白藜蘆醇基于PI3K/Akt通路對人結腸癌細胞HCT-116凋亡的影響

郎超

（山西藥科職業學院，山西太原 030031）

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種廣泛存在于花生、葡萄等植物中的天然多酚類化合物，是植物在受到外界刺激時自身合成的一種植物抗毒素，可用于對抗外傷、細菌、感染、紫外線等外界壓力。1940年，日本人Tokaoka首次從毛葉藜蘆的根中分離得到白藜蘆醇，目前多項研究表明白藜蘆醇具有抗氧化、改善微循環、抗炎等廣泛的生物活性和藥理學特性[1-3]。

近年來的研究還證實白藜蘆醇能夠通過調節腫瘤細胞內多種靶點和信號途徑表現出明顯的抗腫瘤作用[4-7]。PI3K/Akt信號通路廣泛參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、代謝、侵襲等活動，故其在腫瘤細胞中常會過度表達或被異常激活[8]。白藜蘆醇可通過調節細胞內PI3K/Akt信號通路進而調控下游分子影響細胞的增殖[9]。因此，本研究選取PI3K/Akt信號通路研究白藜蘆醇對人結腸癌細胞HCT-116凋亡的影響及其相關分子機制，為相關疾病的治療提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

白藜蘆醇、DMSO、MTT試劑，Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；F-12/DMEM培養基，美國Gibco公司；1%青-鏈霉素，北京索萊寶科技有限公司；10%胎牛血清，生工生物工程（上海）股份有限公司；細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；Caspase-3、PI3K、Akt和β-actin抗體，美國CST公司；Bcl-2、Bax抗體，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 主要儀器

Galaxy 170 S二氧化碳培養箱，德國Eppendorf公司；MX2型微孔板振蕩器，韓國FINEPCR公司；Infinite F50型酶標儀，瑞士Tecan公司；TG-16型離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BD FACSCalliburⅡ型流式細胞儀，美國BD公司；PowerPac HC型電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養

HCT-116（人結腸癌上皮細胞株）接種于加有10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的F-12/DMEM培養基中，置于37 ℃、濕度飽和及5% CO2培養箱中培養，觀察細胞生長情況定時換液。

1.4 MTT實驗

選取對數生長期的HCT-116細胞，以每孔2×103個接種于96孔板中，觀察其貼壁后，設置對照與不同濃度（25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）的白藜蘆醇組，每組設5個復孔。分別孵育12 h、24 h、36 h后取出，每孔更換100 μL新鮮培養基，再加入20 μL MTT（5.0 mg/mL），繼續培養4 h。于避光環境下，棄去培養液，加DMSO 150 μL，低速震蕩10 min。

使用酶標儀在570 nm波長處測得各孔的吸光度。按照公式（1）計算不同濃度白藜蘆醇對細胞增殖的抑制率，實驗重復3次。

式中，At為t實驗組吸光度平均值，A0為對照組吸光度平均值。

1.5 細胞凋亡檢測

選取對數生長期的HCT-116細胞，以每孔1×105個接種于6孔板中，觀察其貼壁后，設置對照與不同濃度（50 μmol/L、100 μmol/L）的白藜蘆醇組，培養24 h，收集細胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入1×結合緩沖液100 μL重懸細胞沉淀，并轉移至流式細胞管中，加Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光染色15 min；加入 1×結合緩沖液400 μL，流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC熒光通道為FL1-H，PI熒光通道為FL2-H，獲取細胞數量為15 000個/樣，不足15 000個收取全部細胞；最后于流式細胞儀上機檢測，結果用FlowJo 10.8.1軟件分析，統計細胞凋亡百分率。

1.6 Western Blot實驗

將不同濃度白藜蘆醇處理過的HCT-116細胞收集起來，裂解提取蛋白，BCA法測得蛋白濃度后制樣。取20 μL樣品進行SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。接對應蛋白一抗4 ℃孵育過夜，接二抗室溫孵育2 h。將雜交膜上多余抗體清洗干凈后，滴加發光液曝光定影，條帶記錄相應蛋白表達情況。以β-Actin作為內參，用Image J 1.8.0進行灰度分析。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇對HCT-116細胞增殖的抑制作用

通過MTT實驗檢測了白藜蘆醇對HCT-116是否存在增殖抑制效應，如圖1所示。與對照組相比，隨著作用時間的延長及白藜蘆醇濃度的增大，細胞增殖抑制率明顯升高，且各組差異具有統計學意義（P＜0.05），表明白藜蘆醇對HCT-116細胞的增殖抑制存在濃度和時間依賴。

圖1 白藜蘆醇對HCT-116細胞增殖的影響

2.2 白藜蘆醇對HCT-116細胞凋亡的影響

用流式細胞儀檢測白藜蘆醇對HCT-116細胞是否存在促凋亡效應，結果如圖2所示。對照組HCT-116細胞的凋亡率為2.61%（早期凋亡0.54%，晚期凋亡2.07%）；實驗組隨白藜蘆醇濃度增高，HCT-116細胞凋亡率增加，50 μmol/L和 100 μmol/L白藜蘆醇組HCT-116細胞凋亡率分別為16.80%（14.70%+2.10%）、43.98%（39.10%+4.88%），分別較對照增加14.19個百分點和41.37個百分點。結果表明，白藜蘆醇可有效促進HCT-116細胞凋亡。

圖2 不同濃度白藜蘆醇對HCT-116細胞凋亡的影響

2.3 白藜蘆醇對HCT-116細胞內凋亡相關蛋白表達的影響

經 25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 白藜蘆醇處理24 h后，HCT-116細胞內Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達情況如圖3所示，Akt、PI3K的表達量如圖4所示?；叶确治鼋Y果表明（圖5），與對照組相比，實驗組HCT-116細胞中Caspase-3的表達明顯上調（P＜0.05），Bcl-2表達量顯著下調（P＜0.05），Bax的表達明顯上調（P＜0.05），且呈濃度依賴關系。與對照組相比，p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K比值均顯著降低，差異具統計學意義（P＜0.05）。PI3K/Akt通路的激活對下游的抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax有明顯影響[10]，Bcl-2和Bax之間的平衡對細胞凋亡的調控起關鍵作用[11]。說明白藜蘆醇有效抑制了PI3K/Akt通路的激活，并影響促凋亡蛋白Bax高表達，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，介導HCT-116的凋亡誘導效應。

圖3 白藜蘆醇對HCT-116細胞內Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達影響

圖4 白藜蘆醇對HCT-116細胞內Akt、PI3K蛋白表達及磷酸化的影響

圖5 白藜蘆醇對HCT-116細胞內相關蛋白表達的灰度分析圖

3 結論

本研究初步探討了白藜蘆醇基于PI3K/Akt通路對HCT-116細胞凋亡的影響。結果發現，白藜蘆醇可通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活，在腫瘤細胞內有效上調Caspase-3和Bax的表達并下調Bcl-2的表達，從而誘導腫瘤細胞發生凋亡，且其作用效果呈濃度和時間依賴性，為白藜蘆醇抗腫瘤機制的研究提供了新的參考。