家蠶Piwi亞家族基因的克隆、表達及進化分析

劉飛玲，廖 珍，洪喜雄，彭睿智，肖花美*，李 飛

(1.宜春學院生命科學與資源環境學院，江西省作物生長發育調控重點實驗室，江西宜春 336000；2.浙江大學昆蟲科學研究所，杭州 310058；3.南京農業大學植物保護學院，南京 210095)

非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNA)一度被認為在生物體內無功能，隨著研究的深入，研究人員發現ncRNA在生物體內不可或缺，依據其生物起源、大小、長度和功能等，可將ncRNA分為microRNAs (miRNAs)、小干擾RNA (siRNAs)、piwi-RNAs (piRNAs)等，廣泛參與細胞增殖、分化、發育、繁殖、病毒防御等生理生化過程(Setoetal.,2007;Ku and Lin,2014;Ponnusamyetal.,2017;Ozataetal.,2019)。Argonaute蛋白家族是RNA沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的重要組成部分，在生物體內高度保守(Carmelletal.,2002;Jamesetal.,2005;Hocketal.,2007)，其組織特異性和定向性決定了不同非編碼RNA的表達和功能(Ponnusamyetal.,2017)。依據不同物種間的序列同源性和功能區域，Argonaute蛋白家族可分為AGO亞家族(與擬南芥ArabidopsisthalianaAGO1同源)、PIWI亞家族(與黑腹果蠅DrosophilamelanogasterPiwi同源)和WAGO亞家族。在細胞質中，AGO與miRNA和siRNA相互作用促進轉錄后基因的沉默(Valdmanisetal.,2012;Volleretal.,2016)。而piRNA 3′端甲基化修飾的2′-氧基團只與AGO家族的PIWI亞家族相結合，沉默轉錄元件(Coxetal.,1998;Girardetal.,2006;Klenovetal.,2011)，調控基因表達，在哺乳動物中還可以抑制逆轉錄轉座子的表達(Ponnusamyetal.,2017)。piRNA與PIWI在細胞質中結合后轉移至細胞核(Saitoetal.,2010)，形成的復合體根據定位以及伴侶蛋白的不同而產生不同的功能(Ponnusamyetal.,2017)，對于受精(Dingetal.,2013;Rooversetal.,2015)、維持生殖干細胞自我更新(Peteretal.,2005;Palakodetietal.,2008)、胚胎發育(Manietal.,2014;Navarroetal.,2015;Rooversetal.,2015)、神經突觸可塑性(Rajasethupathyetal.,2012)、代謝過程(Jonesetal.,2016;Henaouietal.,2017)、組織修復及再生(Rinkevichetal.,2010;Rizzoetal.,2014)等過程具有重要作用。

PIWI結構域是Argonaute蛋白中重要的功能結構域，位于Argonaute蛋白的羧基端，由400～600個氨基酸殘基組成。在哺乳動物(Aravinetal.,2006;Girardetal.,2006;Grivnaetal.,2006;Lauetal.,2006)、線蟲Caenorhabditiselegans(Batistaetal.,2008;Dasetal.,2008)、斑馬魚Daniorerio(Houwingetal.,2007)和昆蟲的性腺(Saitoetal.,2006;Vaginetal.,2006)中均能檢測到piRNA和PIWI，在哺乳動物的肺、心臟、肝、腎、腦、胰腺、卵巢、精巢中均有PIWI的表達(Setoetal.,2007;Ku and Lin,2014;Ponnusamyetal.,2017;Ozataetal.,2019)。在細胞質中，PIWI可以不通過piRNA的輔助，直接與受體或信號分子相互作用，調控轉錄后修飾進而調控靶標蛋白的生物功能(Zhangetal.,2012;Ponnusamyetal.,2017;Sivagurunathanetal.,2017;Tanetal.,2017)。Houwing等(2007)通過原位雜交發現，斑馬魚中的Piwi亞家族成員只在雌性成魚的生殖細胞中有表達，在不含有生殖細胞的睪丸中無Piwi亞家族的成員的表達。Williams和Rubin等(2002)發現黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中3個Piwi亞家族成員(Piwi、Aub、Ago3)也只在生殖細胞中表達，此外，Saito等(2006)通過Western blot等相關實驗也同樣證明黑腹果蠅中的3個Piwi亞家族蛋白只在精巢、卵巢和胚胎中表達，而在S2細胞中無表達。

