半滑舌鰨細胞分裂周期蛋白42 基因克隆與結構預測

劉厚孚，譚靜，胡秀彩，管振國，呂愛軍，通信作者，孫敬鋒

（1.天津農學院 水產學院 天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300392；2.天津鼎正新興生物技術有限公司，天津 300383）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國主要的海水經濟魚類之一[1]，具有活動范圍小，個體大、生長快、營養等級低、食性溫和等性狀優點。近年來，隨著養殖規模日益擴大，半滑舌鰨皮膚潰爛病、腹水癥等病害問題也隨之而來，對水產養殖行業造成了一定的經濟損失。目前，對于半滑舌鰨天然免疫和細胞分子免疫機制知之甚少[2-3]。

細胞分裂周期蛋白42（Cell division cycle 42，Cdc42）屬于小Rho GTPase 家族，與GTP 結合時處于活化狀態，與GDP 結合時處于失活狀態，是一種具有酶活性的Rho GTP 酶[4-5]。研究發現，Cdc42 參與多種細胞功能，包括調節細胞骨架、控制細胞極性等[6-7]。迄今，對人和哺乳動物研究表明，Cdc42基因與疾病和機體免疫應答密切相關，包括癌癥、艾滋病等多種疾病發生，且參與免疫與炎癥反應[8-9]。BURBAGE 等研究發現Cdc42是B 細胞分化的關鍵調控因子，是抗病毒體液免疫所必需的因子[10]；HADDAD 報道Cdc42與WASP之間相互作用引導SDF-1 誘導T 淋巴細胞趨化[11]；WESTERBERG 等研究表明，Cdc42、Rac1 和Wiskott-Aldrich 綜合征蛋白參與B 淋巴細胞的細胞骨架調節[12]；王緣等[13]在小鼠巨噬細胞中特異性敲除Cdc42基因，并使用LBS 誘導炎癥反應，結果發現小鼠死亡率增高，證實Cdc42在免疫調節中發揮了重要作用。

在水產動物中，針對Cdc42基因克隆及表達分析的研究鮮有報道[5,14]。關于半滑舌鰨Cdc42的功能研究尚未見相關文獻報道。因此，本研究以半滑舌鰨為研究對象，對其皮膚細胞分裂周期蛋白42 基因進行克隆，并對其基因編碼序列進行蛋白結構預測分析，為今后深入研究Cdc42基因功能提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）取自天津市海發珍品實業發展有限公司，體重平均（110±10）g，取其皮膚組織立即投入液氮冷凍，后轉入-80 ℃冰箱保存，用于總RNA 提取。RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR Master Mix、PCR Buffer 體系購自TaKaRa 公司，DNA Marker、UNIQ-10 柱式膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

根據半滑舌鰨Cdc42基因編碼序列（登錄號：XM_008320479.3），用生物軟件Primer5.0 設計1對特異性引物（表1），引物由蘇州金唯智生物有限公司合成。

表1 Cdc42 的特異性引物

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成

參照HUSAIN 等[15]的提取方法，使用TRIzol Reagent 試劑提取半滑舌鰨皮膚組織的總RNA，并分別加入氯仿、異丙醇和乙醇，離心、震蕩、棄去上清液等。使用超微量分光光度計測量提取的總RNA 濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。以提取的總RNA 為模板，用TaKaRa 的反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成cDNA。合成的cDNA 保存于-20 ℃備用。

1.2.3CsCdc42基因克隆

參照舒歡歡等[16]的克隆步驟進行試驗，用25μL 體系擴增半滑舌鰨皮膚的Cdc42基因。反應體系具體為：Cdc42基因DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，無菌超純水11 μL，2×Taq PCR Mix 10μL。PCR 反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，30 個循環；72℃延伸5 min。使用1%瓊脂糖PCR 檢測，切膠回收，并與pMD18-T 載體連接、轉化到感受態大腸桿菌DH5α 后，挑選陽性單克隆菌液送到天津金唯智生物工程有限公司測序。

1.2.4CsCdc42基因序列與結構預測

參照譚靜等[17]的文獻進行。采用ORF 程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找序列的開放閱讀框，利用在線分析軟件EXPASY、PHYRE2、SMART 和PSIPRED 進行生物信息分析及結構預測，用DNAStar 軟件進行基因蛋白抗原性、親水性等理化特性分析，用ClustalW 及MEGA 7.0 進行序列比對及構建系統進化樹分析。

