miR-213靶向SRC調控胃癌細胞增殖和凋亡

劉亞峰 賀棟偉 石菲

胃癌又稱胃腺癌，是世界上第四大癌癥類型，也是癌癥相關死亡的第二大原因[1]。研究表明，胃癌發生與性別和年齡有關，男性發病率高于女性，>50歲人群中胃癌的發病率明顯升高[2,3]。胃癌在亞洲、拉丁美洲、中歐和東歐的發病率較高[1]。由于在早期階段，胃癌沒有臨床表現，許多患者在疾病的晚期才被診斷，因此胃癌的治療效果欠佳[2]。雖然病理診斷和手術治療是提高胃癌患者生存率的有效手段，但由于胃癌的復發和轉移，胃癌患者的5年生存率仍然很低[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)在許多疾病和病理生理過程中起至關重要的調節作用如腫瘤發生、白血病、心肌重塑、胚胎發育和造血干細胞分化等。越來越多的證據表明，miRNA對胃癌發生發展的有重要調節作用，miRNA代謝的紊亂可能是胃癌的潛在發病機制[4-6]。有研究表明，miR-213在乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌和舌細胞癌中發揮重要的調控作用[7-10]，而miR-213對胃癌的調控作用尚不明確。本研究探討miR-213對胃癌細胞增殖和轉移的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 標本收集 收集2018年1月至2020年1月陜西省榆林市第一醫院普外科住院行胃腺癌切除術患者30例的胃癌組織及癌旁正常組織。標本收集患者均知情同意并簽署知情同意書后。納入標準：術后病理確診為胃腺癌，年齡40～70歲；排除標準：近5年間罹患高血壓、糖尿病、冠心病及其他惡性腫瘤，有過胃腸道手術病史。

1.2 材料與儀器 澳洲胎牛血清(美國Gibco公司，貨號：10100147)、低糖的DMEM細胞培養基(美國Gibco公司，貨號：31330095)、I型膠原(美國Gibco公司，貨號：A1048301)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司，貨號：11668030)；miRNA核苷酸序列(miR-213序列)(生工生物公司)；RNA的抽提試劑盒(日本Takara公司，貨號：639505)、反轉錄試劑盒(日本Takara公司，貨號：639549)、擴增試劑盒(日本Takara公司，貨號：639503)；q-PCR引物由生工生物公司合成；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(碧云天公司，貨號：b4758)；EdU染色試劑盒(南京舟達生物科技公司，貨號：zd2546)；抗p-PI3K抗體(美國Abcam公司，貨號：ab21475)；抗PI3K抗體(美國Abcam公司，貨號：ab21463)；抗p-Akt抗體(美國Abcam公司，貨號：ab36547)；抗Akt抗體(美國Abcam公司，貨號：ab36563)；和抗GAPDH抗體(美國Abcam公司，貨號：ab78453)；DNA內切酶及連接酶(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：BTN130639和BTN130653)。實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司，型號：ABI7500fast)；酶標儀(上海沛歐分析儀器有限公司，型號：SPS5845)；顯微鏡(日本Olympus公司，型號：cx21fs1)；電泳儀及發光儀(中國天能公司，型號：天能EPS600)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及轉染:人正常為黏膜上皮細胞GES-1和胃癌細胞系MNK-45、MGC803、SCG-7901、AGS購買自蘇州思瑞坦細胞庫。根據轉染寡核苷酸序列不同分為轉染miR-213陰性對照序列(5’-CAG GGC UAU GGC UAU GGC UAU GC-3’)的對照組和轉染miR-213模擬序列(5’-AGC AGC CUU GUA CAG GGC UAU GA-3’)的模擬物組[11]。轉染時將普通培養基去除，換為低血清的、不含雙抗的培養基繼續培養6 h；在此期間，將Lipofectamine 2000和由公司合成的miRNA相關核苷酸序列混合均勻，室溫放置30 min，待脂質體將核苷酸序列充分包裹；在培養6 h后將適量上述脂質體混合液加入到上述低血清培養基中(miRNA相關核苷酸序列濃度為80 nmol/L)繼續常規培養6 h，隨后更換上述培養基為常規培養基，繼續培養細胞。