目前對Piwi亞家族蛋白的研究主要集中于哺乳動物或模式生物，如黑腹果蠅、線蟲等。昆蟲占已知動物種類的60%以上，影響涉及醫學、經濟、農業等多個領域。但昆蟲Piwi亞家族基因的生物學研究大多局限于黑腹果蠅(Lin and Spradling,1997;Setoetal.,2007;Ewen-Campenetal.,2013;Ku and Lin,2014;Ponnusamyetal.,2017;Ozataetal.,2019)。本文克隆了家蠶BombyxmoriPiwi亞家族蛋白基因全長，并對全長轉錄本進行了生物信息學分析；研究了Piwi亞家族蛋白基因在家蠶各個發育階段和組織中的表達情況，為家蠶Piwi亞家族蛋白功能及piRNA的研究奠定基礎，為理解家蠶piRNA和Piwi互作對家蠶生殖調控提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蟲源：家蠶(品系：7091)由中國農業科學院蠶業研究所提供，在溫度26±1℃，相對濕度60%～75%，光周期16 L ∶8 D的條件下采用人工飼料及桑葉交替飼養。人工飼料購自山東省蠶業研究所煙臺綠寶蠶用飼料廠。

試劑：RNA提取試劑TRIzol?Reagent，RACE反應試劑GeneRacer Kit購自Invitrogen (美國)；Marker、Ex Taq DNA聚合酶、r-Taq DNA聚合酶、oligo (dT) 18、EcoRI限制性內切酶、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0以及熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex Taq(Prefect Real Time) (TakaRa,中國北京)均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；Plasmid Mini Kit I購自Omega Bio-Tek (美國)；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購自Axygen (美國)；M-MLV反轉錄酶和pGEM-T easy載體購自Promega (美國)；PCR引物及3′RACE接頭由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1Piwi亞家族蛋白的預測

從家蠶基因組數據庫SilkDB下載家蠶的基因組序列，利用BioEdit軟件建立本地家蠶基因組數據庫。以“piwi mRNA,complete cds”為條件檢索NCBI核酸數據庫，篩選所有符合條件的序列并獲取相應的蛋白質序列，通過在線blastp檢測相似度。將13個已知的Piwi蛋白序列(BAA93706、BAA93705、AAN75583、NP_899181、ACH96370、XP_344106、AAC97371、BAC81341、BAC81343、BAC81342、AAD08705、ABO26294、NP_476734)作為檢索序列，采用TBLASTN分別同源搜索家蠶基因組，參數保持缺省，E值小于1E-20。搜索家蠶EST序列時，匹配的序列必須滿足如下的標準：(1)序列相似性超過95%；(2)匹配的序列長度必須大于160 bp。

1.2.2總RNA提取及cDNA第1鏈的合成

取25～30 mg家蠶卵(產下6 h內)、新蛻皮1～5齡幼蟲、蛹和成蟲；解剖5齡幼蟲的精巢、卵巢、馬氏管、絲腺、頭和中腸共6種組織，每組樣本準備3個重復。5 min液氮速凍后在預冷的勻漿器中迅速研磨至粉末狀，采用TRIzol?Reagent，依據說明書提取總RNA?？俁NA的濃度及純度用分光光度計(Eppendorf公司，德國)檢測，完整性經1%瓊脂糖凝膠檢測。參照Reverse Transcriptase M-MLV方法合成cDNA第一鏈。參照GeneRacer Kit試劑盒合成5′-RACE-Ready cDNA；參照M-MLV反轉錄酶轉錄方法，用3′RACE接頭替換oligo (dT) 18，合成3′-RACE-Ready cDNA第一鏈，3′RACE接頭序列同SMART RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒中3′RACE接頭序列(由上海生工合成)。

