關中奶山羊睪丸不同發育階段代謝物的差異分析

王 廣，鄒家浩，張永濤，李德嫻，李雪清，余夢琦，陳 璐，袁宇欣，李 廣

(西北農林科技大學動物科技學院，奶羊產業技術創新實驗室，楊凌 712100)

睪丸作為雄性性腺，具有生精和內分泌作用，其功能障礙易造成性功能減退或不育[1]，一方面導致公畜繁殖力低下，生產效益降低；另一方面，也會引起雄性不育。影響關中奶山羊生殖功能的因素較多，布氏桿菌病、空氣污染、電離輻射、慢性炎癥、睪丸炎等均有生殖毒性，可影響關中奶山羊的生殖器官和精液品質，最終導致不育，從而極大程度上制約了關中奶山羊的精準繁育。近年來，隨著分子細胞生物學技術的發展及其在生殖醫學領域的廣泛應用，包括睪丸功能在內的雄性生殖生理研究有了長足的發展，一些以前無法確診的疾病找到了病因，雄性不育的治愈率也有所提升。但是目前睪丸功能的檢查技術主要包括形態檢查、睪丸活檢和透光試驗等[1-2]，過程較為復雜，也缺乏相應的生物標志物，使其在臨床實踐中的應用受到了很大的限制。代謝組學是探究代謝物動態變化與疾病發生關系的一門新興學科，代謝物作為生化反應的終點，體現了生物功能的最終效應，直接指示異常的生理狀態，可作為疾病發生的標志物[1，3]。利用代謝組學研究睪丸的生理病理特征，不僅可以促進雄性生殖生理的研究，而且可以加快睪丸生物標志物的篩選，有利于促進相關疾病的診治。通過代謝組學研究發現，在睪丸支持細胞中煙堿酸、煙酰胺、肉堿、磷酸腺苷、谷氨酰胺均有顯著變化[4-5]，在不孕癥患者精液中乙酰肉堿、胞苷和尿苷水平顯著降低，溶血磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺水平顯著上升[1，6-7]。Ebrahimi等[8]采用NMR和HPLC技術對口服東革阿里后大鼠的精子數量進行代謝組學分析發現，在精子數量增加的大鼠尿液中檢測到較高濃度的丙氨酸和葫蘆巴堿，而乙醇濃度顯著降低，東革阿里中的苦味素通過增強睪丸間質細胞睪酮類固醇生成或降低乙醇含量來促進精子發生。

睪丸的發育是一個漸進的生理過程，睪丸是雄性畜禽最重要的生殖器官之一，其發育進程與精子發生過程密切相關。關中奶山羊是陜西關中地區的優良奶山羊品種，關中奶山羊一般在1月齡斷奶，在24月齡達到體成熟；1月齡曲精細管內生殖母細胞排列疏松，精母細胞尚未形成，24月齡各級精母細胞、精子大量形成，精母細胞附于基膜。在生產實踐中，關中奶山羊睪丸發育不良往往產生少精、弱精、畸形精和無精癥狀，給關中奶山羊產業帶來很多不必要的損失。目前，從代謝組學角度探討關中奶山羊睪丸發育代謝機制的研究較少。鑒于此，本試驗采用非靶向代謝組學(液相色譜-質譜(LC-MS))技術對斷奶期(1月齡)和體成熟期(24月齡)的關中奶山羊睪丸組織進行了代謝組學比較分析，以期從代謝組學方面揭示關中奶山羊睪丸的發育機制，為今后深入探究睪丸正常生精功能的維持、繁殖障礙疾病的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取同一養殖環境下1月齡(G1組)和24月齡(G24組)健康的雄性關中奶山羊共12只，每組6只，用手術去勢法分別采集睪丸組織，立即用生理鹽水洗去表面血漬，并將提取好的睪丸組織放入滅菌瓷盤中，于超凈臺下對睪丸組織進行切割，將處理好的睪丸樣本迅速放入預冷好的、無酶的、耐―196 ℃超低溫的10 mL凍存管內，將封裝好的睪丸樣本凍存管投入液氮速凍3 h后取出，放入―80 ℃保存備用，將其中來源于相同年齡段的6個睪丸組織樣本，視為生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 使用天平精確稱取30 mg組織樣品放入1.5 mL EP管內，加入20 μL內標(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配制)，加入400 μL甲醇-水溶液(CH3OH∶H2O=4∶1，V/V)，加入2個小鋼珠，―20 ℃預冷2 min后，放入研磨機中研磨(60 Hz，2 min)；冰水浴超聲萃取10 min，―20 ℃靜置10 min；4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取300 μL上清液裝入LC-MS進樣小瓶中揮干；用300 μL甲醇-水溶液(CH3OH∶H2O=1∶4，V/V)復溶(渦旋30 s，超聲3 min)；―20 ℃靜置約2 h；4 ℃、13 000 r/min離心10 min，用注射器抽取150 μL上清液，通過0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，移送到LC進樣小瓶，完成LC-MS分析；質控樣本(QC)由每個樣品的提取液等體積混合后配制而成，每個QC的總體積與樣品大小一致，且每個提取試劑使用前均在―20 ℃進行預冷。

