葡萄根癌病研究進展及防治措施

袁麗芳，尹向田，王鵬飛，李廷剛，蔣錫龍，湯小寧，韓金濤*，魏彥鋒*

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2. 山東省農藥科學研究院，山東濟南 250100）

我國是葡萄大國，2020年栽培面積達76.75萬 hm2，排世界第二位。葡萄根癌病是常見的細菌性病害，在我國葡萄產區發生普遍，主要為害樹體主干，影響樹體健康生長，給葡萄產業帶來了巨大損失。

葡萄根癌病由葡萄土壤桿菌（Allorhizobium vitis）引起，植株染病后生長衰弱、葡萄品質下降，產量降低，嚴重者植株死亡[1-3]。此外，該病原多從傷口進行侵染，因此葡萄嫁接苗存在感病風險，若用帶菌苗木建園，一旦發病只能銷毀。對葡萄根癌病進行快速診斷和檢測是進行有效預防的前提，目前農業防治和生物防治是防治該病的首要方法。本文對國內外葡萄根癌病的研究進展進行綜述，并提出常規防治措施，以期為葡萄根癌病的后續研究提供幫助。

1 危害及田間癥狀

葡萄根癌?。ㄒ卜Q冠癭病，crown gall disease）是葡萄生產中的一種毀滅性細菌病害，給世界范圍內的葡萄育苗基地和種植園帶來巨大的經濟損失[3-5]。在我國東北、華北、西北、黃河及長江流域地區均有根癌病發生，部分葡萄園發病率高達80%～90%，產量損失30%～70%，嚴重時甚至絕收[4-5]。

葡萄根癌病的典型癥狀是形成腫瘤[6-7]。該病的病原菌主要存活在病殘體或土壤中，通過傷口侵入植物體內，由木質部進行傳輸到達植物細胞，使細胞產生過量的生長激素，從而形成瘤狀物[8]。葡萄幼苗期，在嫁接部位可形成大小不一的瘤狀物，初期為黃豆粒大小，外皮綠色，隨著瘤狀物逐漸膨大呈現直徑數厘米的球形，表面粗糙，內部組織逐漸木質化，后期顏色變為褐色或深褐色。隨著葡萄樹齡的增加，除主干外，瘤狀物可出現在主枝、側枝和結果母枝上[3]。此外，根癌病病原菌可破壞葡萄植株根冠對水和礦物質的吸收，影響植株形成層和維管束對營養的運輸，導致植株營養不良，枝梢干枯，嚴重時可導致藤蔓死亡。

2 病原菌

2.1 病原菌的種類及分類

土壤桿菌包括根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、發根土壤桿菌（A. rhizogenes）、懸鉤子土壤桿菌（A. rubi）和葡萄土壤桿菌（A. vitis）[5,9-10]。當菌株攜帶腫瘤誘導質粒（tumor-inducing plasmid, Ti plasmid，Ti質粒）時就引起根癌病。根據根瘤中誘導產生冠癭堿的類型，Ti質?？煞譃檎卖~堿型（octopine）、章魚堿/黃瓜堿型（octopine/cucumopine）、胭脂堿型（nopaline）、農桿堿型（agropine）和vitopin型[3]。目前，基于基因組信息恢復并修訂了土壤桿菌屬（Agrobacterium）和其它根瘤菌屬（Allorhizobium）的分類地位，根癌土壤桿菌和懸鉤子土壤桿菌屬于土壤桿菌屬，發根土壤桿菌劃歸在根瘤菌屬（Rhizobium）。葡萄土壤桿菌（Allorhizobium vitis），之前命名為Agrobacterium vitis、Agrobacterium biovar 3、Rhizobium vitis，被重新劃分為異根瘤菌屬（Allorhizobium）[10-14]。

葡萄根癌病的病原菌主要是不同冠癭堿類型的葡萄土壤桿菌[15-17]。在少數情況下，根癌土壤桿菌和發根土壤桿菌也可以引起葡萄根癌病[18-22]。葡萄土壤桿菌最初由Ophel和Kerr于1990年定名為Agrobacterium vitis，該病原菌分布廣泛，許多國家包括澳大利亞[23]、保加利亞[24]、德國[25]、意大利[4]、日本[26]、塞爾維亞[27]、西班牙[28]、美國[29]、俄羅斯[30]和摩洛哥[31]等，均分離鑒定到該病原菌。在我國山東、河北及新疆等地區引起葡萄根癌病的病原菌為葡萄土壤桿菌章魚堿型[32-34]。

2.2 形態特征及生理生化特性

葡萄根癌病是革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，大小為0.8～1.0 μm×3.0 μm，具周生鞭毛；菌落乳白色，圓形，邊緣整齊。最適生長溫度28 ℃，高于37 ℃不能生長，可在pH4～10范圍生長，耐受0～3%的NaCl[35]。不同于根癌土壤桿菌和發根土壤桿菌，該病原菌多數可在pH4.5條件下分解果膠，但在pH7條件下缺乏運動性（表1）[32,36]。