1.2.3引物設計

依據預測的家蠶Piwi蛋白基因序列，利用primer premier 5.0軟件設計引物。5′RACE的引物根據GeneRacer kit要求設計；3′RACE的引物根據SMART RACE cDNA Amplification Kit要求設計。本實驗中所用引物序列詳見表1。

1.2.4家蠶siwi1和siwi2中間片段的克隆

依據預測的家蠶Piwi蛋白序列，利用primer premier 5.0軟件設計引物(表1)進行cDNA片段克隆，以1.2.2中反轉錄cDNA為模板，使用ExTaqDNA聚合酶進行RT-PCR擴增，50 μL反應體系：10 ×ExTaq Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，上下游引物(10 mmol/L)各2 μL，cDNA 0.5 μL，Taq酶0.25 μL，ddH2O 32.25 μL。siwi1RT-PCR反應條件：94℃ 5 min；35 cycles×【94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 2 min】；72℃ 10 min。siwi2RT-PCR反應條件：94℃ 5 min；3 cycles (每降1度) ×【94℃ 50 s，65℃～53℃梯度退火50 s，72℃ 2 min】；20 cycles ×【94℃ 50 s，50℃ 50 s，72℃ 2 min】；72℃ 10 min。siwi1全長PCR反應條件：94℃ 5 min；35 cycles ×【94℃ 50 s，53℃ 50 s，72℃ 3 min】；72℃ 10 min。產物采用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，再對目標產物進行回收，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化回收PCR產物，經連接、轉化、提取質粒，酶切和測序雙檢測，確定目的基因正確插入質粒并表達，克隆產物送往南京博亞公司測序。

1.2.5家蠶siwi1和siwi2末端序列的RACE擴增

依據獲得siwi1和siwi2中間片段信息，設計特異性引物(表1)，進行RACE擴增，50 μL反應體系：10×ExTaq Buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 4 μL，Mg2+(25 mol/L) 4 μL，UPM(通用引物，Universal Primer) 3 μL，GSP (10 mmol/L) (基因特異性引物，Gene-specific primer)1 μL,RACE cDNA 2 μL，Taq酶0.25 μL，ddH2O 30.75 μL。RACE PCR參照GeneRacer Kit試劑盒，RACE巢式PCR反應體系同前，僅將UPM換為nupm，GSP換為ngsp，反應產物稀釋100倍作為模板。PCR產物回收純化后，按照1.2.4中方法進行克隆測序。

表1 引物列表Table 1 List of the primers

1.2.6實時熒光定量PCR

取新生卵(Egg，產下6 h內)、初孵1齡幼蟲(1 L)、新蛻皮2～5齡幼蟲(2 L、3 L、4 L、5 L)、蛹和成蟲共8個時期，以5齡期家蠶Piwi蛋白基因表達量為參照；取精巢、卵巢、馬氏管、絲腺、頭和中腸共6種組織，以絲腺中siwi2基因的表達量為參照。在1次反應中，重復3次；制備2套cDNA模板進行2個獨立的熒光定量PCR反應。參照SYBR?Premix Ex Taq (Prefect Real Time)試劑盒，按照95℃預變性10 s；95℃變性5 s，60℃復性延伸31 s，40個循環進行定量反應。

1.2.7基因結構、保守結構域

通過NCBI中的ORFfinder分析克隆獲得的Piwi亞家族蛋白基因的開放閱讀框，并用Gene-Explorer軟件推導其氨基酸序列；將Piwi亞家族蛋白基因的核酸序列與家蠶基因組數據庫進行比對，分析其基因結構；利用推導的氨基酸序列搜索NCBI蛋白質保守結構域數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，預測Piwi亞家族蛋白中保守的結構域。利用在線版的InterPro軟件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對蛋白序列進行分析(Mitchelletal.,2019)。