1.2.2 代謝組學數據采集 本研究使用由Dioex U3000與UHPLC超高效液相串聯QE plus超高液相質譜儀所構成的液質聯用體系，并配備了加熱電噴霧離子源ESI(賽默飛世爾科技公司)，樣品質譜信息收集部分使用ESI正負離子掃描模式。色譜柱條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫為45 ℃，流速為0.35 mL/min，進樣容積2 μL，流動相A為水(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈(含0.1%甲酸)。通過梯度式洗脫程序實現分離：5% B 0.01 min；5% B 2 min；30% B 4 min；50% B 8 min；80% B 10 min；100% B 14 min；100% B 15 min；5% B 15.1 min；5% B 16 min。全部樣品分析過程中保持在4 ℃，質量范圍在100～1 000質荷比(m/z)。全譜掃描的分辨率為70 000，HCD質譜/質譜掃描的分辨率為17 500，瀏覽碰撞能量分別設為10、20和40 eV。

質譜儀的工作方式為：噴霧電壓為3 800 V(+)和3 200 V(-)，護套氣流量，任意40個裝置；輔助氣流量，任意8個單元；毛細血管溫度為320 ℃；探針加熱器溫度為350 ℃；S-透鏡射頻電平為50 Ω。在整個分析過程中，定期為每個樣本注射QC，為每個樣本提供一組數據，從而可以評估可重復性。

1.3 數據統計分析

原始LC-MS數據由Progenesis QI v 2.3軟件處理(紐卡斯爾非線性動力學公司)，用于基線濾波、峰值識別、積分函數、保留時間校準、峰值校準和標準化。主要參數為：5 ppm前體耐受性、10 ppm產物耐受性和5%產物離子閾值?；衔镨b定采用了精確的質荷比、二級片段和同位素分布，使用人代謝組數據庫(HMDB)、Lipidmaps v 2.3、Metlin、EMDB、PMDB和自建數據庫進行定性分析。通過去除組中50%的缺失值(離子強度=0)的任何峰，將零值替換為最小值的1/2，并通過對化合物的定量分析結果進行檢測，以進一步處理提取的數據，結果總分低于36分(滿分60分)的化合物也被視為不準確并被刪除。數據矩陣由正、負離子數據組合而成。

將所得數據矩陣輸入SIMCA 14.0軟件系統(Umetrics AB公司)完成模式識別，先使用無監督的主成分分析(PCA)來研究各樣品中間的總體布局和整體解析流程的運動穩定性，再使用有監督的偏最小二乘法分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)來區分各組所有中間代謝結構輪廓的總體差異性，從而發現2組的差異代謝物。根據Fiehn數據庫對代謝物進行分配，并計算2組差異代謝物的FoldChange值，經過log2轉換后，log2FoldChange>0表示上調，log2FoldChange<0表示下調；通過-log10P-value計算自由差異代謝物的原始P值，-log100.05=1.30，-log10P-value>1.30為顯著性差異，-log10P-value<1.30為無顯著性差異。試驗通過多維和單維分析方法相結合的方式來檢測區域間的不同代謝物，利用Pearson相關系數衡量不同代謝物間的線性相關程度，并對差異代謝物進行通路富集分析，檢測準則為：OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1，t檢驗的P<0.05。

