低溫對不同抗性金黃色葡萄球菌細胞膜完整性及相關基因表達的影響

關鵬，凍梓杰，賀舒佳，劉悅陽，雷萌萌,2,3，黃忠民,2,3，艾志錄,2,3,4，索標,2,3,4*

1(河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州，450002)2(農業農村部 大宗糧食加工重點實驗室， 河南 鄭州，450002)3(國家速凍米面制品加工技術研發專業中心，河南 鄭州，450002) 4(速凍面米及調制食品河南省工程實驗室，河南 鄭州，450002)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是危害公共衛生的主要食源性致病菌之一[1]。中國疾病預防控制中心2019年共報告了91起因金黃色葡萄球菌及其毒素引起的暴發性食源性疾病事件，導致了1 023人患病住院治療[2-3]。金黃色葡萄球菌的爆發主要與被污染的食品有關，其廣泛存在于未經深度處理的食品原材料、即食食品和操作不規范加工場所中[4]。

低溫冷藏是短時間內儲存食品原料和產品、延長食品貨架期及長距離運輸食品的最常用方法之一[5]。雖然低溫會影響基因的轉錄和翻譯，從而抑制細胞復制[6]。但是金黃色葡萄球菌對4 ℃的低溫環境有較強的適應性，在4 ℃貯藏60 d的奶制品進行微生物檢測仍能發現有金黃色葡萄球菌存在。金黃色葡萄球菌長期受到低溫脅迫后可能會以小菌落變種(small colony ariants, SCs)形態存活8周或者更長的時間。SCs細胞是食品安全的重要挑戰，這是因為與正常細胞相比，SCs細胞通常具有較強的耐藥性，而且能夠抵抗宿主細胞的清除并存活數十年[7]。

細菌的細胞膜是保衛細胞正常功能的第一道生物防線，在維持細胞形態、傳遞信息和與外界進行物質交換起到重要作用[8]。研究發現抗生素、抗菌肽和天然抑菌劑等物質能通過作用細胞膜的靶向位點、破壞細胞膜的完整性改變其通透性，從而起到抑菌的作用[9]。然而，致病菌對低溫等環境脅迫的抗性差異性較大，細菌細胞膜的完整性對環境脅迫的抵抗能力是致病菌脅迫抗性的重要體現[10]。然而，金黃色葡萄球菌在低溫脅迫下細胞膜的完整性以及其抗性差異急需深入研究。

本實驗對4株具有不同低溫耐受性金黃色葡萄球菌為供試菌株，基于平板計數法區分低溫抗性強弱不同的菌株，并觀測菌落形態、計算存活率。通過測定細胞內容物泄露量、測定電導率方法、結晶紫方法對細胞膜完整性進行研究；進而通過實時熒光定量PCR(quantitatie real-time PCR, qRT-PCR)分析4株金黃色葡萄球菌的基因表達在低溫處理后參與機體調控的變化，以期在基因調控上詮釋不同金黃色葡萄球菌在低溫下的存活機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

金黃色葡萄球菌(BB-1、BK-1、BH-25和FA-3)，實驗室前期分離自當地冷鏈食品，并通過Biolog技術[11]和nuc基因[12]作為引物的PCR法鑒定，菌株均保存于-80 ℃甘油管中。

1.1.2 培養基與試劑

TSA培養基、TSB培養基，北京陸橋技術有限責任公司；酵母浸粉(yeast extract, YE)，上海生工生物工程股份有限公司；PBS、10 μg/mL結晶紫，北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇，天津市德恩化學試劑有限公司；TRIzon Reagent試劑，江蘇康為世紀生物科技有限公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒，翌圣生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy公司；Centrifuge 5430高速臺式離心機，德國Eppendorf公司；LHP-250智能恒溫恒濕培養箱，上海鴻都電子科技有限公司；CD-6 ASX游標卡尺，日本株式會社三豐；NanoDrop 2000核酸蛋白微量測定儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；DDS-307A電導率儀，上海儀電有限公司；EPOCH2微孔板分光光度計，美國Biotek公司；StepOne Plus實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備

將供試菌株37 ℃振蕩培養至指數期后期，取25 mL的細胞培養液經4 ℃、8 000 r/min離心5 min收集后，用PBS清洗2次，懸浮于等體積的PBS中制成菌懸液。

1.2.2 金黃色葡萄球菌菌落形態和活性細胞數目測定

將上述菌懸液保存于4 ℃冰箱中，每7 d在TSA-YE平板上用涂布平板法測定菌落總數，連續測定4周，存活率[13]按照公式(1)計算：

(1)

