tab.1 Primer sequence of MLP gene in semi-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis

以半滑舌鰨皮膚組織cDNA 為模板，采用RT-PCR 方法擴增CsMLP。PCR 擴增體系為25 μL，包括cDNA 模板2 μL、上下游引物各1 μL、Master Mix 10 μL 和ddH2O 11 μL。PCR 反應條件為：95℃預變性2 min；95℃40 s，55℃45 s，72℃1 min 30 s，30 個循環；72℃延伸5 min。PCR 產物用1%瓊脂糖檢測后，用DNA 膠回收試劑盒回收目的基因片段；膠回收產物與pMD18-T 載體進行連接，進一步轉化到DH5α 感受態細胞中，挑取陽性克隆菌液送金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.4 CsMLP 蛋白序列與結構預測

利用ExPASy ProtParam tool 分析該蛋白質的理化性質、NetOGlyc 4.0 Server 和NetPhos 3.1 Server 預測其糖基化與其磷酸化位點、SMART 預測蛋白質結構域；利用DNAStar 中Protean 軟件分析該蛋白的疏水性、表面可能性、抗原指數及綜合預測其抗原表位；利用PSIPRED 在線分析其二級結構、Phyre2進行蛋白三級結構預測，ClustalW 及MEGA 6.0 進行序列比對。

1.2.5 實時熒光定量PCR

以cDNA 為qPCR 模板，GAPDH 為內參基因（引物序列見表1），利用CFX96 型熒光定量PCR 儀進行不同組織和創傷弧菌感染后其在皮膚各個時間點的定量分析，每個組織及時間點各取3 個樣品，每個樣品重復3 次。20 μL 反應體系包括SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）10 μL，上下游引物（10 μM）各0.5 μL，各組織cDNA 模板2 μL，ddH2O 7 μL。反應程序為：95℃3 min；95℃15 s，60℃1 min，40 個循環；72℃2 min；65℃5 s；95℃5 s。通過制作標準曲線來檢測實時熒光定量PCR 引物的特異性和試驗的可靠性。繪制標準曲線以皮膚組織的cDNA 為模板，進行4 倍倍比稀釋，取5 個稀釋梯度進行反應，每個梯度設3 個平行，并做不加模板對照，確定每個基因擴增后標準曲線的擴增效率（E）在90%～105%之間，R2>0.990；產生的溶解曲線是單一波峰后為有效數據，每個樣品進行3 次重復試驗，分別制作目的基因CsMLP 和內參基因GAPDH 的標準曲線（擴增效率為E=95%，相關系數R2=0.997）。根據擴增得到Ct 值，通過2-ΔΔCt法計算MLP 基因的相對表達量，采用SPSS 19.0 進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 半滑舌鰨CsMLP 蛋白理化特性分析

采用RT-PCR 方法擴增半滑舌鰨皮膚黏蛋白CsMLP 基因片段，分別獲得特異性片段長度大小為1 500 bp 和1 400 bp 左右目的條帶，與預期片段大小一致（圖1），測序獲得長度為1 506 bp 和1 589 bp的兩條序列，經拼接基因全長為2 989 bp，推測可編碼996 氨基酸（aa），與半滑舌鰨基因組黏蛋白MLP基因序列（XM_025055452）相似性為91.31%。預測分子量為104.30 kDa，理論等電點（pI）為4.47、蛋白不穩定系數為47.99、親水性平均系數（GRAVY）為-0.558，表明半滑舌鰨蛋白CsMLP 屬于親水蛋白。DNAstar 軟件預測CsMLP 可形成抗原表位的氨基酸區域數有6 個，分別是43～49、175～195、406～426、455～465、559～587 和990～996 aa（圖2）。對CsMLP蛋白修飾位點的預測結果表明：CsMLP 有5 個糖基化位點（Thr568、Ser571、Ser767、Ser782、Thr844）和24 個磷酸化位點（閾值≥0.9），其中16 個為絲氨酸（Ser）磷酸化位點（S27/30/77/239/498/571/591/600/634/647/681/694/728/741/754/991）、4 個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點（T9/70/76/581）及4 個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點（Y41/500/778/809）。

2.2 黏蛋白基因序列比對及3D 結構預測

通過Blast 同源性檢索分析結果發現，半滑舌鰨CsMLP 與黃金鱸（Perca flavescens，XP_028432905）MLP 同源性最高為56.18%，其次與大西洋鳙鰈（Hippoglossus hippoglossus，XP_034437605.1）為50.78%，與石斑魚（Epinephelus lanceolatus，XP_033488230.1）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes，XP_029701618.1）和斑馬魚（Danio rerio，XP_002667589）分別為44.07%、39.34%和33.15%；但與非洲爪蟾（Xenopus laevis，XP_018113014）、人（Homo sapiens，CAA04737.1）和紫海膽（Strongylocentrotus purpuratus，XP_0308517 49.1）等同源性較低，分別為26.91%、22.63%和15.69%（表2）。CsMLP 蛋白結構域分析顯示（圖3），CsMLP 蛋白共含有3 個結構域，分別為VWD（smart00216,98～273 aa）、C8（pfam08742,318～379 aa）和CK（smart00041,908～982 aa）。二級結構預測結果表明，該蛋白以β-折疊為主，其中C8 區主要由α-螺旋構成，VWD、CK 區主要由β 折疊構成。三級結構與二級結構預測結果基本一致（圖4）。