2 結 果

2.1 多元統計分析

表1 G1和G24組間多元統計分析結果

A，PCA得分圖；B，PLS-DA得分圖；C，OPLS-DA得分圖；D，響應排序檢驗圖

2.2 單變量統計分析

由圖2可知，右邊矩形區域的點表示代謝物表達上調，左邊矩形區域的點表示代謝物表達下調，下方矩形區域的點表示代謝物表達沒有顯著性差異，在1(G1)和24(G24)月齡關中奶山羊睪丸組織中共篩選出334個差異代謝物，其中137個顯著上調，197個顯著下調(圖3)。

圖2 所有代謝物的火山圖

圖3 所有代謝物的層次聚類分析熱圖

2.3 差異代謝物的篩選與鑒定

通過OSI/SMMS結合HMDB、Lipidmaps和Metlin三大數據庫來確定差異代謝物，通過差異代謝物熱圖、VIP及P值篩選差異代謝物火山圖，選出前36個差異代謝物，G1和G24組差異代謝物主類包括21個脂質和類脂質分子、6個有機酸及其衍生物、6個未分類的衍生物、3個苯丙烷和聚酮化合物。其中，脂質和類脂質分子包括16個甘油磷脂、2個鞘脂、2個脂肪?；?、1個聚酮化合物；有機酸及其衍生物包括4個羧基及其衍生物、1個有機雜環化合物、1個有機氮化合物；未分類的衍生物包括6個無類別的化合物；苯丙烷和聚酮化合物包括1個3,4-二氫香豆素、2個肉桂酸及其衍生物(表2)。

表2 G1和G24組前36種顯著差異代謝物

續表

2.4 差異代謝物的相關性分析

利用Pearson相關系數可以衡量2個代謝物之間的線性相關程度，根據VIP值大小選取前50個差異代謝物進行可視化分析1和24月齡關中奶山羊睪丸代謝物之間的相關性，范圍為―1.0(最大負相關)～1.0(最大正相關)，0表示沒有相關性。由圖4可知，在1和24月齡關中奶山羊睪丸發育過程中，脂質和類脂質分子與甘油磷脂呈最大正相關，羧基及其衍生物與甘油磷脂呈最大負相關。

矩形外，正相關；矩形內，負相關；不同大小的圓圈表示Pearson系數的相關性

2.5 代謝通路的富集分析

通過對前20個差異代謝物的KEGG ID與代謝物生物學(MBROLE)途徑分析，富集了睪丸組織發育代謝過程中潛在的差異代謝通路。由圖5可知，-log10P-value>1.5的代謝通路是試驗中最關鍵的通路，在這些代謝途徑中，生物模塊參與的極顯著代謝通路有7條，分別為腫瘤中的膽堿代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、腫瘤中的中心碳代謝、精氨酸生物合成、鐵死亡、GABA能突觸和蛋白質消化吸收(P<0.01)；生物模塊參與的顯著代謝通路有11條，分別為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、近端小管碳酸氫鹽再生、氨酰-tRNA生物合成、甘油磷脂代謝、ABC轉運蛋白、?；撬岷蛠喤；撬岽x、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、mTOR信號通路和細胞凋亡(P<0.05)。

圖5 前20條代謝通路富集圖

經差異代謝物富集分析，從1和24月齡關中奶山羊睪丸發育代謝通路發現7條關鍵通路，分別為腫瘤中的膽堿代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、腫瘤中的中心碳代謝、鐵死亡、谷胱甘肽代謝、氨酰-tRNA生物合成、?；撬岷蛠喤；撬岽x(表3)。

表3 G1和G24組睪丸發育代謝的潛在通路

3 討 論

睪丸的生長發育和功能完善受到體內外許多重要因素的影響，如哺乳動物的遺傳特點、飼養管理方式、營養水平和內分泌代謝方式等，而這些因素的改變通常都會通過作用于機體的重要基因而起到生物學作用[9-10]。本研究發現，睪丸生長發育成熟、功能完善前后的代謝物有顯著變化?；蚪M組學和蛋白質組學分別是從基因和蛋白質層面探尋生命的活動，而實際上細胞內許多生命活動是發生在代謝物層面的[11]，如細胞信號釋放、能量的傳導、細胞間通信等都是受代謝物控制的。代謝組學是繼基因組研究和蛋白質組學后新發展起來的又一個學科，是系統生理學的主要部分，之后得以快速發展和滲入許多應用領域，如動物健康及其發育機理等。代謝組學中最常見的分析方法還有核磁共振光譜(NMR)、氣相色譜-質譜(GC-MS)和LC-MS[12-13]。通常GC-MS用于分析小分子質量的揮發性化合物，而LC-MS用于分析小分子質量的非揮發性化合物[14]。目前，LC-MS技術已是生物代謝組學分析中比較完善的技術手段之一，其對樣本前處理也較為簡單，且檢測到的代謝物多為有機酸、氨基酸、核苷酸及某些脂類[15-16]。近年來，對睪丸的研究重點集中在小鼠、豬、牦牛和人的睪丸基因組、轉錄組及蛋白質組分上[17-24]，但目前在關中奶山羊睪丸代謝組層面其發育機理尚不明確。