1.3.2 q-PCR檢測RNA表達量:按照說明書利用RNAiso進行細胞裂解，室溫裂解2 min后加入適量的三氯甲烷震蕩，待溶液完全乳化，室溫放置10 min后見萃取分層，高速離心后取無色上清加入等體積的異丙醇，充分混合后冰凍過夜。離心后棄去上清，加入無水乙醇充分洗滌沉淀，棄去上清，加入DEPC水溶解RNA。根據說明書配制反應液，根據說明書內容設置參數，并進行反轉錄：37℃預熱15 min；42℃加熱15 min；85℃加熱5 s，反應結束后得到的cDNA用于后續實驗。根據擴增試劑盒說明書配制反應液，經過預變性和擴增反應等步驟完成擴增步驟，利用相對定量法進行數據分析，具體擴增條件為：95℃預變性30 s；95℃維持5 s，60℃維持34 s，進行40個循環[11]。

1.3.3 EdU染色檢測細胞增殖:將5 mmol/L的EdU染料加入細胞培養基培養48 h后，在拍攝前30 min固定細胞，利用Hoechcst染料對細胞核進行染色，隨后利用激光共聚焦顯微鏡對細胞內的熒光進行拍攝。每組選取5個視野進行計數，計算細胞核EdU染色陽性的細胞百分比[11]。

1.3.4 CCK-8發檢測細胞增殖:根據CCK-8試劑盒說明書配制反應液，將上述反應液按照一定的濃度加入到培養的胃癌細胞系MNK-45中，隨后再將細胞放入常規孵箱培養，利用酶標儀檢測各組細胞的吸光度[11]。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡:利用緩沖液制備的細胞懸液(細胞密度為1×106/ml)，按照Annexin-V/PI凋亡試劑盒說明，制備反應用細胞懸液，然后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡[12]。

1.3.6 Western Blot技術檢測蛋白表達量:利用蛋白酶裂解液制備蛋白樣本；在蛋白樣本中加入緩沖液，利用煮沸方法制備蛋白樣品。按照以下參數將上述上樣蛋白進行電泳：95 V進行30 min完成濃縮膠的電泳，隨后調整為120 V電泳90 min完成分離膠的電泳；繼續調整參數進行轉膜：250 mA恒流轉膜2 h；按照p-Akt(1∶3 000稀釋)、Akt(1∶5 000稀釋)、p-PI3K(1∶3 000稀釋)、PI3K(1∶5 000稀釋)和GAPDH(1∶10 000稀釋)抗體說明書配制一定濃度的一抗，室溫孵育一抗4 h，取出條帶后沖洗干凈，配制帶有辣根過氧化物酶的二抗孵育液，隨后室溫孵育1 h，進行發光[11]。

1.3.7 熒光素酶報告基因系統的構建和檢測:通過靶基因預測軟件的預測，確定潛在靶基因肉瘤基因(sarcoma,SRC)的結合序列，并對其進行人工合成，即可得到非編碼(untraslated regions,UTR)序列，對上述序列進行突變即可得到突變(mutation,MUT)序列。利用DNA內切酶及連接酶將合成的上述基因插入到質粒中，將上述質粒進行擴增并抽提。隨后利用制備得到的質粒和UTR或者MUT序列共轉染入A549細胞(細胞轉染方法同前)。隨后利用酶標儀檢測細胞內熒光素酶活[11,12]。

2 結果

2.1 miR-213在胃腺癌組織和胃癌細胞系中低表達 與癌旁組織比較，胃癌組織中miR-213低表達(P<0.05)。與正常為黏膜上皮細胞GES-1比較，胃癌細胞系MNK-45、MGC803、SCG-7901和AGS中miR-213低表達(P<0.05)。見表1、2。

表1 樣本中miR-213的相對含量檢測

表2 胃黏膜細胞及胃癌細胞系中miR-213的相對含量檢測

2.2 轉染miR-213模擬序列能夠上調細胞內miR-213的水平 轉染miR-213模擬物序列能夠大幅上調MNK-45細胞內miR-213的水平(P<0.05)。見表3。

表3 胃癌細胞系MNK-45內miR-213的含量

2.3 轉染miR-213模擬序列抑制胃癌細胞系MNK-45的增殖 與對照組比較，miR-213模擬物組細胞的EdU染色陽性率下降(P<0.05)；與對照組比較，miR-213模擬物能夠抑制MNK-45細胞的增殖(P>0.05)。見圖1，表4。

圖1 EdU染色法和CCK-8法檢測MNK-45細胞的增殖能力；A熒光顯微鏡觀測EdU染色；B CCK-8檢測細胞增殖曲線

表4 MNK-45細胞EdU染色陽性細胞率

2.4 miR-213模擬物促進胃癌細胞的凋亡 利用流式細胞儀檢測miR-213陰性對照序列和miR-213模擬物轉染后MNK-45細胞的凋亡情況，與對照組比較，miR-213模擬物組細胞凋亡增加，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表5。