1.2.8進化分析

利用“Piwi”為關鍵詞搜索NCBI，搜集已知的所有物種Piwi蛋白及其類似物Piwil，采用MEGA 7.0.26軟件對獲取的蛋白序列進行ClustalW序列比對，參數為默認值。根據鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹，選擇Poisson Correction(泊松修正)模型，自舉檢驗Bootstrap重復1 000次。利用在線軟件iTOL (Interactive Tree Of Life) (http://itol.embl.de/index.shtml)對進化樹進行優化處理。

1.3 數據分析

運用2-ΔΔCT法對定量數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 家蠶Piwi亞家族蛋白基因的預測與克隆

利用13個已知的Piwi亞家族蛋白在家蠶基因組中進行同源搜索，發現2個Piwi蛋白基因，分別命名為siwi1和siwi2。siwi1共1 482 bp；siwi2共1 530 bp。依據預測的siwi1和siwi2的基因序列，設計特異性引物進行PCR擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳獲得2條PCR產物條帶大小，其中1條約1 800 bp，另1條約600 bp，測序結果與預測的siwi1和siwi2基因序列比較分析發現，siwi1條帶長度為1 835 bp，與預測大小相似，siwi2條帶長度為581 bp，與預測結果差異較大(圖1)。

圖1 家蠶兩個Piwi亞家族蛋白基因的克隆Fig.1 Cloning of two Piwi subfamily genes from Bombyx mori

2.2 家蠶Piwi亞家族基因全長克隆

合成siwi1和siwi2的5′及3′RACE模板，采用持家基因ActinA3進行PCR反應檢測模板質量。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，5′及3′RACE模板均能擴增獲得ActinA3的陽性克隆產物(圖2-A)，表明模板質量可行。依據克隆獲得的基因片段，利用RACE技術分別擴增siwi1和siwi2的5′和3′末端，2%瓊脂糖凝膠電泳結果以及測序分析結果表明，成功克隆獲得了siwi1和siwi2基因的3′末端cDNA，siwi1 3′末端cDNA序列長度為1 444 bp，siwi2 3′末端cDNA序列長度為305 bp，而僅有基因上游特異引物gsp或ngsp、僅有3′RACE下游通用引物upm或nupm以及沒有模板的陰性對照blank中均不能檢測到條帶(圖2-B，C)。但多次試驗后仍不能克隆獲得siwi1和siwi2的5′端序列，可能是合成的5′RACE模板中，siwi1和siwi2基因的表達豐度不高。將克隆獲得的siwi1和siwi2基因序列與RACE技術擴增獲得的siwi1和siwi2序列分別進行拼接，拼接后的siwi1序列長度為2 746 bp，siwi2序列長度為823 bp。為獲取siwi1基因cDNA序列全長，利用已知Piwi亞家族蛋白搜索家蠶EST序列，找出所有可能的siwi1基因的EST序列，再將拼接獲得的siwi1序列與搜索出來的EST序列比對，拼接出siwi1基因cDNA序列全長。最后，對獲得的siwi1基因序列設計特異性引物進行PCR擴增，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，測序分析結果顯示該條帶為目標基因siwi1，而只有單引物F和R以及無模板的陰性對照中均不能檢測到相同條帶(圖2-D)，該基因cDNA全長3 277 bp (GenBank登錄號：MH780859)，包含部分5′UTR、編碼899個氨基酸的完整開放閱讀框和一段576 bp的3′UTR，其中3′UTR包含一段由40個腺苷酸組成的poly A尾巴，比對NCBI發現該基因為BmPiwi。而siwi2基因，僅獲得了823 bp的轉錄本序列，編碼239個氨基酸，其中3′UTR區共103 bp，含有一段由30個腺苷酸組成的poly A尾巴，比對NCBI發現該基因為BmAgo3。

