核桃分離蛋白的制備工藝優化及功能特性

高 盼， 李恒彬， 陳 哲， 楊歆萌， 胡傳榮， 何東平,3， 張 暉， 張躍進， 王興國,

(1.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023； 2.大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，武漢 430023； 3.國家市場監管重點實驗室(食用油質量與安全)，武漢 430012； 4.武漢食品化妝品檢驗所，武漢 430012； 5.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122； 6.云南摩爾農莊生物科技開發有限公司，云南 楚雄 675000)

我國是全球最大的核桃生產國，同時也是全球最大的核桃消費國，核桃主要的消費方式是作為堅果食用和提取核桃油，對于核桃提油后產生的核桃粕的利用卻很少(核桃粕中含有大量蛋白質[1])，造成了極大的資源浪費。核桃蛋白是一種優質的植物蛋白，含有豐富的人體必需氨基酸，同時也滿足FAO/WHO對氨基酸攝入量的建議[2-5]。目前核桃蛋白多數僅為初加工產品，缺少高純度的產品，無法占領食品原料和功能性食品添加劑市場，制約了核桃蛋白產品的發展。雖然已有研究者[6]優化了工藝，提高了核桃粕中蛋白質的提取率，但得到的蛋白純度仍較低，不適合直接利用。高品質的核桃蛋白主要來源于蛋白質含量高于90%的核桃分離蛋白，而為了提高核桃蛋白的市場占有率，有必要對其進行純化處理[7]。

蛋白純化是利用蛋白質物理、化學性質的差異，使其達到純化的目的[7]。蛋白純化的傳統方法是沉淀法，該方法具有成本低、操作簡單、回收率高、設備要求低的優點，但是對蛋白的選擇性不高，適用于蛋白的初步純化和濃縮[8]。酶法是現今蛋白提取純化的常用方法[8]，其中糖化酶純化是較為普遍的提純方法，可將可溶性糖等非蛋白質組分溶出[9]，在蛋白提取純化方面有著廣泛的應用[10]，已在棉籽蛋白[9]和米糠蛋白[11]中被證明具有很好的純化效果。因此，本實驗選擇糖化酶作為純化用酶，純化核桃蛋白制備核桃分離蛋白，采用單因素實驗和正交實驗對糖化酶純化工藝進行優化，通過與低變性核桃蛋白粉比較考察核桃分離蛋白的氨基酸組成及功能特性，為高品質的核桃分離蛋白開發利用提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

核桃蛋白，由實驗室制備(核桃仁經脫脂、粉碎后經酶法輔助堿溶酸沉制備)，其蛋白質含量約為70%，水解度為4.50%。

糖化酶(1.5×105U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、硫酸、硼酸溶液、硫酸銅、鹽酸、硫酸鉀、乙醚、95%乙醇溶液、溴甲酚綠指示劑、甲基紅指示劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

SZ-93自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；FD-8型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；TDSZ臺式離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器有限公司；八孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；通用實驗室pH計，上海奧豪斯儀器有限公司；pH-Stat裝置，上海亞榮生化儀器廠；101-1-S數顯鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；L8800型全自動氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃分離蛋白的純化工藝

核桃蛋白→加水溶解→調節 pH →調節溫度→加入糖化酶→酶解→高溫滅酶(85℃，15 min)→調節pH至7.0→5 000 r/min離心10 min→加水洗滌(45℃，10 min)→調節pH至7.0→真空冷凍干燥→核桃分離蛋白。

1.2.2 基本指標的計算

蛋白提取率=提取液中蛋白質總量/原料中蛋白質總量×100%；蛋白純度=干物質的蛋白質質量/干物質的質量×100%。

1.2.3 核桃蛋白的氨基酸組成及功能特性分析

1.2.3.1 氨基酸組成

在核桃蛋白中加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，真空充氮后封口。在110℃恒溫干燥箱內水解24 h，取出過濾定容至50 mL。取1 mL濾液真空干燥，用蒸餾水溶解，過膜備用。

