三葉木通種質資源形態學標記的遺傳多樣性分析

楊西萌，李桂香，潘玉芳，石多麗，孫正瓊，眭順照，李名揚

西南大學 園藝園林學院， 重慶 400715

三葉木通(Akebiatrifoliata)為木通科(Lardizabalaceae)木通屬(Akebia)落葉木質藤本植物， 莖蔓柔軟多姿， 花紫紅色， 花期長達2個月之久， 具有很好的觀賞和園林應用價值[1-3]． 此外， 三葉木通為中國傳統的中藥材， 其根、 藤莖、 果實等具有通筋活絡、 解毒和消炎等功效， 其果實為肉質蓇葖果， 色香味俱全， 是珍稀的綠色水果和保健食品， 是極具發展前景的經濟樹種[1-3]．

對三葉木通的研究目前集中在種質資源調查[4]、 栽培種植[5]、 病原菌鑒定[6]、 藥用價值[7]、 果實化學成分和果實貯藏保鮮[8]、 應用分子標記開展遺傳多樣性分析[9-10]、 指紋圖譜研究[11]等方面， 最近有文獻報道三葉木通染色體水平的基因組序列[12]． 盡管在三葉木通種質資源遺傳多樣性評價上已有部分研究， 但研究涉及到的三葉木通種質資源不夠全面[13]， 并且還未能建立官方的“三葉木通描述規范和數據標準”．

形態學標記是種質資源遺傳多樣性評價較為簡單有效， 且表現直觀的方法[14]． 其結合主成分、 相關性和聚類分析等方法[15]， 已廣泛運用于經濟植物的種質資源研究[16-21]． 本研究運用形態學標記方法， 以貴州、 湖南、 秦嶺地區收集的96份三葉木通實生種質資源為樣本， 對19個性狀進行相關性分析、 主成分分析和聚類分析， 綜合分析其表型遺傳多樣性， 為三葉木通種質創新奠定一定的物質基礎和數據支撐．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

96份供試材料為實生種質資源． 2015-2018年間從湖南、 貴州、 秦嶺片區采集的野生三葉木通資源， 采集后種植于重慶鄭清紫藤公園．

1.2 數據采集整理

1.2.1 形態記載標準

試驗于2019年7-10月進行， 每份種質資源在約4 m2的小區內， 以行距2 m、 株距2 m的密度種植； 2019年未噴施農藥． 參考李秀華等[22]的調查方法， 對三葉木通表型性狀記載標準進行整理(表1和表2)． 對每份實生種質資源的10個數量性狀和9個質量性狀進行田間調查， 以此分析三葉木通實生資源的表型遺傳多樣性．

表1 三葉木通表型數量性狀記載標準

表2 三葉木通表型質量性狀記載標準

1.2.2 數據標準化處理及統計分析

通過excel軟件對96份實生種質資源的表型性狀進行匯總， 對10個數量性狀進行描述統計， 計算9個質量性狀的頻率分布與遺傳多樣性指數(Shannon-Wiener index，H′)． 利用SPSS 23.0軟件對數據進行相關性分析、 主成分分析和聚類分析， 聚類分析采用平方歐氏距離瓦爾德法的系統聚類分析方法， 遺傳距離為平方歐式距離[23]．

2 結果與分析

2.1 數量性狀差異分析

依據三葉木通實生種質資源的果縱徑、 果橫徑、 小葉長、 小葉寬、 頂葉長、 頂葉寬、 葉柄長、 小葉長寬比和頂葉長寬比等10個數量性狀的數據分析(表3)， 在不同三葉木通實生種質資源間， 變異系數均大于10%， 范圍在12.9%～41.4%之間． 10個數量性狀變異系數由大到小依次為： 葉柄長41.4%、 頂葉寬17.6%、 果縱徑16.8%、 頂葉長寬比16.5%、 小葉寬16.4%、 小葉長15.8%、 頂葉長15.6%、 果縱橫徑比14.5%、 小葉長寬比13.3%、 果橫徑12.9%．