2.3 家蠶Piwi亞家族蛋白的特征分析

與家蠶基因組序列比對發現，BmPiwi基因含有18個外顯子和17個內含子，其中第2個內含子跨度最大，共3 828 bp(表2)。通過搜索NCBI蛋白質保守結構域數據庫發現，BmPiwi含有Argonaute蛋白家族特征性的保守結構域：PAZ(位于氨基酸序列的316～451殘基)和PIWI(位于氨基酸序列的437～879殘基)(圖2-E)，在PAZ結構域中包含小RNA3′位點，PIWI結構域中包含5′RNA引導鏈錨定位點和剪切三聯體活性位點(DDH：Asp-Asp-Asp/His/Glu/Lys)。

表2 BmPiwi在染色體上的定位Table 2 Chromosome locations ofBmPiwi

圖2 家蠶2個Piwi亞家族蛋白基因的全長克隆及結構分析Fig.2 Full lengthcloning and structure analyzing of two Piwi subfamily genes from Bombyx mori注：(A)，PCR擴增持家基因Actin A3檢測模板質量；(B)，RACE擴增BmPiwi 3′末端；(C)，RACE擴增BmAgo3 3′末端，分別以精巢、卵、3齡幼蟲、4齡幼蟲的3′RACE模板進行RT-PCR擴增；(D)，PCR擴增BmPiwi全長；(E)，BmPiwi結構與分析。Te，精巢；L，幼蟲；-1，第一組；-2，第二組；M，Marker；blank，不含模板的陰性對照；gsp/ngsp，單上游基因特異引物；upm/nupm，單下游3′RACE通用引物；F，上游引物；R，下游引物；金黃色小三角代表核酸給合位點，綠色小三角代表5′RNA引導鏈錨定位點，藍色小三角代表剪切三聯體活性位點(DDH：Asp-Asp-Asp/His/Glu/Lys)。Note:(A),Check the RACE templates with housekeeping gene Actin A3 by PCR;(B),3′RACE PCR of BmPiwi;(C),3′RACE PCR of BmAgo3,RT-PCR performed with 3′RACE templates of testis,egg,3rd instar larvae and 4th instar larvae,respectively;(D),PCR amplification of BmPiwi full-length;(E),Structure analysis of BmPiwi. Te,Testis;L,Larvae;-1,First group;-2,Second group;M,Marker;blank,Negative control without template;gsp/ngsp,Single upstream gene-specific primer;upm/nupm,Single downstream 3′RACE universal primer;F,Upstream primer;R,Downstream primer;Golden yellow triangles represented nucleic acid binding sites;Green triangles represented 5′NA guiding strand anchoring sites;Blue triangles represented shear triplet activity site (DDH:Asp-Asp-sp/His/Glu/Lys).

2.4 家蠶Piwi亞家族蛋白的進化分析

構建不同物種PIWI亞家族蛋白系統發生樹，進化分析結果(圖3)顯示，PIWI亞家族蛋白在進化過程中高度保守，PIWI亞家族蛋白依據不同家族類別進行聚集，在脊椎動物中尤為明顯。PIWI亞家族蛋白主要存在于脊椎動物中，約占已知PIWI蛋白的一半，在魚類和哺乳動物中存在多種不同類型的PIWI-like蛋白(Piwil)，如人Homosapiens和猴子Macacamulatta中發現4種Piwil蛋白。昆蟲已知的PIWI蛋白數僅次于脊椎動物。家蠶Piwi亞家族蛋白與乳草長蝽Oncopeltusfasciatus、黑腹果蠅、柑橘小實蠅Bactroceradorsalis、優雅蟈螽Gampsocleisgratiosa、斯氏按蚊Anophelesstephensi、褐飛虱Nilaparvatalugens的PIWI蛋白以及東亞飛蝗Locustamigratoria的PIWI2和PIWI3蛋白親緣關系最近，和三疣梭子蟹Portunustrituberculatus的PIWI2和PIWI3同為一支，與脊椎動物的PIWIL2和刺胞動物的PIWI相似性也較高(圖3)。

