miR-205在卵巢子宮內膜異位癥患者內膜組織中的表達及對VEGFA的影響

王雪娟 宋玉霞 崔培林 李建彪 石晶 魏會娟

子宮內膜異位癥是育齡期女性最常見疾病之一，發病率占育齡期女性的10%左右[1]。臨床癥狀主要有：腹痛(進行性痛經、性交痛、慢性盆腔痛)和不孕，大約50%的子宮內膜異位癥患者伴有盆腔痛，40%～50%的患者合并不孕癥，嚴重影響了患者身心健康和生活質量[2]。因此，對影響子宮內膜細胞在異位處存活、侵襲、生長等因素進行分子機制研究，可完善內異癥的發生機制，而且有助于確定內異癥治療的潛在分子靶點。越來越多的證據表明微小RNAs(miRNAs)在人類腫瘤發生、發展及治療轉歸過程中起重要作用[3-5]。miR-205是一種重要的miRNA分子。生物信息學軟件分析表明miR-205可靶向調控血管內皮生長因子A(VEGFA )的表達，且在腫瘤的研究中也證實miR-205可直接靶向作用VEGFA[6-8]。子宮內膜異位癥雖然是一種良性疾病，但具有種植、侵襲、復發等惡性生物學行為，血管生成是異位病灶處存活和發展的關鍵因素之一。因此，本研究擬檢測miR-205和VEGFA在卵巢子宮內膜異位癥患者在位、異位內膜中的表達情況，探討二者的作用，并分析二者表達水平的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年12月至2021年6月于石家莊市人民醫院婦科住院行腹腔鏡手術治療的50例卵巢子宮內膜異位癥患者(病例組)在位內膜和異位內膜組織。所有患者經術后病理證實為卵巢子宮內膜異位癥，根據美國生育學會修正的分期標準(r-AFS)分期為Ⅲ、Ⅳ期卵巢子宮內膜異位癥。收集同期因卵巢冠囊腫行腹腔鏡手術或行腹腔鏡下輸卵管結扎術患者的正常內膜組織55例為對照組，術中排除患有子宮內膜異位癥。病例組年齡21～40歲，平均年齡(36.5±6.7)歲；對照組年齡23～42歲，平均年齡(37.6±5.6)歲。2組患者年齡分布匹配，差異無統計學意義(P>0.05)。2組患者均月經規律，內膜收集均在月經周期的分泌期(末次月經時期及病理特征來確定)，且2組患者術前6個月內均未應用激素類藥物。標本收集及臨床資料經患者及家屬知情同意。組織標本均在離體后30 min內收集，放入裝有RNAlater 液的EP管里浸泡，4℃冰箱過夜后轉入-20℃保存。此項研究獲石家莊市人民醫院醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑 購于天根生化科技有限公司；RNA逆轉錄試劑盒購于TaKaRa生物技術有限公司；Quantinova TMSYBR green pcr Kit試劑盒購于上海凱杰生物技術有限公司；miRNA提取試劑盒和miRNA逆轉錄試劑盒 購于美國Invitrogen公司；miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒購于美國Invitrogen公司；PCR擴增引物序列上海生工生物工程有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 內膜組織總RNA提取及合成cDNA： 應用TRIzol抽提對照內膜、在位內膜、異位內膜組織總RNA，應用Nanodrop2000檢測其濃度和純度后，RNA逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA。miRNA提取試劑盒抽提上述在位、異位及對照內膜組織的miRNA，Nanodrop2000檢測其濃度和純度，miRNA逆轉錄試劑盒將提取的miRNA逆轉錄成cDNA，保存于-20℃冰箱。

1.3.2 VEGFA和miR-205表達水平檢測： 目的基因VEGFA的表達水平應用PCR擴增來檢測，使用QuantiNova TMSYBR green pcr Kit試劑盒按說明書操作進行。反應體系為：Mix液10.0 μl、Rox 0.1 μl、cDNA模板1.0 μl、上下游引物各1.4 μl、最后加去離子水至20 μl。反應引物序列：目的基因VEGFA的上游引物為5’-ACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCAT-3’，下游引物為5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGT-3’；GAPDH為內參基因，其上、下游引物序列為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。目的基因miR-205的表達水平檢測應用miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒按說明書操作進行PCR擴增，反應體系為：Mix液5.0 μl、上下游引物各1.0 μl、cDNA 模板1.0 μl、最后加去離子水至10 μl。反應引物序列：目的基因miR-205的上游引物為：5’-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCC-3’，下游引物為：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAG

TCGGCAATTCAGTTGAGCAGACT-3’；內參U6基因的上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游引物為5’-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3’。每個組織樣本設置3個副孔，VEGFA和miR-205在不同內膜組織中的相對表達量應用2-△△CT法計算獲得。

2 結果

2.1 VEGFA基因mRNA在異位、在位和對照內膜中表達情況 與在位和對照內膜相比，VEGFA基因mRNA在異位內膜中的表達量顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.001)；且在位內膜組織中VEGFA基因mRNA的相對表達量顯著高于對照內膜組織(P<0.007)。見表1。

表1 VEGFA基因mRNA在不同內膜組織中表達情況

2.2 miR-205在不同內膜中的表達 異位內膜組織中miR-205的表達量顯著低于在位和對照內膜，差異均有統計學意義(P<0.01)；且在位內膜組織中miR-205的相對表達量顯著低于對照內膜，差異有統計學意義(P<0.009)。見表2。

