多異瓢蟲氣味結合蛋白HvarOBP2的基因克隆及配體結合特性分析

唐浩宇, 劉靖濤, 謝佼昕, 羿超群,3, 劉曉旭,3, 張永軍,*, 孫 洋

(1. 安徽師范大學生命科學學院, 重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室, 分子酶學與重大疾病機理研究安徽省重點實驗室,安徽蕪湖 241000; 2. 中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193;3. 河北農業大學植物保護學院, 河北保定 071000)

昆蟲嗅覺系統主要由中樞嗅覺系統和外周嗅覺系統兩部分組成(Ong and Stopfer, 2012)，在昆蟲識別外界信號過程中，氣味結合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、氣味受體(odorant receptors, ORs)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)、味覺受體(gustatory receptor, GRs)以及昆蟲感覺神經元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)等嗅覺相關蛋白發揮著至關重要的作用(Clyneetal., 1999; Coutoetal., 2005; Bentonetal., 2009; Leal, 2013; Joseph and Carlson, 2015; Zhangetal., 2016; Wangetal., 2017)。

1981年，第一個昆蟲OBPs在多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus觸角中被鑒定，此后發現OBPs廣泛存在于其他不同的昆蟲種中(Vogt and Riddiford, 1981)。 OBPs是一類水溶性酸性蛋白，全長約120～160個氨基酸，相對分子量較小，一般為15～20 kD， 序列中有6個保守的半胱氨酸位點(Pelosi and Maida, 1995)。OBPs的主要功能是特異性識別并結合外界環境中的氣味分子，運輸脂溶性的氣味分子穿過水溶性的感受器淋巴液到達嗅覺神經元樹突膜上的受體，引發后續的感受行為(Fanetal., 2011)。目前已經從鞘翅目瓢甲科的七星瓢蟲Coccinellaseptempunctata(楊雪嬌等, 2020)、異色瓢蟲Harmoniaaxyridis(韓世鵬等, 2019)、孟氏隱唇瓢蟲Cryptolaemusmontrouzieri(潘暢等, 2016)等鑒定了大量OBPs。研究發現，孟氏隱唇瓢蟲的CmonOBP2(潘暢等, 2016)、異色瓢蟲的HaxyOBP2(Quetal., 2021)以及銅綠麗金龜Anomalacorpulenta的AcorOBP2(Chenetal., 2019)均在頭部或觸角中高表達。體外競爭結合實驗數據表明，大黑鰓金龜Holotrichiaoblita的HoblOBP2重組蛋白與α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、苯甲酸乙酯以及月桂烯等植物揮發物組分有較強的結合能力(Dengetal., 2011)。

多異瓢蟲Hippodamiavariegata屬鞘翅目(Coleoptera) 瓢甲科(Coccinellidae)，是北方農田中優勢捕食性天敵昆蟲。田間的多異瓢蟲通過其敏銳的嗅覺系統，追蹤植物和植食性害蟲釋放的揮發物信號來準確定位多種獵物，在這一過程中多異瓢蟲氣味結合蛋白等相關化學感受蛋白發揮了重要作用。近年來，有關多異瓢蟲的研究多集中在生物學特性 (姜巖等, 2022)、殺蟲劑毒性研究以及捕食功能反應(Maryametal., 2020)等方面，而多異瓢蟲的嗅覺相關蛋白的功能研究鮮有報道。

本研究團隊前期通過成蟲觸角轉錄組測序和生物信息學分析，從多異瓢蟲鑒定出包括HvarOBP2在內的12個OBP基因，并陸續開展功能研究。組織表達譜分析發現HvarOBP2在雌雄成蟲觸角中特異性高表達(未發表數據)，推測其可能具有重要的化學感受功能。本研究圍繞HvarOBP2的配體結合特性進行研究，克隆了HvarOBP2開放閱讀框(open reading frame, ORF)，原核表達并純化后得到了重組HvarOBP2蛋白，通過熒光競爭結合實驗研究了重組HvarOBP2蛋白與40種候選植物揮發物組分以及24種蚜蟲相關揮發物組分的結合能力，解析其配體結合特征，以期闡明多異瓢蟲氣味結合蛋白的化學感受功能，為天敵昆蟲保護利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及組織收集