2 結果

2.1 半滑舌鰨CsCdc42 基因克隆

以半滑舌鰨皮膚組織cDNA 為模板，采用RT-PCR 方法擴增Cdc42基因得到目的條帶，并與預期片段大小一致（圖1）。切膠回收、將其亞克隆至pMD18T 載體，轉化大腸桿菌DH5α 后、挑選pMD18T-Cdc42 陽性克隆基因測序，測序獲得半滑舌鰨Cdc42目的基因序列及其引物（圖2），命名為CsCdc42。

圖1 半滑舌鰨CsCdc42 基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

圖2 半滑舌鰨CsCdc42基因的引物序列

2.2 半滑舌鰨 Cdc42 cDNA 編碼蛋白的序列特征及生物信息學分析

半滑舌鰨 CsCdc442 基因測序獲得目的基因序列的片段長度為847 bp，推測編碼191 個氨基酸（圖3）。預測理論等電點（PI）為6.73，分子量為21.26 kD。通過生物信息學方法預測表明，Cdc42基因沒有信號肽，推測 Cddc42 可能不是分泌蛋白。對半滑舌鰨CDc42蛋白跨膜區分析表明，該蛋白無跨膜區，說明該蛋白為非跨膜蛋白。親疏水性分析結果顯示疏水性最小值約為-3.01，最大值約為3.00，，整個多肽鏈中為負值的氨基酸占多數，推測CsCdc42 為親水性蛋白（圖4），蛋白平均系數GRAVY 為-0.195。

圖3 半滑舌鰨CsCdC42 cDNA編碼區序列及其推導的氨基酸序列

圖4 半滑舌鰨CsCdc42 親疏水性分析

預測CsCdc42 含有7 個主要抗原表位（27-28、61-63、90-92、120-122、131-133、164-166、181-183 aa），說明該基因蛋白抗原性良好（圖5）。

圖5 半滑舌鰨CsCdc42 蛋白表面和抗原指數分析

進一步對CsCdc42 蛋白修飾位點預測發現CsCdc42 沒有糖基化位點，有多個磷酸化位點，當閾值≥0.5 時共有17 個磷酸化位點，其中8 個絲氨酸（Ser）磷酸化位點（S22/30/70/82/84/89/90/126），6 個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點（T2/24/25/109/117/161），3 個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點（Y30/64/157）。此外，閾值≤0.5 時，絲氨酸磷酸化位點主要分布在80-90 aa之間，蘇氨酸磷酸化位點主要分布在20-40 aa 之間，酪氨酸磷酸化位點在20-40 aa 之間顯著分布（圖6）。

圖6 半滑舌鰨Cdc42 基因的磷酸化位點分析

2.3 Cdc42 多序列比對與系統發育樹分析

采用Blast 軟件在線搜索結果顯示，CsCdc42與斑馬魚（Danio rerio，NP_956926.1）的氨基酸同源性最高為99.43%，其次與人（Homo sapiens，pdb|2ODB|A）和青鳉（Oryzias melastigma，XP_024148790.1）分別為98.43%和97.91%，與虹鱒（Oncorhynchus mykiss，ACO08171.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，AWP03434.1）、果蠅（Drosophila willistoni，XP_002075304.1）、凡納濱對蝦（Penaeus vannamei，AIY53010.1）、雙斑蛸（Octopus bimaculoides，XP_014784384.1）的同源性分別為95.81%、94.76%、93.19 %、91.10%、91.10%。進行CsCdc42基因氨基酸多重序列對比分析，發現在人、斑馬魚、青鳉、果蠅等模式生物以及多種水產動物中，Cdc42 蛋白序列含有RHO 結構域、ATP/GTP 結合位點、?；稽c3個高保守區域，這可能與細胞分裂周期蛋白功能有關（圖7）。從NCBI 數據庫下載人、斑馬魚、大菱鲆、青鳉、虹鱒等17 個Cdc42相關基因序列，構建系統發育樹分析結果顯示，CsCdc42與斑馬魚（Danio rerio，NP 956926.1）、人（Homo sapiens，pdb|2ODB|A）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，KAF0035709.1）、青鳉（Oryzias latipes，XP 011475757.1）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss，XP 021472057.1）親緣關系最近，自然聚為一支；與南美白對蝦（Penaeus vannamei，AIY53010.1）、果蠅（Drosophila melanogaster，AAD43792.1）親緣關系較近；與南極鱈（Notothenia coriiceps，XP_010773360.1）、雜色鳉（Cyprinodon variegatus，XP_015226325.1）、斗魚（Betta splendens，XP_029023734.1）、鯽（Carassius auratus，XP_026109495.1）等親緣關系較遠，聚為另一支（圖8）。

