miR-34a-5p靶向Smad4抑制子宮內膜纖維化的機制研究*

范李靜，張 苗，鄭瑛紅，劉文杰，范小斌

(西北大學附屬醫院西安市第三醫院婦產科，西安 710021)

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUAs)，也稱為Asherman綜合征，是一種子宮疾病，其特征是子宮內膜受損，盆腔或宮內發生疤痕和粘連[1]。宮腔粘連是宮內手術或子宮內膜感染、產后子宮內膜炎有關的并發癥[2]。宮腔粘連發生的主要原因是細胞外基質生成和降解異常，細胞外基質過度的堆積導致子宮內膜纖維化進一步形成瘢痕發生宮腔粘連。轉化生長因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種較強的促纖維化因子，與創面的修復愈合有關，高表達的TGF-β1對纖維疤痕組織的形成有促進作用。TGF-β1激活后，可與其受體結合并激活下游Smad信號，包括Smad2和Smad3，使其組織發生纖維化[3]。已有相關研究表明，TGF-β1/Smad信號通路參與宮內粘連[3]。MicroRNAs(miRNAs)是一種小的、內源性的、非編碼的、由18～22個核苷酸組成的單一RNA分子，通過直接結合其靶基因的3'-UTR調控基因表達[4]。越來越多的證據表明，miRNAs的失調參與了宮腔粘連。宮腔粘連小鼠的子宮內膜中miR-1291水平顯著升高[5]。miR-34a-5p具有促細胞凋亡和抗細胞增殖的能力[6]。miR-34a-5p在纖維化疾病肝硬化中表達降低，人肝星狀細胞中過度表達miR-34a-5p通過靶向Smad4和調節TGF-β1/Smad3途徑可以改善肝纖維化的發展[7]。而miR-34a-5p在宮腔粘連纖維化疾病中的研究未見相關研究報道?；诖?，本文擬研究miR-34a-5p在子宮內膜纖維化中的作用，并探討其可能機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年10月至2021年6月于西安市第三人民醫院婦產科行宮腔鏡檢查并確診為宮腔黏連的患者20例，年齡30～45歲。納入標準：經宮腔檢查符合宮腔粘連的診斷。排除標準：合并婦科惡性腫瘤、不典型增生；合并生殖道和泌尿道急性感染。選取同期行宮腔鏡檢查的非宮腔黏連患者20例(因子宮縱膈、不孕或節育器嵌頓)作為對照組，年齡21～35歲。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑、儀器 人子宮內膜間質細胞(human endometrial stromal cell，hESC，CL0453)購自湖南豐暉生物；psiCHECK-2質粒購自美國Promega；胎牛血清、雙抗購自Hyclone；MEM+NEAA培養基(PM150410)購自武漢普諾賽；TGF-β1(10804-HNAC)購自北京義翹神州；miR-34a-5p mimics和pcDNA3.1-Smad4過表達質粒購自上海吉瑪基因；X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(04476093001)、FastStart Essential DNA Green Master(06924204001)購自美國Roche公司；psiCHECK-2-WT-Smad4、psiCHECK-2-MUT-Smad4質粒合成于北京擎科生物；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)購自美國Thermo；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(ab5831)、膠原蛋白Ⅰ(collagen I，COL1A1)抗體(ab138492)、纖維連接蛋白(Fibronectin，FN)抗體(ab45688)和Smad4抗體購自英國Abcam；細胞增殖與毒性檢測試劑盒(C008-3)、Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(A005-3)購自上海七海復泰。

1.3 實驗方法

1.3.1 hESC細胞的培養及誘導 hESC細胞培養于含10%胎牛血清的完全培養基(MEM+NEAA+1%雙抗)，5% CO2、37℃恒溫培養箱。取對數生長期hESC細胞，0.25%胰蛋白酶消化后重懸，調整細胞濃度，按3×105細胞/孔鋪至6孔板。待細胞貼壁，更換成含5%血清的培養基，分別加5ng/mL和10ng/mL的TGF-β1處理細胞24h和48h，每個濃度設置3個重復孔。

1.3.2 miR-34a-5p mimics轉染hESC細胞 將hESC細胞按5×104細胞/孔鋪至24孔板，待細胞匯合度為40%左右時每孔加50pmol/L miR-34a-5p mimics或mimics NC，經X-treme GENE siRNA Transfection Reagent轉染24h，檢測miR-34a-5p表達以驗證轉染效率。細胞分組：Control組：未處理的正常hESC細胞；TGF-β1組：10ng/mL TGF-β1處理hESC細胞；mimics NC組：hESC細胞轉染mimics NC后經10ng/mL TGF-β1處理；miR-34a-5p mimics組：hESC細胞轉染miR-34a-5p mimics后經10ng/mL TGF-β1處理。

1.3.3 CCK-8檢測細胞增殖 根據細胞增殖與毒性檢測試劑盒使用說明書，將對數生長期hESC細胞用0.25%胰蛋白酶消化并接種至96孔板。經特定處理后，每孔加100 μL 7Sea-Cell Counting Kit溶液，置于細胞培養箱繼續孵育1h，酶標儀測定每孔在450nm處的吸光值。