表3 三葉木通種質資源的數量性狀的差異與多樣性

2.2 質量性狀遺傳多樣性分析

依據表4， 三葉木通實生種質資源的果實性狀， 果量在10～20顆(含10和20顆)占比較多， 有39.5%， 其次是小于10顆的果量， 占36.0%， 大于20顆的占24.4%； 果色有66.3%是黃色， 紫色與粉色的占比分別是17.4%與16.3%； 坐果類型， 分散著生與成簇著生的占比為51.2%與46.5%， 穗狀著生的比例為2.3%； 果染病率在75%～100%之間的占比較多， 為44.2%， 接下來依次是果染病率0～25%，25%～50%，50%～75%， 分別占比24.4%，19.8%，11.6%． 三葉木通實生種質資源的葉片性狀， 不同葉色頻率從高到低依次是綠、 暗綠、 亮綠， 頻率分別為63.5%，27.1%，9.4%； 不同葉片質地頻率從高到低依次是革質、 厚革質、 薄革質， 頻率分別為88.5%，9.4%，2.1%； 不同葉形頻率從高到低依次是闊卵形、 卵形、 尖端凹入卵形、 邊緣淺裂卵形， 頻率分別為45.8%，22.9%，20.8%，10.4%； 不同葉染病率頻率從高到低依次是50%～75%，25%～50%，0～25%，75%～100%， 頻率分別為36.5%，30.2%，19.8%，13.5%． 三葉木通實生種質資源的株型性狀， 一般株型占比較高為43.8%， 其次是疏散株型的占比為36.5%， 再次是緊湊株型的占比為19.8%．

Shannon遺傳多樣性指數范圍在0.59～1.85， 除了株型外的8個質量性狀都大于1.00．

表4 三葉木通種質資源質量性狀的分布頻率與遺傳多樣性指數

2.3 三葉木通表型性狀的相關性分析

由表5可知， 果量與果色、 坐果類型、 果染病率、 株型、 果縱徑、 果橫徑、 果實縱橫徑比呈極顯著正相關， 與葉染病率呈顯著正相關； 果色與坐果類型、 果縱徑、 果橫徑、 果實縱橫徑比呈極顯著相關， 與株型呈顯著相關； 坐果類型與果染病率、 株型、 果縱徑、 果橫徑、 果縱橫徑比呈極顯著正相關； 果染病率與果縱徑、 果橫徑、 果縱橫徑比呈極顯著正相關， 與葉染病率呈顯著正相關； 葉色與葉染病率呈極顯著正相關； 葉質與葉形、 小葉長、 小葉寬、 頂葉長呈顯著正相關； 葉形與小葉長、 葉柄長、 小葉長寬比呈極顯著正相關， 與頂葉長呈顯著正相關； 葉染病率與株型呈極顯著正相關； 株型與小葉長、 小葉寬、 頂葉長、 頂葉寬、 果實縱橫徑比呈極顯著正相關， 與葉柄長呈顯著正相關； 果縱徑與果橫徑、 小葉寬、 頂葉寬、 果實縱橫徑比呈極顯著正相關， 與小葉長呈顯著正相關； 果橫徑與小葉寬、 果實縱橫徑比呈極顯著正相關； 小葉長與小葉寬、 頂葉長、 頂葉寬、 小葉長寬比呈極顯著正相關， 與葉柄長、 果實縱橫經比呈顯著正相關； 小葉寬與頂葉長、 頂葉寬、 小葉長寬比、 頂葉長寬比呈極顯著正相關， 與果實縱橫徑比呈顯著正相關； 頂葉長與頂葉寬、 小葉長寬比呈極顯著正相關， 與葉柄長、 頂葉長寬比呈顯著正相關； 頂葉寬與葉柄長、 頂葉長寬比呈極顯著正相關， 與小葉長寬比、 果實縱橫徑比呈顯著正相關； 小葉長寬比與頂葉長寬比呈極顯著正相關． 根據對三葉木通實生種質資源的19個性狀進行相關性分析的結果， 各個性狀相互聯系， 在利用資源的時候要對各個性狀進行綜合考量．

表5 三葉木通種質資源19個表型性狀相關性分析

2.4 三葉木通表型性狀的主成分分析

主要信息集中在前4個主成分中(表6)， 累積貢獻率為64.714%， 第1主成分特征值為5.057， 貢獻率為26.616%， 果實縱橫徑比、 果縱徑、 果橫徑、 坐果類型、 果量、 果色是主要指標， 此類性狀主要與果實性狀有關； 第2主成分特征值為3.413， 貢獻率為17.965%， 小葉長、 頂葉長、 頂葉寬、 小葉寬是主要指標， 此類性狀主要與葉片長寬有關； 第3主成分特征值為2.189， 貢獻率為11.519%， 小葉長寬比、 頂葉長寬比是主要指標， 此類性狀主要與葉片形態指標有關； 第4主成分特征值為1.637， 貢獻率為8.614%， 葉染病率與葉色、 葉柄長是主要指標， 此類性狀主要與植株染病情況有關； 第2，3，4主成分都與葉片性狀相關．

