蕓薹屬多倍體雜種減數分裂中染色體行為研究進展

陳紀鵬， 劉小林， 胡月清

(宜春學院生命科學與資源環境學院/江西省作物生長發育調控重點實驗室，江西宜春 336000)

多倍化在植物進化歷程中發揮著巨大作用，植物近緣種間的天然雜交和隨后發生的基因組自然加倍是推動植物進化、產生新物種的主要動力。細胞遺傳學研究表明，自然界約70%的被子植物是自然進化形成的異源多倍體，而且許多重要的栽培植物也都是自然形成的異源多倍體。比如小麥是在形成史上經過2次雜交和2次基因組加倍形成的異源六倍體。白菜型油菜與甘藍雜交再經基因組加倍后，經歷近萬年的進化演變成當前廣泛種植的甘藍型油菜。另外，像棉花、馬鈴薯等多種重要的栽培作物都在形成史上經歷過多倍化歷程。自然界多倍體植物的成功進化為作物遺傳育種指出新的思路。人工合成多倍體雖然表現出植株高大、生長旺盛、適應性強等優點，但往往出現配子育性下降、結實率低的缺憾。針對這一問題，人們的目光集中在植物多倍體配子的形成過程中，其中減數分裂就是配子形成的關鍵階段。

1 蕓薹屬多倍體的形成與演變

蕓薹屬包含大量的栽培植物和野生植物，約占十字花科植物種類的1/10，在我國就有15個栽培種，還形成了多個變種、亞種，如甘藍型油菜、白菜、芥菜等都是重要的油料作物和蔬菜作物，還有些作為藥用植物(如板藍根)和觀賞植物(如諸葛菜)廣泛種植。蕓薹屬植物大多數具有獨特的農藝性狀，如甘藍型油菜具有較高的種子產量和含油量，白菜、卷心菜、苞菜和芥菜等可形成碩大的葉球或膨大的根莖，西蘭花、花椰菜的花序則變形為主要的食用部位。

眾多的種類和多樣的形態以及重要的經濟價值都源自蕓薹屬復雜的遺傳背景。在長期進化和栽培馴化過程中，蕓薹屬經歷了多輪多倍化演變形成了龐大而復雜的基因組。20世紀30年代，日本學者Nagaharu提出蕓薹屬3個二倍體基本種和3個四倍體復合種之間的進化關系，即蕓薹屬禹氏三角(圖1)。他指出3個二倍體基本種有白菜(，AA)、黑芥(，BB)與甘藍(，CC)，它們兩兩雜交分別形成甘藍型油菜(，AACC)、芥菜型油菜(，AABB)和埃塞俄比亞芥(，BBCC，簡稱“埃芥”)。又經過大量的細胞遺傳學研究，人們提出了蕓薹屬的3個基因組(A、B、C)都起源于同一共同祖先，即單源進化論學說，這種說法后來也得到比較基因組學研究結果的驗證。蕓薹屬基因組起源的問題也存在較大爭議，但有一點共識就是3個基因組都由1個染色體數目為7的祖先種進化而來。但是，隨著分子生物學技術應用于遺傳研究中來，大量的研究結果顯示，蕓薹屬3個基因組并非起源于1個共同祖先，而是有2個起源，即A和C基因組有1個共同起源，而B基因組由另一個祖先種進化而來?；诒Ｊ氐耐葱蛄袠擞浐偷鞍踪|組學研究結果也支持二源論的說法。

伴隨著多倍化進程，基因組結構也發生著劇烈的變化，以適應多倍化帶來的基因組沖擊。白菜基因組來源于3個亞基因組(來自同一個7條染色體的祖先)，經序列重排、序列消除以及轉座子控制的基因沉默，最終形成二倍體白菜。全基因組測序結果顯示，白菜有4萬多個基因，并發現白菜基因組在進化歷程中的序列消除規律。RNA-seq技術檢測到甘藍型油菜基因組存在2萬多個SNPs及125 InDels多態性位點。還發現重復序列在甘藍基因組中占重要地位，整個基因組有56%的區域是由重復序列構成的。芥菜型油菜與白菜的全基因組序列比較顯示，2個物種的A基因組只有約45%的序列片段是一致的，芥菜型油菜在進化中發生了更大的序列變異。還有研究顯示，蕓薹屬植物C基因組比A和B基因組在進化史上保守性更高。分析甘藍型油菜全基因組測序結果得出，它由白菜和甘藍于7 500年前經雜交形成。它是當前測序的所有植物中基因數量最多的物種，大約有10萬個基因維持其生長發育。測序結果還顯示，白菜A基因組和甘藍C基因組之間存在著廣泛的序列重組。2021年，埃塞俄比亞芥全基因組測序工作完成，結果顯示，17條染色體相連全長1.087 GB，其中重復序列約占58.34%。進一步分析表明，埃芥基因組形成于4萬多年前，早于甘藍型油菜，但晚于芥菜型油菜。多倍化的同時伴隨著發生的基因組序列變化形成了蕓薹屬復雜的遺傳組成，復雜的遺傳組成不但促使形成了豐富的遺傳資源，還為蕓薹屬多倍體育種提供了廣闊的空間。但是，面臨合成多倍體配子育性差的難題，減數分裂染色體行為規律及其遺傳機制的研究顯得尤為重要。

