microRNA研究概況及其在農業生產中的應用前景

李祥，劉龍，安世恒，關若冰

（河南省害蟲綠色防控國際聯合實驗室/河南農業大學植物保護學院，河南鄭州，450002）

0 引言

成熟的microRNA（miRNA）長度約為18～35 nt，不具有開放閱讀框（ORF），因而不能編碼蛋白質，其序列在不同物種的基因進化上高度保守，并且在生物發育過程中miRNAs的表達表現出明顯的組織特異性和時間特異性（Jonas and Izaurralde，2015；Lukasik and Zielenkiewicz，2016）。miRBase Sequence Database（http：//www.mirbase.org/）作為最大的miRNA信息存儲數據庫，目前已收錄了超過48860個miRNA成熟體序列，涵蓋了包括動物、植物和微生物在內的271個物種（Kozomara et al.，2019）。

生物體內絕大多數基因可能受到miRNA的調控，且同一miRNA可能調控多個功能相似甚至功能完全不相關基因的表達（Seitz and Pinzón，2017）。準確識別miRNA的靶基因是明確其功能必不可少的環節。但目前，還沒有十分準確、有效的預測手段，已明確了靶基因的miRNA也比較有限，不足以對后續研究提供充足的參考信息，極大限制了mi-RNA的相關研究和生產應用。本研究概述了miRNA的特征、在細胞內的形成過程、對靶基因的調控機制及其在生物體內的功能，尤其是miRNA在昆蟲生長、發育以及植物-病原物互作中的關鍵作用，并討論了miRNA作為生物農藥的研發潛力。在此基礎上，進一步從軟件預測和試驗分析等角度詳細論述了miRNA靶基因預測和驗證的方法及其優、缺點，并指出當前研究的不足和未來的發展方向，為今后miRNA相關研究和生產應用方面提供一些思路。

1 miRNA在細胞內的形成過程

生物體內的少數miRNAs轉錄于編碼基因的內含子區域，其產生會被所在基因的轉錄行為所影響；而大多數miRNAs來源于基因間的序列，通常擁有獨立的啟動子及調控元件（Chang et al.，2015）。當轉錄因子與miRNA轉錄序列的調控位點結合后，會激活RNA聚合酶II（RNA polymerase II）并在細胞核內生成初級轉錄物，即初級miRNA（Primary miRNA，pri-miRNA）（Roden et al.，2017；Creugny et al.，2018）。有研究證實，極少數pri-miRNA（如pri-mir-634）是在RNA聚合酶III的催化作用下形成（Paraboschi et al.，2017）。

miRNA成熟體的形成通常需要pri-miRNA經過2次剪切。在動物細胞核中，pri-miRNAs在Drosha蛋白的作用下，首先被剪切形成miRNA前體（Precursor miRNA，pre-miRNA）（Lee et al.，2003；Roden et al.，2017）。Drosha蛋白隸屬于核糖核酸酶III（RNase III）家族，通常存在于細胞核內，能特異性的識別雙鏈RNA結構并將其剪切成3′端具有2個突出堿基的產物（Lee and Shin，2018）。pre-miRNA的長度一般為60～80 nt，可形成典型的莖—環結構以維持較低的自由能（Creugny et al.，2018）。核質轉運蛋白Exportin5（Exp5）是一種Ran-GTP依賴性蛋白，能識別并結合pre-miRNA的莖—環末端結構，并將剪切好的pre-miRNA運出細胞核。進入細胞質后，GTP發生去磷酸化反應變為GDP，同時釋放pre-miRNA（Kim et al.，2016）。在此過程中，Exp5不僅承擔了運輸功能，還保護著pre-miRNA不被其他酶類降解（Zeng and Cullen，2006；Wu et al.，2018）。

