‘金冠’蘋果及優系(SGP-1)果實糖積累與其代謝相關酶活性研究

楊文淵,謝紅江,陶 煉,宦云敏,陳善波,林立金,廖明安

(1.四川農業大學 園藝學院,成都 611130;2.四川省農業科學院 園藝研究所,成都 610066;3.農業部西南區域園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,成都 610066;4.四川省林業科學研究院,成都 610081)

蘋果(Malus domesticaBorkh.)是中國主要水果之一,因其營養豐富和良好的口感,深受廣大消費者喜愛。蘋果果實糖的種類、含量及比例影響果實風味和營養成分,是決定果實品質和商品價值的重要因素[1-4]。研究發現,蘋果中可溶性糖主要含果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇,通常果糖含量最高,占40%以上[5-8],而‘金冠’蘋果的果糖含量更高,占60%以上[9]。果實中的糖積累、種類與糖代謝酶的活性變化密切相關[10-12],起主要調控作用的有蔗糖合成酶(SS)、酸性轉化酶(AI)、中性轉化酶(NI)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、山梨醇脫氫酶(SDH)[13-15]。作為蘋果碳水化合物主要運輸形式的山梨醇,經韌皮部卸載,在果實中被山梨醇脫氫酶(SDH)和山梨醇氧化酶(SOX)迅速轉化成果糖和葡萄糖,參與果實的生長發育和品質形成[2,16-17]。而蔗糖是蘋果果實中糖卸載的另一種重要形式,并在品質形成有關的代謝中起著重要作用[1,2,16]。但對西南冷涼高原蘋果果實生長發育期間糖積累及代謝相關酶活性的變化規律,尤其與代謝有關酶的關系尚缺乏研究。

多年田間觀測發現,西南冷涼高原產區‘金冠’蘋果變異優系(SGP-1)果實口感純甜,風味極佳,為進一步探討‘SGP-1’果實糖代謝機理,以‘金冠’蘋果及其優系(SGP-1)為材料,通過測定果實生長發育期間糖組分、含量及糖代謝相關酶活性,分析主要糖含量變化規律及其與糖代謝相關酶活性的關系,明確可溶性糖積累的關鍵時期和關鍵酶,探討‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實生長發育期間可溶性糖積累的生理差異,為深入研究其果實糖代謝的分子機制奠定基礎,也為蘋果果實增糖降酸提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為四川省阿壩州蘋果園‘金冠’蘋果及優系(SGP-1)的果實。選取生長勢基本一致的3株蘋果樹進行樣品采集,樹齡8 a,株行距3 m×4 m,栽培管理水平中等。在花后7 d開始采集樣品,每20 d取1 次樣品,直至果實達到生理成熟(花后160 d左右),共取9次樣品。幼果期至成熟期果實大小差異較大,因此每次取果量應根據果實大小而定。樣品前處理:果實帶皮去心切碎,迅速用液氮冷凍(-196 ℃)后混勻,分2 份置于超低溫冰箱(-80 ℃),備用,一份用于檢測糖組分及含量,另一份用于分析酶活性。

1.2 方法

1.2.1 果實中糖組分提取與測定 果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇含量均采用高效液相色譜法(HPLC)測定,果實中糖組分提取和測定參照陳美霞[18]和張麗麗等[19]的方法并略加改進。稱取液氮研磨成粉的果實1 g左右(計重),加入4 m L超純水,搖勻,在80 ℃水浴提取15 min,8 500 r·min-1離心10 min,殘渣中再加入4 m L 超純水再次提取,合并上清液并定容到10 m L,經0.45μm 濾膜過濾,待測。

色譜條件:色譜柱為Thermo(4.6 mm×250 mm)NH2柱,檢測器:RID,以乙腈∶水=80∶20為流動相,流速為0.8 m L·min-1,柱溫35℃,進樣量10μL?？扇苄蕴呛繛楦魈墙M分相加之和。