表1 葡萄土壤桿菌、根癌土壤桿菌和發根土壤桿菌的生理生化特性Table 1 Comparative analysis of physiological and biochemical characteristics of A. vitis with A. tumefaciens and A. rhizogenes

2.3 基因組信息

目前，全基因組測序的葡萄土壤桿菌菌株共有9株，分別是S4、VAR03-1、VAT03-9、F2/5、CG412和VAR06-30等（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/1215/）。葡萄土壤桿菌的基因組大小為5.57～6.32 Mb，包含有兩個環形染色體和1～5個質粒，GC含量為57.48%～58.61%。根癌土壤桿菌和發根土壤桿菌大多含有一個環形染色體和一個線性染色體，GC含量為58.92%～59.96%，與葡萄土壤桿菌相比較高（表2）[37]。葡萄土壤桿菌的Ti質粒大小約200 kb，GC含量56%～57%，包含轉運DNA（transferred DNA，T-DNA）、毒力區域（virulence region）、冠癭堿代謝基因（opine catabolism genes）、復制區（replication region）和可結合轉運的基因（conjugative transfer genes）[38]。Ti質粒屬于repABC質粒家族，含有兩套獨立的TypeIV分泌系統，第一個T4SS系統（vir）是負責將T-DNA從細菌轉移到宿主植物，而第二個系統（tra/trb）則介導Ti質粒的偶聯轉移。Ti質粒的結合轉移由群體感應（quorum sensing，QS）調控，受冠癭堿的產生而誘導。

表2 土壤桿菌基因組信息比較Table 2 Comparison of genomes information of Agrobacterium sp.

2.4 寄主范圍

土壤桿菌是引起植物根癌病的一種世界范圍內的致病菌，可以引起包括葡萄在內的93科331屬的643個種的植物根癌病[39-40]。根癌土壤桿菌可以侵染多種植物，包括葡萄、蘋果、櫻桃、獼猴桃、玫瑰、番茄等[41-44]；發根土壤桿菌可以侵染蘋果、梨、扁桃和櫻桃[45-48]；葡萄土壤桿菌主要侵染葡萄，還可以侵染香蕉，引起香蕉葉枯病[49]。葡萄土壤桿菌能在向日葵、煙草、蕃茄、曼陀羅、懸鉤子等幾種植物上形成癭瘤，通常采用這幾種植物為指示植物在溫室內做致病性測定[38]。

3 葡萄土壤桿菌的致病機理

通過傷口侵入寄主體內，將自身Ti質粒上的T-DNA整合到寄主細胞核DNA中，從而引發葡萄根癌病。葡萄土壤桿菌的致病能力主要由Ti質粒決定，Ti質粒包含4個保守的功能基因區：T-DNA區，包括致瘤基因區和冠癭堿合成相關基因區；毒性Vir區，包括Vir A、Vir B、Vir C、Vir D、Vir E、Vir F六個遺傳位點；Tra區，促使細菌質粒在細菌間的接合轉移和群體信號感應；rep區，參與質粒復制。T-DNA區的冠癭堿合成相關基因，包括章魚堿合成相關基因（ocs）、黃瓜堿型合成相關基因（cus）、胭脂堿合成相關基因（nos）、精氨酸合成相關基因（vis）和農桿菌素堿合成相關基因（acs），它們參與冠癭堿合成，為病原菌提供賴以生存、繁殖所必需的營養和能量；致瘤基因區基因調控生長素和細胞分裂素的合成，生長素的合成需要基因iaaM和iaaH參與，iaaM編碼色氨酸側鏈氧化酶（tryptonphan side-chain oxidase），催化色氨酸成吲哚乙酰胺（indoleacetamide,IAM）；iaaH編碼吲哚-3-乙酰胺水解酶，催化IAM成吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA），ipt是細胞分裂素合成的必需基因，在一些菌株中，T-DNA中不存在iaaM、iaaH和ipt，6b基因具有和iaaM等相似的功能，生長素和細胞分裂素的過量合成打破了寄主植物細胞內激素原有的平衡，導致植物細胞無限制地增生，進而形成腫瘤[38,41]。

表3 葡萄土壤桿菌的特異性引物信息Table 3 Specific primer information of A. vitis

此外，多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）和游動性是葡萄土壤桿菌所具有的特性，是該病原菌中非常重要的致病因子[50]。葡萄土壤桿菌可以產生多聚半乳糖醛酸酶，誘導葡萄根部壞死[18,51-52]；群體感應系統是細菌的一種調控機制，參與調控多種生理過程，包括營養或位點競爭、毒性基因的表達、細菌Ti質粒的接合轉移、細菌趨化性和運動性、生物膜的形成、定殖能力等。游動性葡萄土壤桿菌具有在葡萄上穩定定殖的重要機制，其游動性是由群體感應系統信號分子N-?；呓z氨酸內酯類（N-acyl-homoserine lactone signal molecules）所調控。研究表明，葡萄土壤桿菌aviR（屬于群體感應luxR家族）基因由于缺失突變體菌株喪失了表面游動性[53]。