在細胞質中，RNase III家族的另一個成員Dicer將對pre-miRNA進行第二次剪切，形成一個不穩定的miRNA：miRNA*復合體（Sand，2014）。在此過程中，TRBP（Transactivation-response RNA-binding protein）和PACT（Protein kinase R-activating protein）兩類輔助蛋白能大幅提高Dicer對miRNA：miRNA*復合體的親和力并從中挑選出合適的miRNA成熟體；其中，TRBP負責對底物進行識別和定位（Komori et al.，2020），PACT則促進了Dicer的剪切過程（Wilson et al.，2015）。在miRNA：miRNA*復合體中，穩定性較高的miRNA即成為miRNA成熟體，并將協同AGO、Dicer等蛋白共同形成miRNA沉默誘導復合體（miRNA-induced silencing complex，miRISC），另一個miRNA則會在細胞內被迅速降解（Krol et al.，2010；Carthew et al.，2017）。如果這兩個miRNAs的5'末端的穩定性相近，則有可能形成2種不同的miRNA成熟體以及相應的miRISC（Sheu-Gruttadauria and MacRae，2018）（圖1）。

植物miRNA的形成方式與動物存在明顯的差異，最典型的差異是植物中不存在Drosha或與其同源的蛋白（Chorostecki et al.，2017）。但在擬南芥（）中 發 現 了Dicer的 同 源 物DCL1，并證明了DCL1主要在細胞核內表達，并參與了pre-miRNA和miRNA成熟體的形成過程（Suarez et al.，2015），因而推測DCL1表現出類似Drosha或Dicer的功能。需要注意的是，植物miRNA通常在細胞核內被加工成熟，而動物miRNA的成熟通常發生在細胞質中，進一步佐證了上述推斷。此外，植物中HYL1的功能與動物中的TRBP和PACT相似，均發揮協同催化的作用；植物中HST則是Exp5的同源物，被認為是miRNA-miRNA*復合體運出細胞核的載體蛋白（Mengistu and Tenkegna，2021）。

圖1 miRNA在動物體內的生物合成過程（Ameres and Zamore，2013）Fig.1 miRNA biogenesis process in animals（Ameres and Zamore，2013）

2 miRNA對靶基因的調控機制

成熟的miRNA會協同AGO、Dicer、TRBP、PACT等元件形成miRISC，并通過對mRNA進行降解或翻譯抑制兩種不同的作用機制來實現其沉默效應（Tang，2005；Liu et al.，2017）。miRNA與靶基因序列的互補程度則決定了具體的調控機制。

大多數植物miRNA與其靶標mRNA的序列幾乎完全互補，其作用機制與siRNA形成的RISC相類似（郝大海和龔明，2020），即與mRNA結合后，miRISC引導其中的外切酶和內切酶同時作用，降解所在的mRNA。反應完成后，miRISC被完整的釋放出來并參與下一個剪切事件（Samad et al.，2017）。值得注意的是，植物miRNA與靶基因的結合位點可能存在于整個mRNA序列；而動物miRNA的結合位點通常定位在mRNA的3'UTR。與植物不同的是，動物miRNA僅在靠近5'端的少數序列與靶基因完全互補，而其余序列的互補程度則很低，使得miRNA在動物體內的主要作用方式為翻譯抑制。目前普遍認為在動物體內miRISC能在不破壞mRNA結構的前提下，抑制其翻譯過程中的某個階段，導致無法合成或減少合成相應的蛋白產物（Ameres and Zamore，2013；Gebert and Macrae，2019）。動物中多數miRNAs與靶標mRNA的結合位點位于3'UTR，極大降低了靶基因的預測范圍。但越來越多的研究報道指出，miRNA-mRNA的結合位點也可能存在于靶基因的編碼區（CDS）和5'UTR（Baizhigitova et al.，2018），這使得研究者需要重新評估和審視以前的研究。

3 miRNA對生物的調控功能

3.1 miRNA在生物體內的一般功能

目前對于miRNA的功能研究主要采用反向遺傳學的方法。一方面通過突變靶基因的結合位點來觀察miRNA的結合情況以及相應的表型變化，另一方面通過過表達或抑制miRNA的表達水平來觀察所造成的影響（Gebert et al.，2019）。大多數miRNAs行使調控作用時，往往是微調（Fine-tune）靶基因的表達水平使其維持適宜的表達豐度，因此，改變miRNA的表達量并不一定能觀察到十分明顯的表型變化。在探索miRNA的功能時，研究者通常采用高通量測序加生物信息學分析的方法，明確miRNA的時空表達特性，并根據miRNA與mRNA的序列互補程度和結合穩定性預測其靶基因，然后結合分子生物學手段對miRNA與mRNA的互作關系進行驗證，并根據靶基因的作用判斷miRNA的功能。