氨基酸自動分析儀測定條件：陽離子交換樹脂色譜柱(4.6 mm×60 mm，3 μm)，進樣量20 μL，檸檬酸鈉緩沖液流速0.4 mL/min，茚三酮流速0.4 mL/min，衍生溫度135℃，測定波長570、440 nm。

1.2.3.2 功能特性

參考Ajibola等[12]的方法并略作修改對持水性和吸油性進行測定；參考李超等[13]的方法并略作修改對乳化性進行測定。

(1)持水性的測定

稱取1.0 g待測樣品，加入10 mL蒸餾水，充分攪拌混勻后，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，設置不同溫度保溫30 min。將混合溶液倒入離心管中，4 500 r/min離心20 min，去除上層溶液后，稱離心管質量。按下式計算持水性(Y1)。

Y1=(m2-m1)/m

(1)

式中：m為樣品質量，g；m2為離心管和沉淀物的總質量，g；m1為離心管和樣品的總質量，g。

(2)吸油性的測定

稱取1.0 g待測樣品，加入10 mL一級大豆油，充分攪拌混勻后，放在恒溫加熱磁力攪拌器中，設置不同溫度保溫30 min。將混合溶液倒入離心管中，4 500 r/min離心20 min，去除上層溶液后，稱離心管質量。吸油性(Y2)計算按式(1)。

(3)乳化性的測定

稱取2.0 g樣品，加入40 mL 蒸餾水溶解，將溶液調節為不同pH，再加入40 mL一級大豆油，10 000 r/min均質2 min，1 500 r/min離心10 min，測定離心管中乳化層高度(H1)和液體總高度(H)。按下式計算乳化性(Y3)。

Y3=H1/H×100%

(2)

1.2.4 數據處理

本實驗采用Excel 2016統計分析和Design-Expert 8.0.6軟件進行數據處理、分析、作圖，所有實驗數據以“平均值±標準差”(n=3)表示。用SPSS 23.0的Duncan法對數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 核桃蛋白純化的單因素實驗

2.1.1 加酶量對蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在料液比1∶10、酶解溫度60℃、酶解時間30 min、酶解pH 4.0的條件下，調節加入糖化酶的量分別為20、40、60、80、100、120、140、160 U/g，探究加酶量對核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結果如圖1所示。

圖1 加酶量對蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖1可見，隨著加酶量的增加，蛋白提取率先增加后減少，當加酶量為80 U/g時，蛋白提取率最高，為82.04%，其后蛋白提取率逐漸下降。而蛋白純度的變化相對較小，在加酶量為80 U/g時，蛋白純度也達到了最高，為81.90%。因此，確定最佳的加酶量為80 U/g。

2.1.2 料液比對蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在加酶量80 U/g、酶解溫度60℃、酶解時間30 min、酶解pH 4.0的條件下，調節料液比分別為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12，探究料液比對核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結果如圖2所示。

圖2 料液比對蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖2可見，隨著料液比的增加，蛋白提取率逐漸增加，當料液比超過1∶10時，再增加料液比，蛋白提取率增速明顯減緩。而蛋白純度隨著料液比的增加呈先上升后降低的趨勢，在料液比為1∶10時，蛋白純度最高，為83.84%。因此，選擇最佳料液比為1∶10。

2.1.3 酶解溫度對蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在加酶量80 U/g、料液比1∶10、酶解時間30 min、酶解pH 4.0的條件下，調節酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65℃，探究酶解溫度對核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結果如圖3所示。

圖3 酶解溫度對蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖3可見，隨著酶解溫度的升高，蛋白提取率變化很小，其提取率范圍為82.77%～84.16%，提取率在55℃時達到最高。蛋白純度隨著酶解溫度的上升呈先升高后下降的趨勢，當酶解溫度為60℃時，蛋白純度達到最高，為84.82%。而繼續升高溫度，蛋白純度顯著下降，這可能是由于溫度過高導致蛋白質發生不可逆的熱變性，導致其溶解度下降，從而造成蛋白純度下降。綜合考慮提取率和純度結果，當酶解溫度為60℃時，蛋白提取率為83.96%，僅次于峰值，因此選擇60℃為最佳酶解溫度。