糖組分標曲的制作:糖標樣均購自Sigma 公司。分別稱取果糖50 mg、葡萄糖50 mg、蔗糖20 mg、山梨醇20 mg溶解于5 m L 超純水,制成混標原液。 各糖質量濃度分別為果糖10 mg·m L-1,葡萄糖10 mg·m L-1,山梨醇4 mg·m L-1,蔗糖4 mg·m L-1。將混標分別稀釋10、8、4、2、1倍,各管質量濃度如下(表1)。

表1 標樣配制質量濃度Table 1 Concentration of standard sample preparation

1.2.2 果實中糖代謝相關酶活性的測定 所有酶液制備參考Keller等[20]的方法。稱取冷凍果實樣品,液氮研磨,加由50 mmol·L-1HEPESNaOH (p H7.5)、10 mmol· L-1MgCl2、1 mmol·L-1EDTA、2.5 mmol·L-1DTT、0.05%(V/V)Tritonx-100 和0.1%(m/V)BSA組成的提取緩沖液,勻漿,用冷卻的脫脂紗布過濾,低溫離心,收集上清液,2 ℃下透析24 h后的酶液用于酶活性測定。按照酶試劑盒說明書分別測定:蔗糖合成酶(SS-S和SS-C)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、山梨醇脫氫酶(SDH)、酸性轉化酶(AI)、中性轉化酶(NI)、山梨醇氧化酶(SOX)酶活性,3 次重復,平行3 次。

1.3 數據統計

用Excel 2010 軟件進行數據整理和繪圖,應用SPSS 20進行差異顯著性分析(Duncan’s新復極差法,0.05 水平上測試)和相關性分析(pearson法)。

2 結果與分析

2.1 ‘金冠’蘋果及其優系(SGP-1)果實發育期間糖積累變化

如圖1-A 所示,發育前期(7～87 d)‘金冠’及‘SGP-1’果實中可溶性糖以山梨醇為主,果糖、蔗糖和葡萄糖含量極少;發育后期(107～167 d),兩種材料果實中的可溶性糖以果糖為主,蔗糖、葡萄糖次之,而山梨醇含量極低。隨著果實的發育,兩材料果實的可溶性糖及各糖組分(果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇)變化規律總體一致(圖1-A～1-E),可溶性糖含量總體呈上升趨勢,果糖、蔗糖含量的變化趨勢與可溶性糖相似,而山梨醇呈下降趨勢,葡萄糖則呈現升降升動態變化。如圖1-B～1-D所示,‘金冠’及其優系(SGP-1)果糖的快速增長期在果實發育前期,蔗糖的快速增長期在果實發育后期,山梨醇在果實發育初期積累高而后快速下降,而葡萄糖的快速積累期在果實發育后期(花后127～167 d)。

圖1 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實可溶性糖及各組分含量變化Fig.1 Changes of soluble sugar and each sugar component content in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

‘SGP-1’可溶性糖總體積累速度慢于‘金冠’,至成熟時‘SGP-1’可溶性糖含量較‘金冠’顯著(P＜0.05,下同)降低4.05%,‘金冠’為112.26 mg·g-1,‘SGP-1’為107.71 mg·g-1。在各糖組分上,‘SGP-1’的蔗糖總體積累速度慢于‘金冠’,而果糖和葡萄糖總體積累速度快于‘金冠’,至成熟時,‘SGP-1’果實中的蔗糖含量較‘金冠’顯著降低34.13%,而果糖、葡萄糖含量分別較‘金冠’顯著提高8.66%、17.65%;‘SGP-1’發育前期果實中的山梨醇含量顯著高于‘金冠’,但下降速度快,到成熟期時降低74.95%,且顯著低于‘金冠’。

2.2 ‘金冠’蘋果及其優系(SGP-1)果實發育中糖代謝酶活性變化

2.2.1 蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性變化 如圖2

圖2 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實蔗糖磷酸合成酶活性變化Fig.2 Change of SPS activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