多異瓢蟲成蟲采自新疆庫爾勒地區，在中國農業科學院植物保護研究所廊坊科研中試基地建立室內種群，飼養條件為溫度24±1℃，相對濕度60%±10%，光周期16L∶8D，以桃蚜Myzuspersicae飼喂并維持種群。收集羽化2-5 d的多異瓢蟲雌雄成蟲(各200頭)觸角，放入無RNA酶的1.5 mL離心管中，液氮迅速處理后置于-80℃中保存備用。

1.2 HvarOBP2基因的鑒定和序列分析

利用Illumina HiSeq 2500技術平臺對5日齡多異瓢蟲成蟲觸角進行轉錄組測序，共3次生物學重復，每重復準備雌、雄成蟲觸角各300對。根據轉錄組數據建立本地數據庫，并在GenBank中下載其他鞘翅目昆蟲的OBPs核酸序列作為“query”，利用軟件TBtools 1.098685中 BLASTN程序確定多異瓢蟲的候選OBPs基因，所有候選OBPs再通過NCBI網站上的BLASTX程序進行驗證(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)(Wangetal., 2020)，使用Expasy(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)(蘇旭等, 2019)預測蛋白分子量及等電點，使用SignalP-5.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽(Bendtsenetal., 2004)。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

用勻漿器在液氮中研磨收集好的多異瓢蟲觸角，采用Trizol試劑提取總RNA，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳和IMPLEN超微量分光光度計NanoPhotometer N60檢測總RNA的質量和濃度。以提取的總RNA為模板，采用FastKing一步法反轉錄合成cDNA第1鏈。

1.4 HvarOBP2開放閱讀框擴增

根據HvarOBP2序列設計特異性引物(正向引物: 5′-ATGTTCAAATTTTTATTTTTGGTTTCTTG-3′; 反向引物: 5′-TCAATGGATAAAAGCTGCATTCAA-3′)，以1.3節合成的cDNA第1鏈為模板，擴增其ORF。PCR反應體系: 2×Phanta Max Master Mix 25 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各2 μL, ddH2O 17 μL, cDNA模板4 μL。PCR擴增程序: 94℃預變性3 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35個循環；最后72℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，通過Axygen膠回收試劑盒(康寧公司)回收PCR產物，然后連接至pCloneEZ-NRS-BluntAmp/HC(中美泰和公司)克隆載體上，轉化入TreliefTM5α(擎科生物公司)感受態細胞，測序獲得序列正確的質粒。然后用信號肽預測程序SignalP-5.0 Server去除HvarOBP2基因的信號肽序列，設計特異性引物(正向引物: 5′-CACCGTGAGCGAACAATGGA-3′; 反向引物: 5′-TCAATGGATAAAAGCTGCATTCAA-3′)，以序列正確的質粒為模板采用上述同樣PCR程序擴增其編碼區CDS。最后將PCR產物連接到pBM30(博邁德公司)表達載體，轉化至TreliefTM5α感受態細胞，測序驗證獲得序列正確質粒。

1.5 HvarOBP2重組蛋白表達與純化

將pBM30/HvarOBP2重組質粒轉化入蛋白表達宿主細胞BL21(DE3)中，挑取單克隆菌株于含有30 mg/mL卡那霉素的LB培養基中，置于搖床37℃ 220 r/min震蕩培養3～4 h。當大腸桿菌Escherichiacoli細胞數達到對數生長期(OD值0.6～0.8)時，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使其終濃度為1 mmol/L，加入質量濃度10%的葡萄糖溶液使其終濃度為1%。于37℃ 200 r/min搖床中誘導8 h。超聲波破碎菌體，分別收集上清和沉淀，經20% SDS-PAGE電泳檢測，發現目的蛋白以包涵體的形式存在于沉淀中。采用氧化還原法(Prestwich, 1993)進行包涵體的復性和重折疊，然后用通過親和層析、超濾以及透析等步驟進行純化(Guetal., 2013)，獲得目的HvarOBP2重組蛋白。