植物miRNA與靶基因的結合序列幾乎完全互補，極大提高了靶基因預測的準確性（崔俊霞等，2018）。已知的植物miRNA靶基因中，很多都是在生長發育中起關鍵調控作用的轉錄因子基因（Zhang et al.，2006a；Reichel et al.，2015）。Pandey等（2019）指出，植物miRNA可通過抑制細胞分化過程中的關鍵基因控制植物細胞發育的方向。動物miRNA的功能鑒定相對困難。由于“不完全匹配”的機制，動物miRNA的靶基因預測會產生大量的假陽性結果，必須經過嚴格的試驗驗證才能確定。與植物一樣的是，動物miRNA的靶基因中也包含大量轉錄因子基因，并在生物體生長發育過程中發揮重要功能（Vorozheykin and Titov，2020）。更多的研究表明，miRNA表現出能調控大多數生理和病理過程的潛力，包括發育階段的劃分、干細胞分化、神經發育、細胞生長和凋亡、激素分泌、脂類代謝、病變和癌癥等（Llave and Carrington，2002；Vikram et al.，2015）。此外，不同外部因子或內部生理變化所導致的表達差異暗示了miRNA具有更廣泛的作用。近年來，生物信息學分析結果表明，miRNA具有多元化的調控路徑，甚至具備調控所有生理活動的潛力（Gebert and Macrae，2019）。

3.2 miRNA在昆蟲發育中的功能

作為生物體內一類重要的調控因子，miRNA廣泛參與了昆蟲的生長發育、生殖、代謝、免疫防御等絕大多數的生理生化過程。在果蠅中，通過敲除AGO蛋白阻止miRNAs發揮功能，能顯著抑制其卵母細胞的形成（Azzam et al.，2012），且構建基因缺失的突變品系能阻礙果蠅卵母細胞的成熟（Nakahara et al.，2005）。在褐飛虱（）中抑制基因的表達，獲得了與果蠅相似的表型（Zhang et al.，2013）。、等通過調節Notch信號通路和骨形態發生蛋白信號通路中關鍵基因的表達，可阻止果蠅的生殖干細胞（Germline stem cells）分 化（Poulton et al.，2011；Li et al.，2012），而啟動生殖干細胞的分化也同樣需要miRNA的調控（如）（Pek et al.，2009）。昆蟲神經系統發育同樣需要miRNA的參與，如（Li and Carthew，2005）、（Loya et al.，2009）、（Weng and Cohen，2012）等；缺失這些miRNAs的表達則會導致神經退行性功能缺失、神經干細胞分化異常、信號傳導受阻等發育或功能缺陷。是參與昆蟲邊界形成的關鍵基因之一，能通過抑制基因的表達從而阻止果蠅翅芽盤（Wing imaginal discs）的細胞增殖；基因被抑制后，其靶基因大量表達，該基因又進一步促進了翅芽盤上背—腹軸向的分化（Becam et al.，2011）?；虻臅r序性表達從時間維度上控制了翅芽盤上的細胞增殖，缺失的果蠅翅尺寸會明顯減?。–aygill and Johnston，2008）。

miRNA對昆蟲變態發育中的激素代謝、蛻皮行為、組織降解和重建同樣具有重要的調控作用（Ylla et al.，2016；Belles，2017）。在果蠅的整個發育過程中，多個miRNAs的表達水平與蛻皮和變態過程密切相關。蛻皮激素功能通路中的關鍵基因能顯著上調、、等基因的表達水平，并抑制基因的表達，共同維護蛻皮過程的有序進行（Sempere et al.，2002，2003）。能靶向果蠅中蛻皮激素的受體基因，從而形成一個反饋調控環，以維持蛻皮激素的適宜滴度并適時啟動或終止相應的蛻皮過程（Varghese and Cohen，2007）。在家蠶（）中，同樣能作用于蛻皮激素調控網絡的多個基因和步驟，共同維持生長發育的有序性（He et al.，2019a，2019b）。通過負調控轉錄因子dLMO來控制果蠅翅發育過程的細胞凋亡，塑造適宜的翅形（Epstein et al.，2017）；在褐飛虱的長、短翅型分化和發育中，基因能響應寄主營養水平和胰島素受體基因的信號調控，通過調節基因的適宜表達水平來促進種群向長翅化或短翅化發展（Li et al.，2021）。這也間接說明miRNA對昆蟲生理生化過程的調控作用存在一定的保守性，在今后的應用實踐中，應經過合理的篩選和驗證，基于miRNA調控作用的藥劑開發可兼顧特異性和廣譜性雙重優勢。