家蠶AGO3蛋白與小菜蛾AGO3親緣關系最近，與西方玉米根蟲Diabroticavirgiferavirgifera、白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis的AGO3及東亞飛蝗Locustamigratoria的PIWI1同屬一支，與橘小實蠅的AGO3同屬一總支；與海綿動物和刺胞動物的PIWI蛋白以及櫛水母門動物的海醋栗Pleurobrachiabachei的PIWI蛋白相似性也較高(圖3)。AGO蛋白的種類明顯多于PIWI蛋白，丹參Salviamiltiorrhiza中AGO蛋白總數可達10種之多，塵螨Dermatophagoidesfarinae和番茄Solanumlycopersicum中的AGO蛋白也有8種，陸生植物AGO蛋白種類普遍較多。同一類型的AGO蛋白呈同一聚簇，與PIWI蛋白呈現明顯的分支，但家蠶AGO3蛋白以及錐蟲屬的AGO1蛋白卻與PIWI蛋白同屬一支(圖3)。

圖3 已知Piwi和Ago亞家族成員系統發生樹Fig.3 Phylogenetic tree of known Piwi and Ago subfamily members注：Piwil,Piwi like protein,Piwi類似蛋白。Note:Piwil represented Piwi like protein.

2.5 家蠶Piwi亞家族蛋白基因的時空表達譜

2.5.1家蠶Piwi亞家族蛋白基因的組織表達情況

采用持家基因ActinA3進行RT-PCR反應檢測模板質量，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖4-A)顯示樣品無基因組污染，模板質量可行，BmPiwi和BmAgo3基因在卵巢中條帶稍暗，在精巢中的條帶明顯亮于其他組織，表明家蠶2個Piwi亞家族蛋白基因在卵巢中的表達弱于精巢組織，在精巢組織中高表達。此外，在家蠶的消化道、頭部也能檢測到BmPiwi的表達，但在馬氏管和絲腺中表達量較低。在家蠶頭部中也能檢測到BmAgo3基因的表達。

熒光定量PCR結果(圖4-B)顯示，在選取的不同組織中，BmPiwi基因的表達量都明顯高于BmAgo3基因(4～13倍)。BmPiwi和BmAgo3兩個基因在絲腺中的表達量最低，在消化道中的表達量略高于絲腺，但略低于馬氏管；在精巢中的表達明顯高于其他組織，是絲腺中的10倍；在卵巢中表達僅次于精巢，是絲腺中的6倍。BmPiwi在頭部的表達量略低于卵巢，高于絲腺、馬氏管和消化道，但BmAgo3基因在頭部表達豐度最高。

2.5.2家蠶Piwi亞家族蛋白基因不同發育時期表達情況

熒光定量PCR檢測家蠶2個Piwi亞家族蛋白基因在不同發育時期的表達(以5齡家蠶Piwi表達量作為參照)，結果(圖4-C)顯示，家蠶2個Piwi亞家族蛋白基因在新生卵(產下6 h內)中表達量最高，分別是5齡期的44倍(BmPiwi)和32倍(BmAgo3)。進入幼蟲期，其表達量迅速下降，整個幼蟲期均維持低表達狀態，蛹期開始表達量迅速上升。BmPiwi在4齡期表達量最低，5齡開始表達量略微回升，成蟲期表達量上升至5齡期的15倍，達到不同發育階段BmPiwi表達量的第2高點。BmAgo3與BmPiwi表達趨勢大體相同，但不同于BmPiwi的是，BmAgo3在2齡期表達量明顯高于1齡期，且在5齡期表達量達到最低。此外，BmAgo3在蛹期表達量為5齡期14倍，并持續該狀態至成蟲期。