表6 三葉木通種質資源19個表型性狀的主成分分析

2.5 三葉木通表型性狀的聚類分析

對三葉木通實生種質資源的19個性狀進行聚類分析(圖1)， 在遺傳距離為7.5時， 96份三葉木通實生種質資源被分成3類(表7和表8)．

第Ⅰ類， 有42份三葉木通實生種質資源， 果葉較大、 果染病率較高為該類實生種質資源的特征； 第Ⅱ類， 包含44份三葉木通實生種質資源， 此類實生種質資源的果實與葉片比第Ⅰ類小， 且果染病率較低； 第Ⅲ類， 有10份三葉木通實生種質資源， 該類實生種質資源在調查期間無果實著生、 葉片較小且株型較為松散．

表7 不同類群數量性狀的平均值與變異系數

圖1 三葉木通種質資源表型性狀聚類分析

表8 不同類群果染病率與株型的分布頻率

3 討論

三葉木通作為我國的特有種， 分布較廣、 遺傳資源豐富， 是一種極具藥用價值、 食用價值、 觀賞價值和園林應用價值的經濟植物． 但三葉木通當前開發度不高， 并且因不合理的采伐， 其種質資源遭到一定程度的破壞． 因此需要加強對三葉木通植物資源的保護力度， 進行種質資源的調查、 收集、 整理、 鑒定、 評價[4]． 但目前， 因為沒有官方推出的“三葉木通描述規范和數據標準”， 所以對三葉木通種質資源的研究而言， 不論是前期種質的鑒定、 評價， 還是后期針對目標性狀的育種創新， 都會有所限制． 本研究在李秀華[23]制定的“三葉木通種質資源特性描述規范表”的基礎上， 結合本研究供試材料的表型特征， 補充葉片質地、 葉形、 葉色、 葉染病率、 果實數量、 坐果類型、 果染病率等性狀描述， 為“三葉木通描述規范和數據標準”的推出， 提供一定程度的參考依據．

對三葉木通種質資源表型性狀進行測定與分析， 10個數量性狀變異系數均大于10%． 李秀華[23]對73份三葉木通種質16個數量性狀的研究結果表明， 葉片指標變異較小， 遺傳比較穩定． 本研究的葉柄長、 頂葉寬是變異系數最高的2個數量性狀， 葉柄長變異系數達41.4%， 表明本批種質在葉片指標上變異較為豐富． 9個質量性狀的遺傳多樣性指數除葉片質地外， 都大于1.00， 3個遺傳多樣性指數最大的是葉染病率、 果染病率和葉形． 結合數量性狀與質量性狀多樣性的分析， 本研究供試種質資源材料變異系數、 遺傳多樣性指數較高， 遺傳多樣性較豐富， 為三葉木通種質創新育種的理想材料．

統計得到48對性狀極顯著相關， 由此可見， 確定目標性狀后有針對性地對三葉木通種質資源進行評價篩選時， 要結合多種性狀指標綜合評價． 主成分分析將96份三葉木通種質資源的19個表型性狀整合為4個主成分， 累積貢獻率達到64.714%． 第1-4主成分分別主要與果實性狀、 葉片長寬、 葉片形態、 植株染病情況相關． 此4類主成分相關的主要性狀特征即為本研究供試材料表型多樣化的主要因素[25]． 結合相關性分析， 4個主成分的主要性狀， 彼此間是具有一定相關性， 在進行種質創新育種工作期間， 可以利用本研究得到的4個主成分因子， 提升育種創新的效率．

聚類分析將96份三葉木通種質資源劃分為3大類群． 第Ⅰ類群下的種質特征為果實、 葉片較大， 第Ⅱ類為果實染病率較低， 或是比較有抗病能力的類群， 第Ⅲ類為無果實著生、 株型疏散類型． 各類群別特征明顯， 為不同育種目標提供更有針對性的種質基礎． 例如， 若是針對培育觀果的種質， 可以在第Ⅰ類種質中篩選； 若是注重果實品質， 有助于果實的產量銷售等， 則在第Ⅱ類群體中； 若是作為藤本植物運用于城市綠化中， 無果實著生的材料或更有利于城市環境(第Ⅲ類)． 聚類分析較好地將供試材料進行區分與整理， 為其以后的創新利用提供依據．

本研究通過對96份三葉木通種質資源19個表型性狀的調查觀測、 表型多樣性分析， 為“三葉木通種質資源的描述規范與數據標準”的制定提供一定的參考． 研究發現供試資源類型較豐富， 變異較大， 對豐富我國三葉木通資源種質庫的多樣性和三葉木通優質種質的選育具有較高價值． 但缺少對本批三葉木通種質資源花、 種子相關性狀表型的觀測， 后續還應加大力度完善； 表型性狀的觀測受外界環境的影響較大， 還應進行多年監測以及結合分子標記對種質資源進行更完整的遺傳多樣性評價．