2 蕓薹屬多倍體減數分裂過程

在絕大多數真核生物(動物、植物和真菌)中都發現了有性繁殖方式，而有性繁殖過程中形成雌雄配子的主要過程就是減數分裂。這是一個復雜的過程，DNA復制1次而細胞分裂2次，第1次分裂(MⅠ)前期同源染色體相互識別并配對與聯會、重組和分離，隨后進行第2次分裂(MⅡ)。經過連續2次細胞分裂形成配子。減數分裂不但為有性繁殖提供了染色體數目減半的配子保證了上下代間的遺傳穩定，還通過重組產生了種類多樣的配子，使后代具有豐富的變異基礎。減數分裂中復雜的染色體行為背后必然隱藏著復雜的遺傳機制，全基因組關聯分析顯示，甘藍型油菜中存在著與花粉育性有顯著關聯的區段，包含、等多個基因，這些基因以各種方式參與減數分裂中染色體配對、聯會復合體形成、DNA雙鏈斷裂與修復、同源重組等過程。

2.1 染色體配對

在MⅠ偶線期，同源染色體相互識別并配對。配對的結構和動力學因素來自于染色單體間交叉和著絲粒間連接，交叉的形成受多因素干擾呈現非隨機分布，這些連接點沿染色體縱向延伸最終形成穩定結構；同時，端粒之間形成束狀結構有助于輔助同源染色體對齊。在染色單體間交叉、著絲粒和端粒等多因素共同作用下，同源染色體配對并聯會。二倍體與天然異源多倍體同源染色體發生精準配對，終變期后分開。染色體配對保證了染色體發生均等分離，最終形成平衡而有活性的配子。然而在合成多倍體和單倍體中，不但會發生同源配對，還可能發生非同源配對，有些染色體也可能不配對。非同源配對導致在MⅠ后期正常的染色體分離規律變化，發生不均等分離而形成不平衡配子，往往導致配子敗育。在細胞水平上，多倍體雜種在減數分裂過程中染色體行為異常而導致配子敗育，此外還有染色體排列混亂、落后染色體或染色體橋等現象。

熒光原位雜交通過探針標記雜種不同基因組，可用于區分不同基因組的染色體，是研究多倍體雜種基因組互作的可靠技術。以黑芥B基因組為探針進行熒光原位雜交時，信號只出現在B基因組上，A、C基因組上無信號，且靈敏度較高。然而，A、C基因組起源于同一祖先，序列相似度較高，基因組原位雜交易產生信號交叉。因此，只能采用特異性更強的DNA序列做探針，如C基因組特異序列(BoB014O06)作為探針可將熒光信號特異標記在C基因組上。45S核糖體RNA基因和端粒序列也常用作蕓薹屬熒光原位雜交探針，這些探針標記在染色體特定位置，可用于區分不同的染色體。

由于沒有同源染色體存在，單倍體中基因組內或基因組間染色體部分同源關系常引起染色體非同源配對。小孢子培養獲得的蕓薹屬三倍體雜種(ABC)不同基因組間染色體以12%～18% 的頻率發生非同源配對(A1-C1、A2-C2、A3-C3和 A7-C6)，還有的染色體間發生頻率較低(小于1%)的非同源配對(A8-C8、A8-C9)。甘藍型油菜與黑芥的雜種(ABC)還檢測到黑芥B基因組與甘藍型油菜的AC基因組間異源配對，三倍體和六倍體雜種異源配對的花粉母細胞分別占38%和15%。白菜單倍體也以較高頻率發生非同源配對，超過50%的花粉母細胞至少形成3對二價體，而且像同源染色體配對結果一樣，在MⅠ后期配對染色體分開進入不同的子細胞。