2.1.4 酶解時間對蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在加酶量80 U/g、料液比1∶10、酶解溫度60℃、酶解pH 4.0的條件下，調節酶解時間分別為10、20、30、40、50、60 min，探究酶解時間對核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結果如圖4所示。

圖4 酶解時間對蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖4可見，隨著酶解時間的延長，蛋白提取率逐漸降低，從83.72%下降到73.08%，下降了10.64百分點，而核桃蛋白純度呈先顯著增加后趨于穩定的趨勢，特別是在酶解時間30 min之后，蛋白純度不再增加。這可能是由于初始酶解時，核桃蛋白的溶出速率較大，但隨著酶解時間的延長，整個體系黏度增大，未溶出的核桃蛋白在傳質過程中受到黏度的牽制，其溶出速率減慢，糖化酶酶解達到飽和后蛋白純度不再提高。酶解30 min時，蛋白純度為83.64%，而提取率為79.48%，也相對較高。因此，綜合考慮選擇最佳酶解時間為30 min。

2.1.5 酶解pH對蛋白提取率和蛋白純度的影響

取8.0 g核桃蛋白，在加酶量80 U/g、料液比1∶10、酶解溫度60℃、酶解時間30 min的條件下，調節酶解pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，探究酶解pH對核桃蛋白提取率和蛋白純度的影響，結果如圖5所示。

圖5 酶解pH對蛋白提取率和蛋白純度的影響

由圖5可見，隨著酶解pH的增大，核桃蛋白提取率和蛋白純度都呈先上升后下降的趨勢，兩者都在pH為4.0時達到最大，分別為83.72%和82.64%。這可能是由于糖化酶的最適pH在4.0左右，pH過高或過低都會降低糖化酶的活性，導致蛋白提取率和純度下降。因此，選擇pH 4.0為最佳酶解pH。

2.2 核桃蛋白純化的正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇酶解溫度(A)、酶解pH(B)、酶解時間(C)、加酶量(D)和料液比(E)5個因素為考察對象，蛋白純度為指標，設計L16(45)正交實驗優化酶解工藝參數，正交實驗設計及結果見表1。

表1 正交實驗設計及結果

由表1可知，5個因素對蛋白純度影響大小順序為A>C>B>D>E，即酶解溫度>酶解時間>酶解pH>加酶量>料液比。

蛋白純度直觀圖如圖6所示。由圖6可知：酶解溫度以55℃最佳；酶解pH以4.0最佳；酶解時間以40 min最佳；雖然圖中加酶量100 U/g最佳，但與80 U/g的結果相差不大，且通過極差分析發現，加酶量對蛋白純度的影響不大，從節約資源的角度出發，加酶量以80 U/g最佳；料液比以1∶8最佳。因此，理論最優方案為A2B2C3D2E1。通過3次平行實驗發現，理論最優方案的蛋白純度為93.86%，蛋白提取率為91.06%，略差于實驗組的最優方案A2B4C3D2E1下的結果(蛋白純度為94.37%，蛋白提取率為91.77%)。因此，以實驗組的條件為最優方案，即酶解溫度55℃、酶解pH 5.0、酶解時間40 min、加酶量80 U/g、料液比1∶8，在此條件下蛋白純度可達到核桃分離蛋白的標準。

圖6 蛋白純度直觀分析趨勢圖

2.3 核桃分離蛋白與低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成與功能特性比較

2.3.1 氨基酸組成比較

為了進一步驗證制備的核桃分離蛋白品質，將最優條件下制備的核桃分離蛋白與僅由核桃仁脫脂制備的低變性核桃蛋白粉進行比較。核桃分離蛋白與低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成比較結果見表2。