1.3.4 miR-34a-5p靶基因預測 利用miRanda、TargetScan及PicTar數據庫預測miR-34a-5p的潛在靶基因并取其交集。利用David網站對得到的188個靶基因進行KEGG通路分析，并篩選miR-34a-5p的靶基因。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因實驗 經生物信息學分析，初步篩選Smad4為miR-34a-5p的靶基因；將包含miR-34a-5p結合序列的psiCHECK-2-Smad4野生質粒(psiCHECK-2-Smad4-wt)及psiCHECK-2-Smad4突變質粒(psiCHECK-2-Smad4-mut)分別與miR-34a-5p mimics和mimics NC用Lipofectamine 2000脂質體共轉染入人胚腎細胞HEK-293T。 48h后，用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒檢測Smad4的熒光強度，驗證miR-34a-5p和Smad4之間的靶向關系。

1.3.6 Smad4過表達質粒轉染 分離、純化并擴增Smad4的基因片段，與pCDNA3.1連接(pCDNA3.1-Smad4)，空質粒載體pCDNA3.1-vector作為陰性對照。將pCDNA3.1-Smad4和pCDNA3.1-vector用Lipofectamine 2000分別轉染入hESC細胞，孵育48h后檢測Smad4表達以驗證轉染效率。將miR-34a-5p mimics和Smad4過表達質粒共轉染至hESC細胞，TGF-β1處理24h檢測hESC細胞的增殖情況和纖維化情況。

1.3.7 實時定量PCR hESC細胞和經研磨處理的子宮內膜組織經TRizol裂解液裂解提取樣本的RNA。Nanodrop分光光度計測定RNA濃度。Thermo Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行實時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測。反應條件：95℃，300s；95℃，5s，60℃，30s，循環次數為45次。

1.3.8 Western blot檢測 將收集的細胞加適量體積的RIPA裂解液并收集上清。BCA法測定總蛋白濃度。準備好樣品，用微量進樣器上樣，每孔上樣量20μg蛋白，使用恒壓80V電泳。電轉至PVDF膜(電流200mA轉膜2h)，5%脫脂奶粉室溫搖床孵育封閉1h。PVDF膜加入α-SMA、fibronectin和COL1A一抗， 4℃搖床過夜孵育。將膜置于二抗稀釋液，室溫搖床孵育1h。加入ECL蛋白發光液觀察蛋白條帶，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度值分析。

2 結 果

2.1 miR-34a-5p在宮腔粘連內膜組織及TGF-β1處理后hESC細胞中的表達 qRT-PCR檢測結果顯示，與未粘連組[1.38(0.65，2.05)]相比，粘連組的miR-34a-5p表達水平[0.74(0.42，1.01)]顯著降低(Z=-2.218，P=0.027)。10ng/mL TGF-β1分別處理hESC細胞24、48h后，細胞中miR-34a-5p表達水平顯著降低(P<0.01)。后續均用10ng/mL TGF-β1處理hESC細胞24h。見圖1。

圖1 TGF-β1處理的hESC細胞中miR-34a-5p表達水平#P<0.01 vs control組

2.2 miR-34a-5p對TGF-β1誘導hESC增殖和細胞形態的影響 CCK-8結果顯示，TGF-β1組hESC細胞增殖顯著高于對照組[(114.1±0.94)% vs (100 ±0.76)%，P= 0.003]；與mimics NC組相比，miR-34a-5p mimics組細胞增殖顯著下降[(113.8±1.1)% vs (105.4± 0.5)%，P=0.001]。Control組細胞形態呈圓形或卵圓形，胞間連接緊密。TGF-β1誘導后細胞形態出現明顯改變，細胞多為長梭形，細胞間隙較大。miR-34a-5p mimics組細胞形態與Control組相似，多為圓形或卵圓形(圖2)。

圖2 miR-34a-5p對TGF-β1誘導的hESC細胞形態的影響A:Control;B:TGF-β1;C:TGF-β1+mimics NC;D:TGF-β1+ miR-34a-5p mimics

2.3 miR-34a-5p對TGF-β1誘導hESC纖維化的影響 qRT-PCR和Western blot結果顯示，與Control組相比，TGF-β1組纖維化標志物α-SMA、fibronectin和COL1A1顯著升高(P<0.05)，miR-34a-5p mimics組的α-SMA、fibronectin和COL1A1表達顯著低于mimics NC組(P<0.05)。見圖3。提示miR-34a-5p對TGF-β1誘導的hESC纖維化有抑制作用。

圖3 miR-34a-5p對TGF-β1誘導hESC纖維化的影響A～C:qRT-PCR檢測hESC細胞中α-SMA、fibronectin和COL1A1的mRNA的表達水平； D～G:Western blot法檢測hESC細胞中α-SMA、fibronectin和COL1A1蛋白表達水平;*P<0.05;1:control;2:TGF-β1;3:TGF-β1+NC;4:TGF-β1+miR-34a-5p mimics