3.3 miRNA在植物抗病中的功能

miRNA不僅通過作用于轉錄因子來調控植物自身的生長發育，還參與植物與病原物的“斗爭”。這些致病微生物通過表達或誘導寄主植物表達某些miRNAs來抑制寄主的免疫防御，協同致病過程（Umbach and Cullen，2009）。例如丁香假單胞菌（）侵染擬南芥時，通過誘導寄主過表達來抑制自身防御基因和的轉錄，關閉植物的免疫過程（Niu et al.，2016）。黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus）通過編碼一種2b蛋白與寄主植物的AGO1蛋白競爭性結合，從而阻礙植物對自身miRNA的加工和修飾，導致由miRNA介導的寄主防御反應受到抑制（Zhang et al.，2006b）。另一方面，植物在抵御致病微生物的侵染時，會有目的地上調或下調一些內源性miRNAs的表達，用于激活自身免疫系統，以提高對病原物的抗性。當煙草受到煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）侵染時，通過降低自身的表達水平來促進免疫基因的表達，以抵御該病毒（Jiang et al.，2019）。

利用基因編輯或轉基因技術，可有目的地使植物過表達某些特定的miRNAs，從而沉默病原物的關鍵致病基因。該項技術已應用于水稻、番茄、煙草等作物的品種選育（Schwab et al.，2006；Ossowski et al.，2008）。例如，在煙草基因組中插入人工構建的miRNA前體序列，使其特異性地過表達目的miRNA片段，可以沉默馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y）的致病基因HC-Pro和馬鈴薯X病毒（Potato virus X）中的致病基因p25，最終削弱這兩種病毒對煙草的致病能力（Ai et al.，2011）。針對田間多種病害混合發生的現狀，可以針對病原物致病基因的保守序列構建miRNA表達載體，以拓寬農作物的抗病譜（Zheng and Qu，2015）。

4 miRNA的靶基因預測

隨著高通量測序技術和生物信息學的發展，生物中大量miRNA被相繼鑒定出來。一些miRNAs通過作用于昆蟲、植物或病原微生物中的關鍵基因，從而調控昆蟲的生長發育和植物-病原物的互作過程，在農業害蟲防治和植物抗病免疫等方面顯示出非常好的應用潛力?；赗NA沉默技術的生物農藥研發也因此成為可持續植保發展的熱點研究領域。但如何從包含成百上千個miRNAs的生物轉錄組中準確篩選和鑒定出對靶標基因具有調控作用的mi-RNA成為限制該領域發展的一個難題。早在21世紀初期，Lai（2002）比對了果蠅中調控基因和基因的11個miRNAs，結果發現二者的miRNAs 5'端的前8個堿基（實際為靠近5'端的6個堿基）與靶基因序列能精確互補，稱這些堿基為種子序列（Seed region），并推測種子序列是miRNA發揮轉錄后調控作用的關鍵因素。這一發現確立了以種子序列為依據進行miRNA靶基因預測的計算機理論基礎。迄今為止，尚未發現比利用種子序列進行預測更準確的手段。近十幾年來，逐步確立了以種子序列為核心，miRNA-mRNA復合體的熱穩定性和二級結構為依據的理論體系，并誕生多種各具特色的預測軟件（Chen et al.，2018）。