表2 核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成及含量 g/100 g

由表2可知，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成都較為全面，均含有7種人體必需氨基酸(色氨酸未測)，證明了核桃是一種優質的蛋白來源。其中，核桃分離蛋白的氨基酸總量高達94.93 g/100 g，必需氨基酸含量為22.29 g/100 g，均高于低變性核桃蛋白粉(氨基酸總量52.33 g/100 g，必需氨基酸含量16.49 g/100 g)。此外，對人體有著重要生理功能的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量均高于低變性核桃蛋白粉。

2.3.2 持水性比較

核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉隨著溫度變化的持水性比較如圖7所示。由圖7可知，隨著溫度的升高，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的持水性都先上升后下降，在溫度為50℃時，持水性都達到最大值，分別為3.72 g/g和1.83 g/g。對于核桃蛋白樣品而言，溫度升高會增加蛋白質分子的延展性，利于水分的吸收；但當溫度持續升高后，蛋白質的熱變性程度增加，蛋白質分子的氫鍵和離子基團水合作用減弱，使其吸水性降低。而在相同溫度條件下，核桃分離蛋白的持水性始終優于低變性核桃蛋白粉。說明經過糖化酶純化后，核桃分離蛋白的持水性得到了提升。

注：圖中同一曲線不同字母表示差異顯著(p<0.05)。下同圖7 核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的持水性比較

2.3.3 吸油性比較

核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉隨著溫度變化的吸油性比較如圖8所示。由圖8可知，隨著溫度的升高，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉吸油性都先上升后下降。而核桃分離蛋白的變化程度明顯大于低變性核桃蛋白粉，在溫度為50℃時，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的吸油性都達到最大值，分別為1.57 g/g和0.62 g/g。對于核桃蛋白樣品而言，當溫度高于50℃時，油脂黏度下降，流動性增大，蛋白質分子間的吸附作用減弱，吸油性變差。而在相同溫度條件下，核桃分離蛋白的吸油性始終優于低變性核桃蛋白粉。說明經過糖化酶純化后，核桃分離蛋白的吸油性得到了提升。

圖8 核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的吸油性比較

2.3.4 乳化性比較

核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉隨著pH變化的乳化性比較如圖9所示。由圖9可知，隨著pH的增加，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的乳化性都呈先略微下降后顯著上升的趨勢。而核桃分離蛋白的上升程度明顯大于低變性核桃蛋白粉，在pH為9.0時，核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的乳化性都達到最大值，分別為57.60%和21.22%。蛋白質分子中存在大量親水或親油的基團，這些基團在乳化體系形成過程中起到了乳化作用，核桃蛋白的等電點在5.0左右，當溶液體系接近等電點時，蛋白質分子所帶電荷為零，蛋白質表面無法形成水化層，使得乳化粒子發生絮凝和聚集作用，乳化性能降低；當溶液體系在非等電點時，蛋白質溶解性增加，乳化程度升高。而在相同pH條件下，核桃分離蛋白的乳化性始終優于低變性核桃蛋白粉。說明經過糖化酶純化后，核桃分離蛋白的乳化性得到了提升。

圖9 核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的乳化性比較

3 結 論

本研究采用糖化酶酶解純化核桃蛋白制備核桃分離蛋白。通過單因素實驗，分析加酶量、料液比、酶解溫度、酶解時間和酶解pH 5個因素對核桃蛋白提取率和純度的影響，并采用正交實驗優化了工藝條件，最終得到了最佳工藝條件為加酶量80 U/g、料液比1∶8、酶解溫度55℃、酶解時間40 min、酶解pH 5.0，在此條件下蛋白純度為94.37%，符合核桃分離蛋白標準。通過比較核桃分離蛋白和低變性核桃蛋白粉的氨基酸組成及功能特性發現，核桃蛋白的氨基酸組成全面，含有7種人體必需氨基酸，且核桃分離蛋白的氨基酸總量和必需氨基酸含量均高于低變性核桃蛋白粉，且核桃分離蛋白產品持水性(3.72 g/g)、吸油性(1.57 g/g)和乳化性(57.60%)皆優于低變性核桃蛋白粉，說明制備的核桃分離蛋白具有良好的品質及功能特性。