2.4 Smad4是miR-34a-5p的靶基因 David網站分析顯示，miR-34a-5p的靶基因主要分布于TGF-β 通路，這些靶基因主要包括Smad4、p70S6k等。Smad4作為TGF-β的激活分子是miR-34a-5p的一個靶基因(圖4A)。雙熒光素酶報告基因結果表明，與陰性對照組比較，miR-34a-5p可顯著抑制Smad4 3'-UTR野生型的報告基因活性，而對Smad4 3'-UTR突變型的報告基因活性沒有影響(圖4A)。表明miR-34a-5p可作用于Smad4的3'-UTR區。Western blot結果表明，miR-34a-5p過表達可顯著下調Smad4蛋白的表達水平(圖4B)。

圖4 Smad4是miR-34a-5p的靶基因A：雙熒光素酶報告系統檢測轉染不同質粒hESC細胞中的熒光強度；B：Western blot法檢測過表達miR-34a-5p后Smad4表達水平；*P<0.05

2.5 Smad4參與miR-34a-5p的抗增殖、抗纖維化作用 與空載體對照處理的hESC相比，Smad4過表達質粒轉染hESC細胞后Smad4表達水平升高2.3倍(P=0.004)。見圖5A、B。過表達Smad4后，hESC細胞活力顯著升高(圖5C)。與共轉染miR-34a-5p和空載對照的hESC細胞相比，共轉染miR-34a-5p和Smad4過表達質粒的hESC細胞內α-SMA(P=0.01)和COL1A1(P<0.01)mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(圖5D～H)。

圖5 Smad4參與miR-34a-5p對TGF-β1誘導hESC細胞增殖和纖維化作用的抑制A、B：Smad4過表達效率檢測；C：CCK-8檢測各組hESC細胞活力；D、E:qRT-PCR檢測各組hESC細胞α-SMA和COL1A1 mRNA表達量；F:Western blot法檢測hESC細胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達水平；G、H:hESC細胞中α-SMA和COL1A1蛋白相對定量水平。*P<0.05；#P<0.05;1:miR-34a-5p mimics;2:miR-34a-5p mimics+Scramble;3:miR-34a-5p mimics+Smad4

3 討 論

宮腔粘連是育齡婦女最常見的疾病之一，中度至重度宮腔粘連患者正常月經模式減少、閉經甚至不孕，對患者的身心健康產生不利影響。TGF-β在宮腔粘連的形成中起重要作用，宮腔粘連患者子宮內膜中TGF-β蛋白水平顯著升高，促進子宮內膜發生纖維化[8]。

miRNAs在纖維化的調節中起著決定性的作用。miR-326在宮腔粘連患者子宮內膜組織中下調，miR-326通過調節TGF-β1/Smad3通路抑制子宮內膜纖維化[9]。miR-543通過抑制子宮內膜細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制宮腔粘連的發生和發展[10]。本研究發現，宮腔粘連內膜組織中miR-34a-5p表達量降低。miR-34家族具有強大的促細胞凋亡和抗細胞增殖的作用[6]。miR-34a-5p參與腎小管間質纖維化及肝臟纖維化等多種纖維化疾病[7,11]。目前miR-34a-5p是否影響宮腔粘連纖維化還未見研究報道。本研究發現，miR-34a-5p參與hESC細胞的纖維化，miR-34a-5p表達增加可降低hESC細胞的纖維化進程。這與Zhang等[12]研究結果相似，即miR-34a可通過減少I型膠原蛋白的產生以及通過靶向Pin-1信號傳導減輕糖尿病性心肌病的心肌纖維化。但也有研究發現，miR-34a促進肝星狀細胞及腎小球系膜細胞纖維化[13-14]。上述結果的差異可能與細胞及疾病種類相關。

Smad4表達失調與多種人類疾病有關，如組織纖維化、炎癥和癌變，提示Smad4在治療這些疾病方面具有治療潛力[15]。本研究利用miRanda、TargetScan、Pictar數據庫預測了miR-34a-5p的潛在靶基因，預測Smad4的3'UTR區和miR-34a-5p可能有結合位點；使用雙熒光素酶報告驗證確定Smad4的3'UTR區和miR-34a-5p有結合。本研究結果顯示，Smad4表達水平影響纖維化，hESC細胞共轉染miR-34a-5p mimics和Smad4后，過表達Smad4可逆轉miR-34a-5p mimics抗纖維化作用。表明Smad4與miR-34a-5p共同影響TGF-β1介導的hESC細胞纖維化進程，參與miR-34a-5p的抗增殖抗纖維化作用。

綜上所述，宮腔粘連患者子宮內膜組織中miR-34a-5p表達量降低；miR-34a-5p可抑制TGF-β1誘導的hESC細胞的增殖和纖維化；miR-34a-5p及其靶基因Smad4共同調控hESC細胞的增殖和纖維化，有望成為宮頸粘連的新治療靶點。