4.1 根據miRNA-mRNA復合體的熱力學穩定性進行預測

miRanda是首個以miRNA與潛在靶基因之間熱力學穩定性為依據進行預測的軟件，該軟件不受物種限制，還可在Windows、Linux等多種操作平臺上進行不聯網運行（Ahmadi et al.，2013）。miRanda強調miRNA與靶基因互補序列在進化上的保守性，主要參考miRNA 5'端序列與靶序列之間C：G、A：U、G：U的配對情況進行熱穩定性評估，并構建出相應的打分矩陣，同時根據miRNA 5'端和3'端各自的互補特性進行區別評分。用戶還可根據實際需要自行定義閾值，從而篩除不穩定的復合體（Ahmadi et al.，2013；程爽等.，2018）。此后，更多基于熱力學穩定性的miRNA靶基因預測軟件被相繼開發。例如，RNAhybrid算法強調根據結合能來推算最佳結合位點，并獲得最穩定的配對模式，避免了miRNA和靶基因之間形成無關的復合體結構（Krüger and Rehmsmeier，2006；Pio et al.，2014）。PITA算法僅根據靶基因的3′UTR對已形成穩定二級結構的序列進行剔除（Beretta et al.，2017；Kertesz et al.，2017），但出現跨度較大的互補配對情況或較大的二級結構時，該算法會產生一部分假陽性結果。

基于miRNA與靶基因的作用方式，以及不同miRNAs間的序列比對分析，Miranda等（2006）開發了第二代預測軟件——RNA22。該軟件是首個不使用同源保守信息進行預測的軟件，具有很強的靈活性，可將靶點的預測范圍延伸至整個mRNA序列。RNA22以Rfam 3.0數據庫中miRNA成熟體為訓練集合，采用一種模糊匹配的模式進行預測。該算法將供試序列分割成靶點島（Target island），并依次評估與miRNA的結合情況來尋找假定結合位點（Miranda et al.，2006；Plotnikova and Skoblov，2018）。

4.2 根據物種間的序列保守性進行預測

種子序列通常在物種之間的保守性很高，研究者可根據靶基因序列的同源性進行預測。TargetScan是目前使用頻率最高的預測軟件。該算法提出了“假陽性率”的概念，并根據物種之間的保守性原則對預測結果進行二次評估（Agarwal et al.，2015）。TargetScan首先搜索并比對不同物種之間的mRNA 3'UTR序列的保守區域，然后根據miRNA與潛在靶標的3'UTR及其周圍序列的互補程度進行綜合評估（Lewis et al.，2005；Wu et al.，2017）。該算法以保守性為主要依據，其局限性在于不能對具有物種特異性的互補情況進行有效預測。TargetScan S則是在TargetScan基礎上進行了優化，不再對miRNA非種子序列區域與靶序列匹配的自由能進行評估，而是增加對人類、鼠、狗、雞等一些進化距離較遠的物種進行保守性分析，進一步提高了預測的準確性（Huang et al.，2019）。

4.3 基于多個結合位點進行預測

miRNA不僅可調控多個mRNAs，也可作用于同一mRNA的多個位點?；诖爽F象，對多個結合位點進行同時預測時，可通過增加信噪比參數對預測結果進行適當地篩除。盡管這種算法可能會過濾一些真實靶標，但其優勢在于預測結果更加準確（Ritchie et al.，2009a，2009b）。PicTar主要應用于脊椎動物和無脊椎動物中的miRNA靶基因預測，是多靶標和多結合位點預測的代表算法。該算法不僅能同時評估多個結合位點，還對miRNA-mRNA結合能力進行綜合評估，甚至允許種子序列出現不完全匹配的情況，并進行區別打分（Sarker et al.，2011）。此外，該算法還考慮了結合位點的保守性因素，并關聯了多個網站的miRNA信息數據庫。

4.4 根據miRNA和mRNA的表達水平進行預測

一些miRNA通過降解mRNA來阻斷其翻譯過程（Ameres and Zamore，2013；Samad et al.，2017），因此，在miRNA表達活躍的區域，相應的靶基因表達水平通常較低。檢測特定組織中miRNA與mRNA表達量的關系，也是靶基因篩選的一個重要手段（Jing et al.，2016；Ye et al.，2019）。該方法不同于匹配原則的算法，可以對基于序列互補原則而獲得的結果進行二次篩選，另一個優勢在于不單純依賴于3′UTR進行預測。但在動物中，一些miRNAs并不能直接影響mRNA的表達水平，或者影響十分微弱，導致很多真實的結果被忽視，此時可用檢測相關蛋白的表達水平代替對mRNA的檢測。