本試驗分析了1和24月齡關中奶山羊睪丸生長發育過程中差異代謝物的變化，共鑒定出334個差異代謝物，組間差異均有生物學意義，其中顯著上調137個，顯著下調197個；進一步篩選出前36個顯著差異代謝物，分別為脂質和類脂質、有機酸及其衍生物、未分類的化合物、苯丙烷和聚酮化合物四大類。其中，脂質和類脂質變量的權重數值最大，主要參與細胞外生長過程和分子物質信息的傳遞功能，脂質和類脂質缺失也會引起細胞膜受損，而磷脂中所含的乙?；鶊F深入到中樞神經細胞間隙與膽堿相互作用，從而產生乙酰膽堿，乙酰膽堿也是向各類中樞神經細胞間傳送信息的重要分子物質[25]，而有機酸及其衍生物則有著促進細胞生長發育的重要作用，苯丙烷的表達水平和功能直接關系到動物的免疫能力和生長發育的平衡，聚酮化合物則利用多級或級聯式傳遞程序引發細胞的生長發育、繁殖、分裂、凋亡等生物學過程，并同時參與炎癥、腫瘤等病理過程[26]，此外，它還與RAS、PI3K、Akt等生物學信號系統有著廣泛聯系。

本研究中，在1和24月齡關中奶山羊睪丸發育過程中，脂質和類脂質分子與甘油磷脂呈最大正相關，羧基及其衍生物與甘油磷脂呈最大負相關，表明脂質和類脂質分子在睪丸發育過程中具有促進作用，羧基及其衍生物具有一定的頡頏和平衡作用，脂質和類脂質、有機酸及其衍生物、苯丙烷和聚酮化合物均能影響睪丸組織的免疫能力和生長發育的代謝。本試驗富集到7條潛在的關鍵代謝通路，涉及氧化應激、能量代謝、細胞凋亡三大塊，分別為腫瘤中的膽堿代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、腫瘤中的中心碳代謝、鐵死亡、谷胱甘肽代謝、氨酰-tRNA生物、?；撬岷蛠喤；撬岽x。曾婷等[27]研究指出，谷胱甘肽代謝、脂質代謝和鐵代謝都與鐵死亡的發生密切相關。在本試驗關中奶山羊睪丸發育代謝過程中，谷胱甘肽代謝通路和鐵死亡通路的發生也同時存在，與前人研究結果一致。Hara等[28]研究發現，精氨酸和脯氨酸代謝過程中ArgⅡ酶表達量很少，主要在哺乳動物外周組織(包括神經元、腎臟、血管和肌肉細胞)中表達為線粒體蛋白，對一氧化氮、脯氨酸和多胺的合成具有重要的調控作用[29]。本試驗中，精氨酸和脯氨酸代謝發生在睪丸組織代謝過程中，且精氨酸和脯氨酸代謝通路極顯著，說明精氨酸對脯氨酸的合成有一定的調控作用。因此，在1～24月齡關中奶山羊發育代謝過程中，這7條潛在的代謝通路可為后續研究哺乳動物睪丸、精子的發育及治療雄性繁殖障礙疾病提供參考依據。

4 結 論

本研究共篩選出334個差異代謝物，其中顯著上調137個，顯著下調197個；并篩選出前36種顯著差異代謝物，分別為脂質和類脂質分子、有機酸及其衍生物、未分類化合物、苯丙烷和聚酮化合物四大類。對不同代謝物進行富集分析得到7條關鍵代謝通路，可能是睪丸發育過程的潛在代謝通路。