圖4 家蠶兩個Piwi亞家族蛋白基因在不同組織和不同發育階段的表達Fig.4 Detection of BmPiwi and BmAgo3 expression in different tissues and different developmental stages of silkworm注：(A)，RT-PCR檢測BmPiwi和BmAgo3在家蠶不同組織中的表達情況；(B)，定量PCR檢測BmPiwi和BmAgo3在家蠶不同組織中的表達情況；(C)，定量PCR檢測BmPiwi和BmAgo3在家蠶不同發育階段的表達情況。MT，馬氏管；AT，消化道；SG，絲腺；He，頭；Te，精巢；Ov，卵巢；L，幼蟲。Note:(A),Detection of BmPiwi and BmAgo3 expression in different tissues of silkworm by RT-PCR;(B),Expression profile of BmPiwi and BmAgo3 expression in different tissues of silkworm by quantitative real time PCR;(C),Expression profile of BmPiwi and BmAgo3 in different developmental stages of silkworm by quantitative real time PCR.MT,Malpighian tube;AT,Alimentary tract;SG,Silk gland;He,Head;Te,Testis;Ov,Ovary;L,Larvae.

3 結論與討論

1997年在果蠅卵巢中發現了第1個Piwi亞家族蛋白(Lin and Spradling,1997)，此后發現Piwi亞家族蛋白與小RNA結合形成piRNA，作為沉默復合體的核心蛋白而行使功能(Aravinetal.,2006)。研究表明PAZ和PIWI結構域是該家族蛋白的保守結構域，PIWI結構域具有與RNaseH相似的結構特征(Parkeretal.,2004;Songetal.,2004;Rivasetal.,2005;Rashidetal.,2007)。小鼠Musmusculus神經元中的PIWIL1結構域分析表明，PIWIL1中的RNA結合PAZ結構域和RNA加工PIWI結構域對其在神經元遷移中不可或缺(Zhaoetal.,2015)。本研究克隆獲得了BmPiwi基因的全長，分析發現其包含PAZ和Piwi結構域。進化分析結果顯示，BmPiwi與BmAgo3在不同物種中高度保守，但不同類型的Piwi及Piwi類似物Piwil聚集在不同的分支中，可能是因為Piwi亞家族蛋白具有功能多樣性。例如生殖干細胞Piwil2的異位表達與腫瘤干細胞的發育相關，同時也是修復各種遺傳毒物誘導的DNA損傷過程所必需的(Yinetal.,2011)；Piwil3在各種癌癥中過表達，可以促進胃癌細胞的增值、轉移和侵襲；在生殖細胞中表達的PIWIL4，在精子發生的第一階段起重要作用，同時也是轉錄沉默所必需的(Munozetal.,2014)。BmPiwi與BmAgo3在進化樹中處于不同分支，距離相對較遠，推測可能是由于功能不同所致。

早期研究表明PIWI蛋白在生殖細胞中表達，并參與生殖細胞的發育、維持、分裂和分化(Coxetal.,1998)。Piwi突變可以導致果蠅雌雄生殖干細胞的增殖能力消失(Lin and Spradling,1997)。近期研究顯示，Piwi可以通過激活表觀遺傳的調節、沉默轉座子和維持染色質結構來保護生殖細胞，同時也參與包括細胞增殖、分化和生存在內的許多重要生物過程(Ponnusamyetal.,2017)。本研究檢測了家蠶BmPiwi與BmAgo3的發育表達譜，發現BmPiwi與BmAgo3在新生卵中高表達，在1齡幼蟲中表達量都顯著下降，BmPiwi表達量維持下降趨勢至4齡幼蟲達到最低值，而BmAgo3在2齡時表達量出現回升，但3齡開始表達量再次下降，到5齡達到最低值。與Alfons Navarro等人(Navarroetal.,2015)對人肺胚胎發生階段的Piwil mRNA表達分析結果相似，PIWIL1在7周胚胎中高表達，并在隨后的6～13周表達量顯著下調，而PIWIL2在8周時表達水平出現回升持續到10周后再次下降。Zhao等(Zhaoetal.,2015)利用原位雜交實驗分析發育中的小鼠腦中PIWIL1 mRNA表達情況，結果顯示PIWIL1在胚胎13周高表達，隨后表達量顯著下調。對果蠅的相關研究顯示，Piwi是果蠅卵巢生殖干細胞維持和分化必須的核糖核蛋白，PIWI可以通過抑制體細胞小生境(由臨近生殖干細胞的細胞組成)中的c-FOS的表達從而調控生殖干細胞功能和卵巢體細胞的細胞組織，組織形態和產卵(Coxetal.,1998;Kleinetal.,2016)。由此推測家蠶piwi亞家族蛋白基因在卵期高表達對細胞的分裂分化具有重要作用。