1.6 熒光競爭結合實驗

以40種植物揮發物組分和24種蚜蟲相關揮發物組分作為候選配體 (表1)，在F-380型熒光分光光度計上檢測HvarOBP2重組蛋白與熒光探針及配體的結合能力。熒光探針N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN)溶于HPLC級的甲醇中，所用容器為石英熒光比色皿。儀器激發波長設置337 nm，掃描發射波長范圍380～500 nm。在10 mmol/L的PBS緩沖液中加入HvarOBP2重組蛋白，使其終濃度為2 μmol/L，隨后加入熒光探針1-NPN，使終濃度由2 μmol/L遞增至20 μmol/L，記錄熒光值最大讀數，3次重復，計算HvarOBP2重組蛋白與1-NPN的解離常數(Ki)。

在熒光石英比色皿中加入PBS緩沖液，分別加入HvarOBP2重組蛋白與熒光探針1-NPN，使其終濃度均為2 μmol/L，等待約30 s，待熒光強度穩定后，記錄最大熒光強度，然后將溶于甲醇的氣味配體逐次加入到比色皿中，濃度由2 μmol/L遞增至 32 μmol/L，記錄熒光強度變化情況，3次重復。利用Scatchard方程計算HvarOBP2重組蛋白與氣味配體的Ki。計算公式為：Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，其中[1-NPN]為未結合的1-NPN濃度，K1-NPN代表HvarOBP2與探針的Ki(Guetal., 2011)。

1.7 HvarOBP2三維結構模擬及分子對接

將HvarOBP2氨基酸序列以FASTA格式輸入到三維模型預測工具trRosetta (https:∥yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/)，在蛋白質數據庫(PDB)中篩選適當的模板。然后用軟件AutoDock Vina 1.1.2解析HvarOBP2與配體(β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸和橙花叔醇)的結合方式，最后使用PyMOL1.9.0 (http:∥ www.pymol.org/)進行分子對接模擬。

2 結果

2.1 HvarOBP2基因的克隆及序列特征

擴增獲得多異瓢蟲HvarOBP2(GenBank登錄號: OK340816)的開放閱讀框，長約447 bp，與預期結果一致，編碼148個氨基酸殘基，N端有17個氨基酸組成的信號肽，預測成熟蛋白分子量為14.56 kD，等電點為5.48，具有6個保守的半胱氨酸位點(圖1)，符合公式C1-X20-66-C2-X3-C3-X21-43-C4-X8-14-C5-X8-C6，屬于classical OBPs亞家族。

圖1 多異瓢蟲HvarOBP2與其他鞘翅目昆蟲OBPs序列多重比對

2.2 HvarOBP2的重組表達

SDS-PAGE電泳檢測結果表明，HvarOBP2重組蛋白主要以包涵體形式表達，純化后的蛋白分子量約14.5 kD，與預測結果一致(圖2)。

圖2 HvarOBP2重組蛋白SDS-PAGE分析

2.3 HvarOBP2氣味配體結合特征

重組蛋白HvarOBP2與熒光探針1-NPN的結合曲線及Scatchard方程(圖3: A)顯示兩者具有結合能力且具有飽和效應，(Ki值)為 5.23±0.54 μmol/L。HvarOBP2與植物揮發物組分油酸(Ki=1.68±0.04 μmol/L)、鄰苯二甲酸二丁酯(Ki=8.77±0.19 μmol/L)、橙花叔醇(Ki=15.93±0.33 μmol/L)和β-紫羅蘭酮(Ki=10.79±0.24 μmol/L)的結合能力較強，與其他候選的蚜蟲相關揮發物組分及植物揮發物組分的IC50值均大于50 μmol/L(圖3: B; 表1)，判定為不結合。

圖3 HvarOBP2重組蛋白與1-NPN(A)和候選配體(B)的結合曲線

表1 不同配體對重組蛋白HvarOBP2重組蛋白的IC50值和解離常數(Ki值)

續表1 Table 1 continued

2.4 HvarOBP2三維結構預測及分子對接

從蛋白三維模型預測工具trRosetta推薦的模板中選擇家蠶信息素結合蛋白(PDB ID：1DQE)為HvarOBP2最合適的模板，TM-score為0.831，并使用蛋白結構驗證服務器SAVES v6.0(https:∥saves.mbi.ucla.edu/)評價HvarOBP2模型的質量，結果表明有85.81%的氨基酸殘基3D-1D得分大于等于0.2，表明該模型可被使用。預測的HvarOBP2模型由7個α-螺旋組成，分別位于Phe2-Ala17(α1), Glu20-Val41(α2), Glu45-Gly53(α3), His60-Leu73(α4), Lys84-Ala96(α5), Pro99-Ala117(α6), Lys122-Met140(α7)殘基之間。