4.5 根據功能相關性進行預測

miRNA參與了生物體內大多數的生理生化過程（Llave and Carrington，2002；Lim et al.，2005），因此，可根據其功能分類對無關的預測結果進行剔除。mirBridge算法錨定一組或一類已知功能的mRNA，有針對性的對這些潛在靶標進行排查（Tsang et al.，2010）。此算法適用于一些具有特殊功能的基因或通路研究，但對于尚未進行功能劃分的miRNA和mRNA無法預測。

4.6 根據miRNA信息庫尋找潛在靶標

隨著miRNA-mRNA互作研究成果的不斷積累，一些研究者或機構建立了多種miRNA數據庫，以整合miRNA及其靶基因的相關信息。starBase（http：//starbase.sysu.edu.cn/）網站較為全面的收錄了由miRNA介導的mRNA降解組和CLIP-Seq等高通量測序數據，包含了miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA、miRNA-ceRNA等多種互作模式下的miRNA靶標信息。ChIPBase（http：//deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/）偏向于探討miRNA的轉錄和轉錄后調控作用，構建了比較系統的“轉錄因子-miRNA-靶基因”調控網絡。Tarbase（http：//microrna.gr/tarbase/）側重于收集已被試驗證實過的miRNA靶基因信息。此外，PMRD主要收錄植物miRNA的數據信息，miRGator v2.0則重點整合了疾病相關miRNA的研究結果。鑒于miRNA在序列和功能方面的保守性，收錄的研究結果被廣泛借鑒于當前的研究。但受限于miRNA相關研究的不系統性，這些網站建立的數據庫仍不夠全面。

5 miRNA的靶基因驗證

盡管目前已存在大量各具特色的預測軟件，但這些算法主要依賴于miRNA與靶基因的互補潛力進行預測，并強調種子序列的重要性。由于miRNAmRNA復合體允許一定程度的錯配、跳躍、G：U配對的情況出現，在很大程度上會出現許多錯誤的預測結果。在實際研究中，需要對預測的結果進行進一步分析和驗證。

miRNA的靶基因驗證試驗最初是以線蟲體為研究對象，通過構建miRNA缺失的突變體以獲得相反表現，從而證明miRNA與mRNA的調控關系（Lee et al.，1993）。這種方法受基因編輯技術等因素的局限，無法在生物中推廣使用。Vatolin等（2006）、Andachi（2008）將一段已知序列的特異性接頭連接至miRNA后進行反轉錄和擴增，進一步通過定量分析或高通量測序的方法成功鑒定出、LIN-14等靶基因。

當前驗證miRNA與靶基因的互作關系時，通常是人為構建出一套表達系統用于模擬相應的調控過程，并檢測mRNA表達的蛋白產物含量。報告基因檢測系統是驗證miRNA與靶基因互作時最常見的研究手段。當miRNA與mRNA上的作用位點結合后，能有效抑制其翻譯過程，并顯著減少蛋白產物的含量（Huang et al.，2020；Li et al.，2021）。將包含潛在結合位點的一部分或全部序列連接至報告基因（通常為熒光素酶基因）CDS的下游，并將構建好的重組質粒導入細胞系內進行表達；同時將miRNA的模擬物或表達載體共同轉染至細胞系中，經過一段時間后檢測熒光強度或者熒光素酶的活性。為核實miRNA與靶基因的作用位點，還可將結合位點序列進行突變，從而反向觀察結合情況，檢測報告基因的表達水平，用以驗證預測位點的真偽（Ritchie et al.，2010；Ye et al.，2019）。當細胞系內源表達的miRNAs包含供試miRNA時，也可通過外源轉入miRNA的抑制劑（如Inhibitors或Sponge vectors）對其表達進行抑制（Tang et al.，2017；Zhang et al.，2018）。經過miRNA處理后的細胞系，報告基因表達的蛋白產物可通過Western雜交、免疫組化、流式細胞術等方法進行定量分析（任禹珂等，2021）。需要指出的是，報告基因檢測系統中miRNA和結合序列是在人工干預的異源系統里進行相互作用，而在活體中miRNA和靶基因的表達均存在時空特異性；克隆到載體上的序列可能會因為二級結構發生變化而產生假陽性或假陰性的結果；細胞系內復雜多樣的生理生化過程也可能會干擾試驗結果。