表2 miR-205在不同內膜組織中表達情況

2.3 異位內膜組織中VEGFA和miR-205表達水平相關性 Pearson分析結果顯示：miR-205與VEGFA基因mRNA在異位內膜組織中的表達量呈顯著負相關，差異有統計學意義(r=-0.637，P<0.05)。見表3。

表3 異位內膜組織中miR-205和VEGFA基因mRNA表達的相關性

2.4 異位內膜組織中miR-205表達對卵巢子宮內膜異位癥的診斷意義 結果提示miR-205診斷卵巢子宮內膜異位癥的ROC曲線下面積(AUC值)為0.918，95%可信區間為0.858～0.978，與AUC=0.5比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明異位內膜組織中miR-205表達對卵巢子宮內膜異位癥的診斷具有較高的準確性。最優截斷點為0.7665，在最優截斷點靈敏度和特異度分別為83.6%和98.0%。見圖1。

圖1 異位內膜組織中miR-205表達水平判斷卵巢子宮內膜

3 討論

miRNAs是一類廣泛分布于組織細胞的內源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約19～25個核苷酸，具有高度保守性、時序性和組織特異性，通過與靶基因mRNA的 3'UTR結合引起mRNA降解或者抑制其翻譯來調控基因表達。國內外學者們對大腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌等惡性腫瘤的研究表明腫瘤組織中miRNAs呈不同的表達，異常表達的miRNAs參與腫瘤的發生、轉移、侵襲及預后等過程[9-12]。子宮內膜異位癥具有惡性腫瘤相似的生物學特性，其發生和發展是多個基因參與的、錯綜復雜調控網作用的結果，miRNAs與子宮內膜異位癥發病機制的研究日漸關注。研究證實miRNA在子宮內膜異位癥患者在位內膜和異位病灶中的表達存在顯著差異，這些異常的miRNA通過調控靶基因及其下游的信號通路參與子宮內膜異位癥的形成[13-15]。

miR-205是miRNAs家族重要成員之一，研究表明其在多種腫瘤的發生、發展過程中起作用。先前的文獻報道了miR-205在子宮內膜癌、卵巢癌中表達上調，而在甲狀腺乳頭狀癌、大腸癌中表達下調，表明miR-205根據腫瘤組織和類型的不同發揮不同的作用，既可作為癌基因促進腫瘤發生，又可作為抑癌基因而起到抑制腫瘤生成的角色[16-19]。本研究檢測了miR-205在異位內膜、在位內膜及對照內膜中的表達情況，發現卵巢子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中miR-205的表達水平顯著低于在位內膜及對照內膜，且在位內膜組織中miR-205的表達水平顯著低于對照內膜。

生物信息學軟件分析顯示miR-205可靶向調控VEGFA的表達，且在腫瘤的研究中也證實miR-205可靶向作用VEGFA的表達。Zhao等[6]研究發現表達上調的miR-205通過降低VEGFA水平來抑制肝癌細胞的增殖和轉移。Cao等[7]研究表明表達下調的miR-205通過靶向上調VEGFA表達來促進膀胱癌的發生和發展。此外，Wang等[8]報道了卵巢癌中miR-205也通過作用VEGFA來調控腫瘤細胞增殖及凋亡。以上研究結果均表明miR-205通過調控VEGFA起作用，但miRNA具有組織特異性，子宮內膜組織中miR-205是否調控VEGFA表達目前尚未見報道。本研究通過Pearson相關性分析發現異位病灶中miR-205的表達水平與VEGFA基因mRNA的表達量呈顯著負相關性，這些結果表明表達下調的miR-205可能通過靶向調控VEGFA表達來促進卵巢子宮內膜異位癥發生發展。

VEGFA是一種血管內皮細胞有絲分裂原，具有維持血管內皮細胞通透性和促進血管生成的功能，是調控血管生成的關鍵蛋白因子。先前的研究報道了子宮內膜異位癥患者血清及異位病灶中VEGFA的表達水平顯著高于對照患者，且隨著病情的加重而升高[20-23]。與先前的結果一致，本研究應用RT-qPCR檢測了卵巢子宮內膜異位癥患者在位和異位內膜組織中VEGFA基因mRNA的表達，結果顯示異位內膜組織中VEGFA的表達量顯著高于在位和對照內膜組織，且在位內膜組織中VEGFA的表達量顯著高于對照內膜。血管生成是異位病灶處存活和發展的關鍵因素之一，經血逆流入腹腔的內膜組織，在異位處黏附形成新生血管，從而在異位處存活并發展成異位病灶。因此，我們的研究結果表明表達下調的miR-205可能通過靶向上調VEGFA，導致新生血管生成增多，從而促進卵巢子宮內膜異位癥發生和發展。當然，我們的結果需要更進一步的驗證，并需要在內膜細胞上應用熒光素酶報告基因載體實驗進一步驗證miR-205與VEGFA的靶向關系。

綜上所述，表達下調的miR-205可能通過靶向調控VEGFA的表達來促進卵巢子宮內膜異位癥的發生和發展。進一步探索miR-205在卵巢子宮內膜異位癥發生中的作用機制，可為卵巢子宮內膜異位癥的早期診斷及治療提供新思路。