觀察菌落TSA-YE平板上的金黃色葡萄球菌菌落形態，直徑小于1 mm的菌落定義為SCs細胞[7]，并比較形成SCs細胞的菌株與未形成的菌株在低溫下存活能力的差異。

1.2.3 菌懸液內容物泄漏量的測定

取1 mL低溫處理的菌液到1.5 mL無酶離心管，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，取上清液3 μL，用核酸蛋白微量測定儀測定胞內核酸和蛋白質泄露量[14]。所有操作都在冰上完成，以減少核酸和蛋白質的降解。

1.2.4 菌懸液電導率的測定

取5 mL低溫處理的菌液到15 mL無酶離心管，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，吸上清液并使用電導率儀進行電導率的測定，所有操作皆在冰上完成。

1.2.5 細胞膜完整性的測定

取5 mL低溫處理的菌液，4 ℃、8 000 r/min離心5 min，并用預冷的PBS清洗，重復3次。得到的菌泥重懸于含有10 μg/mL結晶紫的PBS中37 ℃培養10 min。之后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液使用微孔板分光光度計測量590 nm處吸光度。

1.2.6 RNA提取和反轉錄

使用TRIzol法分別提取低溫處理7 d和新鮮的金黃色葡萄球菌RNA，操作按照TRIzon Reagent說明書。提取的RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白微量測定儀檢測純度、濃度和完整度，隨后使用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，操作按照說明書進行。反轉錄后的cDNA和引物經過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，進行實時熒光定量PCR實驗。

1.2.7 反轉錄實時熒光定量PCR檢測目的基因表達

qRT-PCR檢測方法如下，20 μL反應體系包括：10 μL qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)、上下游引物各0.4 μL、1 μL模板DNA、剩余體積使用無菌超純水補齊。部分引物參考文獻[15]設計，其余引物通過Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.go/)設計，并由鄭州尚亞生物公司合成，如表1所示，引物所擴增產物的正確性通過對基因組DNA的PCR擴增后測序以驗證。qRT-PCR使用StepOnePlus實時熒光定量PCR儀進行，擴增程序[15]為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，擴增40個循環。以16 s rDNA為內參基因，數據使用2-ΔΔCt法定量分析[16]。

表1 實時熒光定量引物Table 1 Primer pairs used for qRT-PCR

1.2.8 數據處理與統計分析

所有實驗均進行3個平行，應用Excel 2019軟件計算平均值和誤差，并采用One-Way ANOA比較在P<0.05水平的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 低溫處理后金黃色葡萄球菌菌落形態和活細胞數目的變化

經過低溫處理后，4株金黃色葡萄球菌平板菌落的形態如圖1所示，BB-1表現出與其未處理正常細胞所見非典型生長特征，呈明顯的小菌落形態(即SCs細胞)(圖1-b)，通過游標卡尺測量直徑為(0.32±0.04) mm；而其他3株金黃色葡萄球菌形態上與處理前變化不大(圖1-d、圖1-f、圖1-h)，測量出直徑為(1.12±0.02) mm，和SCs細胞直徑具有顯著性差異(P<0.05)。

a, c, e和g-BB-1、BK-1、BH-25和FA-3在平板上的菌落形態；b, d, f和h-經過低溫處理后的菌株BB-1、BK-1、BH-25和FA-3 在平板上的菌落形態；i-低溫對不同金黃色葡萄球菌的活細胞數目的影響；j-低溫對不同金黃色葡萄球菌存活率的影響圖1 低溫處理后金黃色葡萄球菌菌落形態和活細胞數目以及存活率的變化Fig.1 Changes in colonial morphology and iable cell number of S.aureus after low temperature treatment 注：不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著

在低溫脅迫下，4株金黃色葡萄球菌的活細胞數下降2.38～5.03 lg CFU/mL (圖1-i)，但下降程度各不相同。其中，金黃色葡萄球菌BB-1在4周的低溫脅迫后數目下降2.38 lg CFU/mL，存活率為75.5%。然而，BH-25在4周低溫脅迫后活細胞數目下降5.03 lg CFU/mL，與BB-1相比高2.65 lg CFU/mL(P<0.05)，存活率僅為45.34%，與BB-1相差30.16%(P<0.05)。因此，能形成SCs細胞金黃色葡萄球菌BB-1的低溫抗性較其他3株金黃色葡萄球菌強，而BH-25的低溫抗性最弱。