所示,‘金冠’果實中的SPS活性在花后7～127 d處于較低水平(5.22～8.78μmol·g-1·h-1),有所波動,到花后147～167 d 活性逐漸升高(9.65～12.77μmol·g-1·h-1);‘SGP-1’的SPS 活性除在花27 d 出現明顯峰值(10.25 μmol·g-1·h-1),在花后7～127 d同‘金冠’一致處于較低值,到花后147～167 d 有所回升(8.52～9.61μmol·g-1·h-1)。除花后27 d‘SGP-1’的SPS活性顯著高于‘金冠’,107 d和167 d顯著低于‘金冠’,其余時段二者差異不顯著。

2.2.2 山梨醇脫氫酶(SDH)活性變化 如圖3所示,‘金冠’和‘SGP-1’果實中的SDH 活性變化趨勢總體一致,先上升后下降?！鸸凇腟DH活性峰值出現在花后127 d,為3.12μmol·g-1·h-1,‘SGP-1’的峰值出現在花后47 d,為3.63 μmol·g-1·h-1?；ê?7～47 d‘SGP-1’的SDH 活性顯著高于‘金冠’,到花后107～147 d則顯著低于‘金冠’,成熟時兩者無顯著差異。

圖3 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實山梨醇脫氫酶活性變化Fig.3 Change of SDH activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

2.2.5 轉化酶活性變化 如圖6-A 所示,‘金冠’及‘SGP-1’果實中酸性轉化酶(AI)活性變化趨勢前期不同,后期基本一致?！鸸凇腁I活性在整個果實發育期間波動不大(7.09～14.40 μmol·g-1·h-1),而‘SGP-1’的活性在花后7～27 d快速上升達到峰值(40.32μmol·g-1·h-1),隨后急下降到最大值的三分之一,保持到中后期波 動較小(5.98～12.21μmol·g-1·h-1)。

2.2.3 山梨醇氧化酶(SOX)活性變化 如圖4所示,隨著果實生長發育,‘金冠’及‘SGP-1’果實中SOX 活性在花后7～87 d變化趨勢相反,‘金冠’為先降后升,‘SGP-1’為先升后降,到花后107～167 d,兩材料SOX 活性變化趨勢相同,為先降后升。除花后67～87 d,‘SGP-1’的SOX 活性顯著低于‘金冠’外,其余時段均顯著高于‘金冠’。

圖4 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實山梨醇氧化酶活性變化Fig.4 Change of SOX activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

2.2.4 蔗糖合成酶(SS)活性變化 如圖5-A 所示,‘金冠’及‘SGP-1’果實中蔗糖合成酶合成方向(SS-S)活性變化趨勢前期不同,后期一致?；ê?～127 d,‘金冠’SS-S活性總體呈先升后降趨勢,在花后67 d達到峰值(13.96μmol·g-1·h-1),而‘SGP-1’的SS-S活性在花后27 d升至峰值(14.20μmol·g-1·h-1),之后降低并維持在一個較穩定的值,到花后127 d進一步降低?；ê?27～167 d,‘金冠’及‘SGP-1’果實中SS-S活性均呈上升趨勢?！甋GP-1’的SS-S活性在果實發育早期高于‘金冠’,在果實發育中后期低于‘金冠’。

如圖5-B所示,‘金冠’及‘SGP-1’果實中蔗糖合成酶分解方向(SS-C)活性前期波動較大,后期緩慢上升?；ê?～67 d兩種材料SS-C 活性較高(4.10～10.54μmol·g-1·h-1),花后87～147 d活性降低(3.77～4.99μmol·g-1·h-1),到花后167 d 活性升至較高值(8.34～8.86 μmol·g-1·h-1)?；ê? d、47 d‘SGP-1’的SSC活性顯著低于‘金冠’,而花后27 d‘SGP-1’的活性則顯著高于‘金冠’,其余時段二者無顯著差異?；ê?～47 d和87 d‘SGP-1’果實AI活性顯著高于‘金冠’,其余時段顯著低于‘金冠’。

圖5 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實蔗糖合成酶活性變化Fig.5 Change of SS activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