表2 CsMLP 序列同源性比對分析Tab.2 Homology analysis of sequence alignment of CsMLP gene

2.3 CsMLP 基因的組織分布及創傷弧菌感染后皮膚表達分析

用SYBR Green Ⅱ實時熒光定量PCR 法分析了CsMLP 基因mRNA 的組織分布、創傷弧菌感染后CsMLP 皮膚表達模式。結果顯示：CsMLP 基因擴增效率為E=103.2%，相關系數R2=0.994，對應的熔解曲線生成單一峰、無引物二聚體和非特異性產物，表明引物具有特異性，可用于相對定量qPCR 檢測分析。CsMLP 基因廣泛存在多個組織中，但存在一定組織差異性，其中鰓、皮膚中表達量較高，而在脾臟、肝臟和腸道中表達水平較低（圖5-A）。創傷弧菌感染半滑舌鰨后，皮膚組織中CsMLP 基因在短時間內顯著下調表達，刺激12 h 后表達顯著增加（P<0.05），達最高峰表達量，約為對照組的2.5 倍，感染36 h 后顯著性下調表達（P<0.01）（圖5-B）。

3 討論

近年來，重要養殖經濟魚類半滑舌鰨多種細菌性傳染病頻繁發生，其中弧菌感染危害嚴重[2,3]。皮膚及其黏液是魚體抵抗病原體的重要防線，其中黏蛋白為黏液的主要成分[14,15,18]。黏蛋白是一類富含脯氨酸、蘇氨酸和絲氨酸高度串聯重復結構域的大分子類糖蛋白，根據蛋白特性可分為兩大類即膜結合型黏蛋白和分泌型黏蛋白[7,8]。分泌型黏蛋白進一步可分為大分子的凝膠形成型黏蛋白（SGFM）和小分子的可溶性黏蛋白[19]。SGFM 含有一個血管性血友病因子D 型結構域（VWD），富含半胱氨酸的C8 結構域（C8）和C 末端半胱氨酸結（CK），參與黏蛋白的低聚反應[13]。本研究采用RT-PCR 方法克隆獲得半滑舌鰨分泌型黏蛋白CsMLP，預測含有三個保守結構域（即VWD、C8 和CK），與金頭鯛中的MUC2保守結構域一致[10]。系統發育進化樹結果顯示，半滑舌鰨CsMLP 與MUC2 同屬于分泌型黏蛋白家族。同源性分析表明，CsMLP 氨基酸序列與黃金鱸、大西洋鳙鰈、斑馬魚等魚類序列同源性較高，但與非洲爪蟾、人、鼠、海膽等同源性較低，值得進一步探索其生物學功能。

黏蛋白不僅參與細菌黏附侵入過程，且與宿主細胞增殖分化、細胞凋亡免疫和信號轉導等多種生物學過程有關[10,20]。近年來，關于魚類黏蛋白的表達及功能研究也逐漸成為關注熱點，主要集中在膜結合型和分泌型黏蛋白MUC2、MUC5AC 和MUC18等[14,15]。但是，關于半滑舌鰨黏蛋白樣蛋白CsMLP基因克隆表達研究，目前尚未見報道。薛春雨等[8]克隆獲得了團頭魴（Megalobrama amblycephala）MUC5B 基因，發現其在皮膚和鰓中表達量最高。Pérez-Sánchez 等[12]研究了李氏粘體蟲（Enteromyxum leei）感染金頭鯛后MUC13、MUC18 等黏蛋白的組織分布及腸道表達時序。Sveen 等[16]分析了大西洋鮭（Salmo salar）全基因組，獲得MUC2 和MUC5基因序列，發現MUC2 基因主要在腸道表達，而MUC5 基因主要在皮膚和鰓中表達。在鯉（Cyprinus carpio）中黏蛋白MUC2、MUC5B 的組織分布與鮭的研究中也報道類似結果[9]。CyHV-3 感染鯉后MUC5B 基因下調表達[21]。Marcos-López 等[22]研究發現，大西洋鮭感染阿米巴鰓病后，分泌型黏蛋白MUC5AC 表達量顯著增加，膜結合型黏蛋白MUC18卻下調表達明顯。本研究發現半滑舌鰨CsMLP 基因主要在皮膚和鰓中大量表達，這與鯉MUC5B、大西洋鮭MUC5AC 基因組織表達模式類似[9,22]。多數黏蛋白的分布均呈組織特異性，如人類的MUC2 主要在腸道特異性表達[23]。本實驗采用創傷弧菌感染半滑舌鰨后CsMLP 基因在短時間內顯著下調表達，隨后在刺激12 h 后表達顯著增加，36 h 后顯著性下調表達，結果表明CsMLP 在細菌感染半滑舌鰨抗病應答過程中發揮重要作用。本實驗主要分析了創傷弧菌感染半滑舌鰨后MLP[24]基因在皮膚組織中的表達，關于在脾臟、肝臟和腸道組織的表達模式有待進一步研究。

本研究克隆了半滑舌鰨皮膚黏蛋白CsMLP 基因序列，進行了生物信息學分析，采用熒光定量分析其在各組織中分布情況和創傷弧菌感染后在皮膚中的表達模式，不僅為研究魚類黏蛋白基因功能奠定基礎，而且對魚類疾病免疫預防研究具有重要意義。