圖7 不同物種Cdc42 氨基酸序列多重比對分析

2.4 半滑舌鰨Cdc42 結構預測

對半滑舌鰨Cdc42 結構預測結果表明，Cdc42只有一個RHO 結構域，氨基酸位點在6-179 aa。二級結構預測α 螺旋占30.9%、β 折疊占24.6%、無規則卷曲占44.5%，說明Cdc42 主要由α 螺旋和無規則卷曲構成（圖9A）；由三級結構預測可以看出CsCdc42 是一個球形蛋白質（圖9B）并且和二級結構結果基本一致，同時預測在氨基酸10-18 aa 為CsCdc42 的ATP/GTP 結合位點，在54-60 aa 為CsCdc42 的?；稽c（圖9C）。

圖9 Cdc42 基因編碼的蛋白結構預測

3 討論

迄今為止，對于魚類的Cdc42基因研究相對較少，關于半滑舌鰨Cdc42功能研究尚未見相關文獻報道[5-6]。胡默儼[14]對草魚Cdc42基因克隆表達分析，結果表明Cdc42基因編碼191 個氨基酸，為不穩定性蛋白，無跨膜結構域和信號肽，并只含有一個保守結構域RHO，這與本試驗半滑舌鰨CsCdc42基因序列分析結果基本一致。進一步通過Cdc42氨基酸序列構建系統發育進化樹分析，結果顯示半滑舌鰨CsCdc42 屬于Rho 超家族酶蛋白家族，而且與斑馬魚、人、青鳉和虹鱒Cdc42親緣關系最近。此外，預測半滑舌鰨CsCdc42含有7 個主要抗原表位（27-28、61-63、90-92、120-122、131-133、164-166、181-183 aa），說明該基因蛋白抗原性良好，其抗原保護性功能值得進一步研究。

Cdc42 是Rho 蛋白家族中研究比較深入的成員，可以調節肌動蛋白細胞骨架和各種細胞黏附，對于機體發育與繁殖有重要影響[7]。在對人類和哺乳動物的研究中發現Cdc42與許多器官以及各種疾病密切相關。LI 等[18]通過將Cdc42-flox 小鼠與肌球蛋白輕鏈（MLC）2a-Cre 小鼠雜交試驗，確定Cdc42在心肌細胞增殖和細胞黏附中有重要作用。OLENIK 等[19]通過采用原位雜交和Western blot方法研究Rho GTPases 在成年大鼠大腦中的表達情況，在海馬神經元、齒狀回顆粒細胞和肺門細胞中檢測到大量RhoA、RhoB、Rac1 和Cdc42 mrna，Western blot 檢測到海馬、小腦、丘腦和大腦皮層中含有RhoA和Cdc42蛋白，所以認為Rho GTPases在大腦細胞功能調節中發揮作用。ZAN 等人通過逆轉錄聚合酶鏈反應檢測20例食管癌及癌旁正常組織中Cdc42和Rb基因表達，結果發現Cdc42基因異常表達影響了食管癌發生[20]。CHERNICHENKO等[21]通過單個細胞軌跡分析對鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）進行siRNA 篩選，認為Cdc42在癌細胞神經侵襲及治療癌癥方面有重要意義。目前，對水產動物的Cdc42基因研究發現，Cdc42可能對于水產生物防御病原體的細胞以及分子機制有重要作用。李麗麗等[5]通過對斑節對蝦Cdc42基因克隆表達分析，研究斑節對蝦在哈維弧菌（Vibrio harveyi）脅迫下的表達情況，結果發現Cdc42在血淋巴中的表達較高，并且在哈維弧菌脅迫情況下發現Cdc42上調顯著，證明Cdc42可能具有重要免疫調節作用；胡默儼[14]在草魚Cdc42克隆試驗中，通過熒光定量PCR 技術發現Cdc42基因在頭腎、中腎、肝、脾等免疫器官中均有不同程度表達，但Cdc42在水產動物中的具體免疫機制仍不清楚，值得進一步研究。

本研究采用RT-PCR 方法對半滑舌鰨皮膚Cdc42基因進行克隆，并對其編碼蛋白質進行序列和結構預測分析，為今后深入研究Cdc42基因功能打下基礎。關于魚類細胞分裂周期蛋白42 基因序列特征及其蛋白功能，今后仍有待進一步試驗研究證實。