圖2 流式細胞儀的方法檢測轉染后MNK-45細胞的凋亡情況

表5 MNK-45細胞的相對凋亡水平

2.5 miR-213模擬物減少p-PI3K和p-Akt蛋白的表達 利用Western Blot技術檢測MNK-45細胞中和p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt指標蛋白的表達，與對照組比較，miR-213模擬物組p-PI3K和p-Akt蛋白的表達減少(P<0.05)。見圖3，表6。

圖3 Western Blot檢測MNK-45細胞中相關蛋白的表達(蛋白灰度圖)

表6 Western Blot檢測MNK-45細胞中相關蛋白的表達

2.6 SRC是miR-213的靶基因 為了進一步研究miR-213抑癌的機制，我們利用Targetscan和MiRanda等靶基因預測軟件預測了miR-213的潛在靶基因，發現SRC基因的3’UTR上存在miR-213的潛在結合位點。繼而，我們利用熒光素酶報告基因技術發現miR-213能夠顯著抑制SRC 3’UTR質粒的熒光素酶活性，提示SRC是miR-213的直接作用靶基因。見表7。

表7 熒光素酶相對活性

3 討論

由于胃癌在疾病的早期沒有明顯臨床表現，大多數患者在疾病的后期才被發現，此時的康復機會較低[1-3]。故深入研究胃癌發病機制及尋求治療新靶點成為近年來的研究熱點。而miRNA研究較為深入，已有多種miRNA藥物已經進入臨床試驗[13]。

我們在文獻回顧中發現miR-213在乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌和舌細胞癌中發揮重要的調控作用[7-10]，為探討miR-213在胃腺癌中的作用，我們又在正常胃黏膜細胞和多種胃癌細胞系中驗證了這個結論，同樣發現，胃癌細胞系中miR-213低表達。上述結果暗示miR-213可能發揮抑癌作用。隨后我們在胃癌細胞系MNK-45中上調miR-213的表達并發現上調miR-213表達抑制胃癌細胞系的增殖和遷徙，這與之前學者報道[9,10]一致。學者證明，miR-213在頭頸部鱗狀細胞癌中低表達，過表達miR-213能夠抑制鱗狀細胞癌的增殖和遷徙[9]。也有學者報道，miR-213能夠抑制舌細胞癌的增殖和侵襲作用[10]。但也有學者報道，miR-213在乳腺癌中高表達，能夠促進乳腺癌的增殖和侵襲[7,8]。miR-213在調控腫瘤細胞增殖方面的差異可能是由于腫瘤細胞來源不同，這同時也反映出miR-213在細胞增殖調控中的復雜性。凋亡失衡被認為是腫瘤發病機制中的關鍵途徑，我們發現上調miR-213表達促進胃癌細胞系的凋亡，另有學者證實，miR-213能夠在細胞修復和應激過程中促進細胞的凋亡[14]，本研究與之一致。

PI3K/Akt信號通路是腫瘤發病機制中的關鍵途徑，在多種腫瘤的發生發展過程中被激活，能夠調控腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等過程，被認為是腫瘤治療的重要靶點[15,16]。有研究發現，在胃癌干細胞中PI3K/Akt信號通路中的多種關鍵蛋白高表達，且與胃癌的惡性程度相關[17]。還有學者發現，miR-107可通過靶向調控PI3K/Akt信號通路抑制胃癌細胞的增殖[18]。在本實驗中，我們發現上調miR-213抑制了胃癌細胞系PI3K/Akt信號通路的活化。這也從一個方面解釋了miR-213抑制胃癌細胞增殖及促進其凋亡的原因。

研究表明，在人類的多種腫瘤中SRC基因被過度激活，進而促進腫瘤的生長[19]。已經研究證實，抑制SRC基因的活化可以發揮有效的抑癌作用[20,21]。為探究miR-213抑制胃癌細胞增殖和促進凋亡的機制，我們首先利用生物信息學分析技術預測了miR-213可能的靶基因，我們發現miR-213與SRC基因有著較高的匹配度。為了進一步驗證miR-213與SRC基因的結合，通過熒光素酶報告基因技術發現了miR-213可以直接靶向作用于癌基因SRC，這可能是miR-213發揮抑癌作用的重要方式。

綜上所述，胃癌組織及胃癌細胞系內低表達miR-213，miR-213可通過靶向SRC抑制胃癌細胞的增殖和促進其凋亡。