4 葡萄土壤桿菌的鑒定及檢測

葡萄主要依靠扦插和嫁接的方式進行繁殖，帶菌的苗木是葡萄根癌病快速傳播的重要途徑。葡萄土壤桿菌主要生活在葡萄根冠及周圍土壤中，能在葡萄藤蔓上生存和繁殖。該病原菌通過木質部在葡萄體內擴展，對植株進行系統侵染。因此，快速準確的檢測技術是預防該病的前提。近些年，分子生物學檢測技術的快速發展為病原菌的檢測奠定了基礎。相比傳統的特異性檢測培養基，PCR檢測技術因具有快速、靈敏度高、特異性強等優點被廣泛應用?；赑CR檢測技術建立的葡萄土壤桿菌的檢測體系有特異性引物檢測，該技術可以定性鑒定葡萄土壤桿菌菌株[4,54-55]；熒光定量PCR（qPCR）檢測技術可以快速對葡萄土壤桿菌進行定性和定量分析，檢測用時短且靈敏度高、特異性強[4,56]；磁珠捕獲雜交定量PCR（Magnetic Capture Hybridization, MCH-qPCR）指DNA提取經磁珠捕獲雜交處理，檢測結果比直接進行熒光定量靈敏度提高1000倍[57-58]；數字微滴PCR（ddPCR）不依賴基因擴增循環數和內參基因即可確定基因拷貝數[59]；環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）檢測技術不需要精準的PCR儀，在恒溫水浴下即可完成，其檢測結果可進行可視化觀察[60]。Lim等[61]根據葡萄根癌病菌葡萄土壤桿菌的特異性DNA片段設計引物，利用巢式PCR進行檢測，其靈敏度為2 cfu·mL-1，能夠有效檢測土壤中的病原菌。Nguyen-Huu[62]設計了5對引物分別進行熒光定量PCR檢測，這5對引物均能特異地檢測出葡萄土壤桿菌，靈敏度為100 cfu·mg-1。施文驍[34]建立的LAMP技術可用于田間快速檢測，對葡萄土壤桿菌DNA的靈敏度為20 pg，60～90 min就可完成。

5 綜合防治

目前，葡萄根癌病最有效的防治措施是建立無病原菌的育苗基地，因為沒有特別有效的防治方法。植株一旦染病將導致減產、甚至植株死亡。近年來，針對葡萄根癌病主要通過農業防治和生物防治進行。

5.1 農業防治

建園時使用無毒苗木，避免引進帶病的種苗是預防根癌病的前提。選育無病苗木和栽植抗病品種是預防葡萄根癌病的重要途徑[63]。目前，鮮食葡萄中‘紅地球’‘玫瑰香’‘巨峰’等品種高度感病，‘龍眼’‘康太’等品種對根癌病有一定抗性；釀酒葡萄中‘霞多麗’‘赤霞珠’‘黑比諾’也有一定抗性。此外，根癌病抗性葡萄砧木有‘河岸2號’‘河岸6號’‘河岸9號’等[64-65]。因此，對葡萄根癌病菌的早期診斷，及時清除和銷毀病苗，并加強田間管理，增施有機肥和礦質營養，盡量避免在農事操作時造成傷口，都可以減少根癌病的發生。

5.2 生物防治

生物防治是根癌病的有效措施，非致病菌A.radiobacterK84可以有效防治不同寄主植物的根癌病，該菌產生的細菌素（農桿菌素）對根癌病菌有抑制作用，但是對于葡萄土壤桿菌引起的葡萄根癌病無防效[66]。無致病性的A. vitisE26、VAR03-1和ARK-1可作為生防菌來抑制土壤桿菌的生長和葡萄植株腫瘤的形成[67-78]。E26菌株可以穩定的產生細菌素，其在溫室和田間對葡萄根癌病有顯著的防治效果，并且對土壤環境及微生物無風險。分離自葡萄上的A. vitisF2/5能抑制致病的葡萄土壤桿菌，但同時可以引起葡萄根部壞死[69]。室內試驗表明，假單孢菌（Pseudomonasspp.）和水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilisHX2）可以抑制指示植物根瘤的形成[70]。此外，商品生防制劑枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisSR63和木霉菌Trichoderma asperellumT1可以有效抑制葡萄土壤桿菌。

多聚半乳糖醛酸酶可以降解葡萄木質部細胞壁的組成成分果膠[71]。近年來，有研究利用噬菌體的展示技術篩選分離出一種多肽SVTIHHLGGGS，該多肽可以緊密結合在葡萄土壤桿菌中的多聚半乳糖醛酸酶。室內試驗證明，該多肽可以降低多聚半乳糖醛酸酶活性35%[72]，效果顯著。此外，葡萄土壤桿菌不同菌株中效應蛋白（Tae4）和免疫蛋白（Tai4）變異較大，能否利用免疫蛋白進行病害防治還需后續研究[73]。