2.2 低溫脅迫下金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的變化

如圖2-a、圖2-b所示，在低溫脅迫處理過程中，4株金黃色葡萄球菌的胞內物質泄露量均不斷增大，其中BB-1蛋白質泄露量最低，為0.687 mg/mL，核酸泄露量為96.1 ng/μL；但是，BH-25蛋白質泄露量為1.284 mg/mL，比BB-1多0.597 mg/mL(P<0.05)，核酸泄露量為130.9 ng/μL比BB-1多34.8 ng/μL(P<0.05)；其余2株菌的泄露量介于BB-1和BH-25菌株之間，BK-1蛋白質泄露量為0.938 mg/mL，核酸泄露量為117.5 ng/μL；FA-3蛋白質泄露量為1.216 mg/mL，核酸泄露量為129.1 ng/μL。由此可見，在4周低溫處理后的BB-1胞內蛋白質和核酸泄露量均少于其他3株金黃色葡萄球菌，而BH-25的泄露量最多。

菌懸液的電導率測定結果如圖2-c所示。4周后BB-1電導率上升最小為1.6 μS/cm，BH-25電導率上升最大為2.3 μS/cm比BB-1多上升0.7 μS/cm(P<0.05)；BK-1菌懸液電導率上升1.9 μS/cm、FA-3上升2.1 μS/cm。結果表明，BB-1的電解質泄露量較少，菌懸液電導率較低；而BH-25電解質泄露量較大，菌懸液電導率較高。

各菌株細胞膜通透性如圖2-d所示。經過4周低溫處理后，4株金黃色葡萄球菌的細胞膜通透性都有所上升。4周低溫處理后BB-1的OD590值在4株菌株中下降最少為1.81；BH-25的OD590值在4株菌株中下降最多為2.32；BK-1的OD590值下降2.08；FA-3的OD590值下降2.23。

因此，通過測量胞內泄露量、菌懸液電導率和結晶紫染色法測定金黃色葡萄球菌細胞膜完整性，結果表明在低溫脅迫處理后，金黃色葡萄球菌BB-1的細胞膜通透性最低，完整性最好；BH-25的細胞膜通透性最高且完整性最差，BB-1和BH-25菌株在細胞膜完整性上具有顯著性差異(P<0.05)。

a-胞內蛋白質泄露量；b-胞內核酸泄露量；c-菌懸液電導率；d-細胞膜通透性圖2 低溫對不同金黃色葡萄球菌細胞膜完整性的影響Fig.2 Effect of low temperature on the cell membrane integrity of different S.aureus strains

2.3 基因實時熒光定量PCR分析

金黃色葡萄球菌的抗逆基因(rsb、rsbW和sigB)和細胞膜脂肪酸相關基因(fabD、fabF、fabG、fabH和fabI)表達量結果如圖3所示。

圖3 低溫對不同金黃色葡萄球菌相關基因表達量的影響Fig.3 Effect of low temperature on the transcription of related genes of different S.aureus strains 注：虛線為內參基因表達量

在7 d低溫處理后，BB-1和BK-1上述基因表達水平上調，而FA-3和BH-25基因表達水平下調。其中，BB-1的rsb、rsbW和sigB基因表達水平分別上調5.89、13.49和8.02倍，可能和機體積極抵抗環境的作用有關；然而BH-25的rsb、rsbW和sigB基因表達水平卻分別下調0.015、0.046和0.018倍，顯著低于BB-1的基因表達(P<0.05)。在fab家族基因表達水平中，BB-1的fabD、fabF、fabG、fabH和fabI基因表達水平分別上調12.18、21.64、12.87、10.10和21.71倍，這可能和細胞膜脂肪酸的生物合成水平增加有關；但是BH-25的fabD、fabF、fabG、fabH和fabI基因表達水平卻分別下調0.26、0.14、0.26、0.095和0.19倍，顯著低于BB-1的基因表達水平(P<0.05)。因此，在8個基因表達上，4株金黃色葡萄球菌有不同結果，低溫抗性能力強的BB-1抗逆基因和細胞膜脂肪酸相關基因表達皆上調，而低溫抗性能力最弱的BH-25基因表達水平皆顯著下調。

3 討論

金黃色葡萄球菌的低溫抗性較強[17]，本研究對不同金黃色葡萄球菌在長期低溫脅迫下活細胞數目、細胞膜完整性和相關基因轉錄表達水平等進行探究。結果表明，能形成SCs細胞的BB-1比未能形成SCs細胞的其他3株菌在低溫下存活能力更強，存活率更高。而在環境脅迫下可形成SCs狀態的致病菌被認為是其抗逆存活的重要調控方式之一，并且SCs細胞通常具有極強的耐受性和抵抗能力，這和前人結果一致[7]。