選擇β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸以及橙花叔醇與預測的蛋白模板進行分子對接模擬(圖4)，結果顯示這些化合物能夠結合在HvarOBP2的疏水空腔內并靠近大量疏水殘基。預測HvarOBP2重組蛋白與β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸、橙花叔醇的結合能分別為-8.1, -7.6, -7.2和-7.6 kcal/mol。HvarOBP2與不同配體對接過程中的關鍵結合氨基酸殘基均為疏水性殘基(表2)，其中Phe12和Phe118是與多個配體結合的氨基酸殘基，表明這兩個殘基在HvarOBP2和配體的結合過程中發揮重要作用。

圖4 利用PyMOL1.9.0進行的重組蛋白HvarOBP2與配體的分子對接模擬

表2 重組蛋白HvarOBP2對配體的關鍵氨基酸殘基的預測

3 討論

昆蟲氣味結合蛋白在與氣味分子的結合及傳遞過程中發揮重要作用，調控了昆蟲對化學信號的響應，因此，功能性OBPs可作為篩選昆蟲引誘劑或驅避劑的作用靶標(張雪等, 2021)。本研究發現多異瓢蟲HvarOBP2重組蛋白與β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸和橙花叔醇均具有較強的結合能力(圖3: A; 表1)。

β-紫羅蘭酮是植物體內類胡蘿卜素底物氧化裂解產生的一種揮發性物質，天然存在于番茄、棉花、甘藍、油菜等植物中(Gruberetal., 2009)。已有大量研究報道昆蟲氣味結合蛋白OBPs與β-紫羅蘭酮具有較強的結合能力。例如，苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus的OBP5與β-紫羅蘭酮有很強的結合 (朱曉強等, 2015)；甜菜夜蛾Spodopteraexigua的OBP1和OBP7與β-紫羅蘭酮也有不同程度的結合能力(Liuetal., 2017)。淡足側溝繭蜂Microplitispallidips的OBP8能夠與β-紫羅蘭酮強烈結合，隨后的Y型嗅覺儀及田間試驗證明β-紫羅蘭酮能夠吸引淡足側溝繭蜂(Zhangetal., 2022)。本研究發現多異瓢蟲HvarOBP2重組蛋白與β-紫羅蘭酮有較強的結合能力，Ki值為10.79±0.24 μmol/L(表1)，這一結果與秀麗金龜甲Hylamorphaelegans和中華蜜蜂Apisceranacerana的OBPs與β-紫羅蘭酮有較高結合力的結論 (Venthuretal., 2016; 吳帆等, 2016)是相似的。β-紫羅蘭酮在植物與昆蟲化學通訊的相互作用過程中發揮了重要作用。

鄰苯二甲酸二丁酯是桃Prunuspersica、梨Pyrusspp.及黑楊Populusnigra等植物葉片中的揮發性物質(凌娜等, 2014; 李中珊, 2019)，先前的研究發現小地老虎Agrotisipsilon的AipCSP8及AipGOBP1和AipGOBP2均能夠與鄰苯二甲酸二丁酯有不同程度的結合能力(Huangetal., 2018; 蘇旭等, 2019)。本研究也發現HvarOBP2重組蛋白與鄰苯二甲酸二丁酯的結合能力較強，Ki值為 8.77±0.19 μmol/L(表1)。橙花叔醇與油酸分別屬于植物花香化合物與植物揮發物，其對HvarOBP2重組蛋白均有較強的結合能力，Ki值分別為15.93±0.33和1.68±0.04 μmol/L(表1)。

綜上，多異瓢蟲能夠通過HvarOBP2感受植物揮發物組分β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、橙花叔醇與油酸等來定位寄主植物和蚜蟲棲息地。后續的研究中我們將進一步利用RNAi或基因編輯手段明確HvarOBP體內調控功能，獲得與HvarOBP強結合的β-紫羅蘭酮、鄰苯二甲酸二丁酯、油酸、橙花叔醇等植物揮發物組分可以用來設計引誘組合增強多異瓢蟲獵物搜尋和定位的能力。