6 展望

病蟲害的頻繁發生一直是限制農業發展的重要難題?；瘜W農藥是當前防治病蟲害的主要手段，但其不合理的使用造成了嚴重的環境問題和人畜安全問題。選育抗病蟲品種往往費時費力，難以滿足生產的迫切需求?；赗NA沉默技術的RNA生物農藥的研發帶來了新的農藥革命，該方法可用于殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等多種新型農藥的研制，并兼具特異性強、環境友好等特點，為可持續植保的發展提供了新的途徑（Dhandapani et al.，2019；Niehl and Heinlein，2019）。

鑒于miRNA在動物和植物中的重要功能，開發miRNA生物農藥成為未來病蟲害防治的重要選擇。如何使目的miRNA成功作用于靶標生物，是利用該技術進行病蟲害防治的關鍵。目前主要總結了兩種miRNA遞送方式：一種是利用轉基因或基因編輯技術使植物內源表達目的miRNA片段，待病原物侵染或昆蟲取食時，miRNA進入有害生物體內發揮相應的功能，該方式被稱為寄主誘導的基因沉默（Hostinduced gene silencing）；另一種方式是將體外合成的功能性miRNA經過穩定性處理制作成相應的殺菌劑或殺蟲劑，直接施用在作物上，該方式被稱為噴灑誘導的基因沉默（Spray-induced gene silencing）（Wang and Jin，2017；Zotti et al.，2018）。迄今為止，至少有5項基于RNAi原理的生物農藥獲準在田間投入使用，展現出了良好的應用前景。但需要指出的是，并不是所有的植物都能通過轉基因技術培育商業化的抗病蟲品種，也不可能做到同時防治多種病蟲害。對于外源施用的RNA生物農藥，除了較高的生產成本外，在田間的穩定性和持效性也一直是研究人員需要解決的難題。此外，為了避免脫靶效應和潛在的安全風險，miRNA的序列設計和靶基因的篩選均必須經過嚴密的科學論證。

經過十余年的發展，miRNA靶基因的預測和鑒定已發展成為一門較為系統的學科，為miRNA的功能鑒定和應用研發提供了便利。本研究對當前mi-RNA靶基因預測和驗證的研究方法進行較為系統地概述和比較，不僅指出這些方法的優勢和特色，還認識到當前研究手段的不足。通常，miRNA-mRNA復合體的形成需要考慮時間和空間上的特異性，因此，基于序列匹配的算法預測實際上并不能真實反應生物體內的相互作用模式?，F有的預測方法是在不丟失真實靶標的原則下盡量剔除無關結果，但受限于目前的miRNA理論研究的不足，想要兼顧預測的靈敏度和精確度仍有較大的距離。鑒于各種算法各有其利弊，學者們通常利用多個算法或手段分別進行預測后，再對結果集合進行比對。

對于今后miRNA靶基因預測領域的發展，可著重關注以下3個方面：（1）miRNA和mRNA的互補配對要考慮表達時間和空間上的一致性；（2）盡管已有不少算法增加了RNA二級結構分析，但對于較長序列的結構預測仍缺乏準確性，預測時也沒有考慮規避蛋白結合位點等功能區域；（3）miRNA-mRNA復合體的形成及穩定性機制方面的研究仍不夠完善，現有的理論基礎不能很好的支撐新算法的研發。在驗證預測結果時，還應注意以下情況：（1）miRNA過表達時通常能使其表達水平上調成百上千倍，可能會引起一些副作用并干擾了其他內源基因的表達；（2）人工干預下的靶基因驗證系統往往忽略了miRNA和mRNA的組織特異性表達特性；（3）改變miRNA的表達水平可能導致上千個基因的轉錄水平發生變化，但這種變化可能來自于靶基因變化而引起的間接調控；（4）不同miRNA在與靶基因結合過程中可能存在競爭或者協同作用，單一改變某個miRNA的含量可能無法模擬出真實的情況；（5）miRNA對靶基因的上調作用在目前的研究中往往被忽視。