如圖6-B所示,‘金冠’及‘SGP-1’果實中性轉化酶(NI)活性波動較大,呈多峰曲線?！鸸凇麑峃I活性呈現“降-升-降-升”趨勢,在花后7 d、107 d和167 d出現3個小高峰,最大值出現在花后107 d(23.09μmol·g-1·h-1);而‘SGP-1’的活性在花后7～27 d快速上升達到最大值(43.88μmol·g-1·h-1),隨后急下降,到花后87 d小幅回升后持續下降。在整個發育期,兩材料NI活性差異均達到顯著水平,花后7～47 d‘SGP-1’果實AI活性顯著高于‘金冠’,花后67 d和107～167 d則顯著低于‘金冠’。

圖6 ‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實轉化酶活性變化Fig.6 Change of invertase activity in‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’fruit

2.3 ‘金冠’蘋果及其優系(SGP-1)果實糖積累與其代謝酶活性變化的相關性

根據上述糖及代謝酶動態變化規律,把整個果實發育期分為前期(花后7～87 d)和后期(花后107～167 d),進行‘金冠’蘋果和‘SGP-1’果實糖含量與其代謝相關酶活性的相關性分析,結果如表2所示。SPS和SS-S是蘋果果實蔗糖合成相關酶,前期‘SGP-1’果糖含量SDH 呈正相關,與SS-S活性呈極顯著負相關,而‘金冠’各糖組分與SS-S活性均未達到顯著水平;后期‘SGP-1’果糖及兩材料葡萄糖和蔗糖均與SPS活性呈顯著或極顯著正相關,兩材料山梨醇與SPS活性呈極顯著負相關。

SS-C、AI和NI是蘋果果實蔗糖分解相關酶,催化蔗糖分解為葡萄糖和果糖。如表2所示,‘SGP-1’果實的蔗糖含量與此3種蔗糖分解酶相關性未達到顯著水平;在前期,果糖含量與AI呈極顯著負相關,葡萄糖含量與SS-C 活性呈極顯著正相關;在后期,果糖含量與SS-C 活性呈極顯著正相關,與NI活性呈極顯著負相關,葡萄糖與AI和NI活性呈極顯著負相關。而‘金冠’果實前期蔗糖和果糖含量與SS-C 活性呈顯著或極顯著負相關,與NI活性呈極顯著正相關;在后期,蔗糖和葡萄糖含量與SS-C 活性呈顯著正相關,果糖含量與AI和NI活性呈極顯著正相關。

SDH 和SOX 是蘋果果實山梨醇分解相關酶,催化山梨醇分解為葡萄糖或果糖。如表2所示,‘SGP-1’和‘金冠’果實中的山梨醇含量在發育前期均與SDH 呈顯著或極顯著負相關,在發育后期呈極顯著正相關?！甋GP-1’果實的果糖和葡萄糖含量在發育后期與SDH 活性呈極顯著負相關;而‘金冠’果實的果糖含量在發育前期與SDH 活性呈極顯著正相關,而葡萄糖和蔗糖含量在發育后期與SDH 活性呈極顯著負相關。除‘SGP-1’果實后期葡萄糖含量與SOX 呈極顯著負相關外,兩材料各糖組分與SOX 活性相關性均未達到顯著水平。

表2 ‘金冠’蘋果及‘SGP-1’果實糖含量與其代謝相關酶活性的相關性分析Table 2 Correlation analysis between fruit sugar content and metabolic related enzyme activities of‘Golden Delicious’apple and‘SGP-1’