合成多倍體中即使存在同源染色體，也可能發生非同源配對。對合成的蕓薹屬四倍體(AACC、AABB和BBCC)的研究發現，基因組內和基因組間染色體配對水平差異很大，基因組內染色體配對的概率小于基因組間配對，配對頻率取決于細胞質背景和基因組之間的相互作用。還發現黑芥B基因組內配對頻率小于白菜A與甘藍C基因組內配對的頻率，而A與C基因組配對頻率相似。減數分裂中不同染色體組間非同源配對易造成染色體易位而產生不對等交換。在合成六倍體(AABBCC)中，A基因組與C基因組染色體片段發生易位，結果就導致花粉育性下降。甘藍型油菜與甘藍雜交形成的三倍體雜種(ACC)減數分裂中出現染色體排列混亂，而且發生較高頻率的非同源配對，后期Ⅰ染色體不均等分離。合成多倍體減數分裂中染色體的非同源配對和單價體還會引起染色體消除，致使染色體組穩定性下降。染色體穩定性也是影響配子育性的因素，染色體越穩定的群體，花粉育性越好，而染色體不穩定容易丟失的群體，花粉育性就越差。

2.2 聯會復合體形成

聯會復合體(SC)是同源染色體與相關蛋白質在聯會過程中形成的特異結構，它將同源染色體從軸向連接起來，其空間模式影響著配對的染色體雙鏈斷裂和重組的全過程。同源染色體配對時，DNA雙鏈斷裂，而后修復愈合，錯誤的修復將產生交叉，而恢復性修復則不形成交叉。雙鏈斷裂修復以及交叉的形成促使同源染色體折疊成環狀并彼此靠近，聯會從斷裂修復位點開始，然后沿著同源染色體軸向延伸，最終形成聯會復合體。聯會復合體的形成過程比較復雜，有多種蛋白參與，如拓撲異構酶Ⅱ、凝聚蛋白、內聚蛋白和內聚蛋白相關蛋白等。在這個過程中，ZIP4作為一個主要平臺，將ZIP2-SPO16復合物與CM1-GMC2連接起來，從而啟動聯會復合體形成。ZIP4還與ZIP3、MSH5相互作用，后者與伴侶蛋白 MSH4一起穩定聯會復合體結構(圖2)。

采用免疫熒光定位觀察相關蛋白的生成和分布是揭示聯會復合體形成特征的有效方法。在蕓薹屬3個二倍體和3個四倍體栽培種中均克隆到聯會輔助蛋白ASY1基因，雖然不同種間存在序列差異，但功能完全相同。在蕓薹屬及其模式植物擬南芥中均發現，ASY1參與聯會復合體形成過程，聯會復合體形成早期，在同源染色體軸向上出現蛋白檢測信號，而后信號位點增多并沿著聯會復合體軸向延伸，信號幾乎延伸到聯會同源物的整個長度；當減數分裂進入終變期聯會復合體解體時，信號也隨之消失。這表明ASY1的形成與聯會復合體形成有時間和空間上的相關性。免疫共沉淀反應發現，在蕓薹屬與擬南芥中還存在與ASY1相互作用的另一種蛋白ASY3，這是一種減數分裂所需的具有卷曲螺旋結構的蛋白，這2種蛋白在染色體聯會復合體中相結合形成特定結構共同發生作用。ASY3突變體中，常發生非同源染色體聯會，且交叉難以形成。AtZYP1是一種橫向細絲蛋白，它的作用是促進染色單體間形成交叉。在白菜、甘藍和甘藍型油菜中均發現與AtZYP1同源的基因，通過基因編輯去除該基因后，在減數分裂中出現非同源配對頻率增加、同源重組減少和染色體落后等現象。合成蕓薹屬三倍體(ABC)染色體發生非同源配對時，也在聯會的位置檢測到ZYP1熒光信號，但與同源聯會的染色體相比，信號弱且不連續，表明非同源聯會其實是2條染色體部分區段發生聯會。在白菜型油菜和擬南芥中，另一種蛋白PCH2在同源染色體聯會中也發揮了重要功能，突變體中該蛋白缺失導致交叉減少甚至無法形成交叉。

2.3 DNA雙鏈斷裂與交叉形成

聯會復合體形成中，DNA雙鏈在拓撲異構酶SPO11蛋白的作用下發生斷裂(DSBs)，斷裂位點在隨后的修復過程中可能出現原位復合，也可能發生非恢復愈合形成交叉。在SPO11缺失的情況下，雙鏈斷裂不能形成。甘藍型油菜雙鏈斷裂形成的數量受基因組結構的影響，較長的染色體雙鏈斷裂位點就較多，而在減數分裂不需要配對的植物中很少出現雙鏈斷裂位點。DNA雙鏈斷裂修復蛋白RAD51參與DNA的損傷感應和修復，是同源重組過程中的關鍵因子。此蛋白聚集在同源染色體雙鏈斷裂處，可作為雙鏈斷裂的標記。另外，RAD54是調節RAD51活性的重要輔助因子，它穩定RAD51結構，并刺激其發揮作用。RAD54的缺失對減數分裂細胞中的DNA損傷修復具有顯著影響。