PIWI/piRNA的動態表達模式對于哺乳動物卵子發生以及早期胚胎發生都有著顯著的影響，但即使在相同器官中，發揮功能的Piwi也不盡相同。例如，PIWIL1和PIWIL2在成人卵巢卵母細胞中高表達，胚胎卵母細胞中只有PIWIL2高表達(Rooversetal.,2015)，而牛卵巢僅表達PIWIL1，但是在提取的牛卵泡卵母細胞中卻發現成熟的卵母細胞特異性強烈表達PIWIL3(Rooversetal.,2015)。此外，小鼠MIWI在新生卵巢中高表達，隨著卵巢的成熟表達量下調，而在成年小鼠的初級卵泡、次級卵泡以及卵母細胞中都可以檢測到MIWI的表達，表明Piwi在卵細胞中高表達，且與卵母細胞的成熟與激活息息相關(Dingetal.,2013)。本研究在家蠶卵巢中檢測到BmPiwi與BmAgo3的高表達，BmPiwi表達量顯著高于BmAgo3，推測是由于BmPiwi在家蠶卵巢中起主要作用。PIWI對于雄性生殖也具有重要作用，對突發性非梗阻性無精子癥患者的研究證實HIWI2 (PIWIL4)是正常精子發生第一時期所必須的，HIWI2基因遺傳多態性與精子形成和男性不育密切相關(Zeeba Kamaliyanetal.,2017;Rewiczetal.,2018)。對家蠶精巢Piwi基因的檢測顯示，BmPiwi的表達量明顯高于BmAgo3，推測其在精巢中起主要作用。

除生殖器官精巢和卵巢，Piwi基因在多個器官中均有分布，包括腦、心臟、肺、肝臟、腎臟、胰腺、胃等，除病理情況，Piwi在生殖器官中表達量普遍偏高。本研究發現BmPiwi在家蠶頭部的表達量僅次于卵巢，而BmAgo3在頭部表達量最高，在家蠶預蛹期階段，BmAgo3的表達量明顯高于BmPiwi，家蠶的發育受激素和神經雙重調控，而頭部是昆蟲感覺中心，故BmPiwi和BmAgo3在頭部高表達。研究顯示，小鼠PIWIL1可以通過調控微管相關蛋白來調控神經元的極化與遷移(Zhaoetal.,2015)，因此，BmAgo3很可能對家蠶神經元起調控作用。此外，在家蠶消化道、絲腺、馬氏管均檢測到BmPiwi和BmAgo3基因的表達，馬氏管中的表達量略高于消化道和絲腺，但在家蠶幼蟲期BmPiwi和BmAgo3的表達量均不高。已有文獻報道，Piwi家族成員參與代謝活動，例如，果蠅中Piwi和piRNA參與脂肪代謝過程(Jonesetal.,2016)，小鼠Piwi蛋白及其相關的piRNA通過控制β細胞調控糖類代謝(Henaouietal.,2017)，但對于消化道、絲腺和馬氏管，Piwi基因可能并不發揮主要調控作用。Kawaoka等對家蠶Piwi情況進行了探究，但其主要關注于精子發生和卵子形成，且采用的是芯片數據分析Piwi家族的表達譜，未進行RT-PCR驗證(Kawaokaetal.,2008)。本研究補充了家蠶Piwi亞家族基因從卵至成蟲時期表達情況，并探究了Piwi基因在各個組織中的表達情況，對家蠶的后續研究具有指導作用。