3 討論

通過對‘SGP-1’和‘金冠’果實生長發育期間可溶性糖及各組分含量變化的分析,結果表明,兩材料果實可溶性糖均以果糖為主,這與李婭楠等[9]、王迪等[21]研究結果一致。各糖組分變化規律總體一致,果糖、蔗糖呈上升趨勢,山梨醇呈下降趨勢,葡萄糖升降升,但積累速度不同。在果實發育前期,‘SGP-1’果實中果糖、葡萄糖和山梨醇含量整體高于‘金冠’,使得可溶性糖快速積累,蔗糖含量與‘金冠’差異不顯著;到果實發育后期,雖葡萄糖含量仍顯著高于‘金冠’,但蔗糖含量顯著低于‘金冠’,導致可溶性糖總體積累速度顯著低于‘金冠’。兩材料糖分積累變化規律存在明顯差異,與酶活性和糖代謝相關基因的差異有關[22],也受庫細胞中韌皮部運輸效率、糖的跨膜運輸能力的影響[23],需要進一步研究。

蘋果的同化產物主要以山梨醇和蔗糖形式運輸到果實中,其中山梨醇占80%[24],而糖卸載到果實中的過程在很大程度上取決于果實的庫強,衡量庫強大小的一個重要生化指標是糖代謝相關酶活性[16]。本研究發現‘SGP-1’果實中主要影響糖代謝的SPS、SDH、SOX、SS-S、SS-C、AI、NI的活性總體表現為在前期顯著高于‘金冠’;后期除SOX 活性高于‘金冠’和SS-C 活性持平于‘金冠’,其余酶活性顯著低于‘金冠’。前期較高的SDH、SOX、AI、NI活性有利于卸載入‘SGP-1’果實中的山梨醇和蔗糖被分解為葡萄糖和果糖,使前期‘SGP-1’中可溶性糖含量顯著高于‘金冠’。在發育后期,蘋果中淀粉的快速降解以及SPS、SS-S作用使果實進入蔗糖快速積累期[25],‘金冠’成熟期較高的SPS和SS-S活性使果實中蔗糖含量顯著高于‘SGP-1’,進而可溶性糖含量也顯著高于‘SGP-1’,相關性分析結果表明,SPS在兩材料果實發育后期的蔗糖快速積累階段起主要調控作用。

相關性分析發現,在果實發育前期調控兩材料山梨醇分解的關鍵酶是SDH,Hideaki等[26]也認為與SOX 相比,果實發育前期山梨醇主要受SDH 影響,研究結果與前人一致;而果實發育后期蔗糖快速積累主要受SPS影響,這與郭燕[27]和溫志靜等[28]研究認為SS-S在蘋果果實蔗糖積累中起主要作用的結論不一致,這可能與品種、發育階段不同有關。另外本研究中還發現‘SGP-1’果實中的果糖、葡萄糖含量與SPS、SS-C和SDH 活性存在顯著或極顯著正相關,而‘金冠’果實中的果糖、葡萄糖含量除與上述3個酶活性有密切正相關外,還與SS-S、AI和NI呈正相關?？梢?蘋果果實的糖代謝存在復雜性,品種差異以及發育階段不一致均有可能導致相關性改變,可溶性糖含量與代謝酶活性的相關性還有待進一步研究。

4 結論

‘金冠’與‘SGP-1’果實中可溶性糖及各糖組分變化規律總體一致,但積累速度不同,至成熟時‘SGP-1’果實的果糖、葡萄糖含量顯著高于‘金冠’,而山梨醇、蔗糖含量顯著低于‘金冠’,更高的果糖含量提升了‘SGP-1’果實風味。兩材料果實的糖代謝酶在前期變化趨勢不同,后期基本一致,‘SGP-1’糖代謝相關酶活性總體表現為前期顯著高于‘金冠’,后期除SOX 活性高于‘金冠’、SS-C活性持平于‘金冠’外,其余酶活性顯著低于‘金冠’。果實發育前期‘SGP-1’果實各糖組分含量主要受SDH 和SS-S 調控,而‘金冠’則主要受SDH 和NI調控;果實發育后期‘SGP-1’果實各糖組分含量主要受SPS、NI調控,而‘金冠’則主要受SPS、SS-C和AI調控?？梢?‘SGP-1’果實可溶性糖積累的關鍵期為發育前期,而‘金冠’可溶性糖則在發育后期快速積累,且對兩材料糖積累起主要調控作用的酶活性和種類存在差異。