雙鏈斷裂后愈合的結果只有非恢復愈合才形成交叉(CO)，在幾乎所有的生物體中，交叉的數量總是比雙鏈斷裂數量少得多，可見斷裂修復并不是隨機發生的。每對同源染色體只有1 個到幾個交叉點，即使在基因組大、染色體長的情況下也是如此，在擬南芥中，30個DSB中只有1個成為交叉。交叉的分布規律也受基因組背景的干擾，利用蕓薹屬二倍體AA和三倍體 AAC雜交產生非整倍體分析，額外的C基因組使A基因組同源交叉沿著染色體軸向較均勻分布，而在二倍體中交叉分布不均勻，著絲粒附近基本不形成交叉。此現象顯示，物種進化過程中可能形成了抑制交叉發生的某種機制，但尚不清楚。DMC1基因是已知的減數分裂特異基因，參與同源染色體DNA雙鏈斷裂修復。蕓薹屬模式植物擬南芥免疫熒光定位結果顯示，DMC1定位于減數分裂DSB的相對兩側。DMC1與ASY1共同作用促進同源染色體雙鏈斷點修復。白菜同源四倍體與二倍體相比，聯會復合體出現異常的同時，DMC1的基因在同源四倍體中顯著下調表達，這導致白菜同源四倍體減數分裂異常。DMC1的表達還受環境條件的影響，如在白菜中，鹽脅迫可刺激其表達，提高植株耐鹽特性。

2.4 同源和非同源重組

交叉的結果DNA片段發生互換而產生重組，是減數分裂時染色體正確配對和分離的必要條件。聯會的雙鏈斷裂與愈合的結果形成交叉，交叉染色體將配對的染色體連接在一起，從而確保它們對齊并使著絲粒與紡綞絲正確連接。未能進行交叉重組的減數分裂會導致染色體錯誤分離而產生異常配子。在人類中，染色體異常重組和分離通常會導致嚴重的遺傳疾病，如唐氏綜合征。

同源重組確保了同源染色體之間二價體的形成和隨后的均等分離，這也導致后代遺傳多樣性，影響物種對選擇的進化反應。同源重組可防止多價體形成，能有效規范染色體行為，但也可能破壞遺傳穩定性，導致減數分裂異常。同源染色體之間的重組頻率受植物遺傳組成影響，例如，蕓薹屬四倍體(AACC)與三倍體(AAC)相比，完全相同的同源AA染色體對之間的重組數量顯著增加。在甘藍型油菜中，重組基本上發生在同源染色體之間，只有少數在非同源染色體之間形成。而甘藍型油菜單倍體也能發生重組，其中同一基因組的染色體之間優先發生重組，然后2個基因組間的染色體之間也發生非同源重組，非同源重組還造成半數單倍體后代出現染色體片段重復和丟失。對甘藍型油菜與埃塞俄比亞芥種間雜種(CCAB)微衛星標記分析顯示，重組引起的A和B基因組缺失的頻率有很大差異，基因組間非同源重組引起19個A-C、3個A-B和10個B-C間發生重復/缺失；而2個C基因組間同源重組產生55個缺失和19個重復。重組引起的基因組序列變異拓展了生物遺傳多樣性的遺傳基礎。

3 結論與展望

多倍化改變了植物基因組結構，伴隨著發生大量的序列變異及表觀遺傳變異。蕓薹屬植物在多倍化進程中基因組發生了大量的選擇性剪接，不僅使基因組序列發生了變化，也導致轉錄本發生改變。在蕓薹屬基因組進化過程中還出現不對稱的基因丟失、不對稱的轉座元件積累和亞基因組表達優勢等情況。與擬南芥同源區段共線性比較結果顯示，甘藍基因組形成過程中發生了大量區段消除和重復等序列變化。多倍化進程中基因組的極不穩定使人工合成雜種往往表現出遺傳不穩定、育性差和種子產量低等缺陷，使其難以直接用于農業生產。配子敗育表面上看屬于細胞遺傳學范疇，但減數分裂中復雜的染色體行為背后必然隱藏著相應分子遺傳機制。研究支配減數分裂過程的相應基因作用及其表達調控規律是調控合成蕓薹屬多倍體配子發育的基本手段。今后蕓薹屬多倍體減數分裂研究將聚焦在減數分裂中各染色體行為背后的遺傳機制和開發調控多倍體配子發育遺傳方法等方面。