細胞膜可以控制物質的進出和細胞內物質的運輸，同時協助其抵抗外界不利環境和宿主免疫系統的侵害[18]。本研究通過測定細胞內容物泄露量、電導率和結晶紫法驗證金黃色葡萄球菌在低溫脅迫下細胞膜的完整性。形成SCs細胞的BB-1在低溫脅迫下金黃色葡萄球菌細胞膜的完整性要優于未形成SCs的菌株，細胞內容物泄露最少，且存活率最高。這和經過低溫誘導而形成SCs細胞壁變厚，細胞膜更完整，細胞生存能力更強的研究結果近似[19]。

有研究稱，rsb-rsbW/sigB系統是機體的抗性調節系統，SigB因子在抗惡劣環境中起到至關重要的作用，SigB因子介導嘧啶生物的合成，從而調控綠膿桿菌SCs形成[20]。而SigB因子調節功能的發揮受RsbW和Rsb的調控，其中RsbW能夠與SigB結合，從而阻滯SigB功能的發揮。Rsb又稱為SigB拮抗劑抑制因子，即只有當Rsb與RsbW結合后，SigB因子才能夠釋放并發揮其脅迫耐受調節功能。SigB因子可以在惡劣環境下激活，例如暴露于熱、鹽和抗菌物質，這些條件刺激sigma因子的sigB基因轉錄表達，進而編碼應激蛋白和其他機體防御進程[21]。而Rsb、RsbW和SigB因子受到rsb、rsbW和sigB基因編碼，所以通過rsb、rsbW和sigB表達情況分析可以了解抗性調節系統的作用情況。結果發現對低溫抗性強且能突變成SCs細胞的BB-1菌株sigB基因表達量上調最多，而低溫抗性最差的BH-25菌株sigB基因表達水平下調最多。而SCs細胞的形成可能與sigB基因的上調表達有關，這和ALRESHIDI等[19]的研究結果相符。這也表明BB-1菌株能更好地通過rsb-rsbW/sigB系統在低溫脅迫下調節機體功能，使得菌體對低溫的抗性更強。而BH-25菌株體內rsb-rsbW/sigB系統卻無法發揮作用，這也可能是導致其低溫抗性最差的原因之一。

另外，長期低溫環境會引起細菌細胞膜發生改變，細胞膜的變化主要和細胞膜上的脂肪酸響應環境壓力的修飾改變有關，并在很大程度上歸功于生物合成基因的調節。fab家族基因主要參與調控細胞膜脂肪酸的合成，fabD基因編碼丙二酸單酰-輔酶A-ACP轉移酶參與脂肪酸合成第一步，其催化丙二酸單?；鶑囊阴oA到?；d體ACP的硫酯轉移[22]。fabF和fabH基因參與編碼β-酮脂?；?ACP合酶和β-酮脂?；?ACP合酶III，它們分別在碳碳鍵合成和支鏈脂肪酸縮合中起作用[23]，該過程是脂肪酸合成縮合步驟的起始。fabG負責編碼酮脂?；€原酶，可以還原4-氯乙酰乙酸乙酯[24]。fabI編碼烯脂?；?ACP還原酶在脂肪酸生物合成步驟和完成延伸步驟中作用[25]，細胞膜脂肪酸合成詳細步驟如圖4所示。

圖4 細胞膜脂肪酸合成步驟Fig.4 Cell membrane fatty acid synthesis steps 注：圖中FabD、FabF、FabG、FabH和FabI皆為參與合成的酶， 分別由fabD、fabF、fabG、fabH和fabI基因編碼

當細胞遭到脅迫后，細胞膜脂肪酸生物合成的基因會上調表達響應不利環境，這與WANG等[8]結果相似。因此解釋了BB-1菌株在低溫下通過細胞膜脂肪酸生物合成基因表達水平的上調導致機體合成脂肪酸能力加強，細胞膜完整性較好；而BH-25菌株細胞膜脂肪酸生物合成基因表達水平的下調可能導致機體無法維持正常生存的細胞膜脂肪酸能力，使得細胞膜完整性變差。

4 結論

總之，低溫能夠抑制金黃色葡萄球菌的生存，但由于存在種間抗性差異和小菌落變種情況，4株金黃色葡萄球菌對低溫有不同的耐受性，能夠形成SCs細胞的菌株低溫抗性最強存活率更高。并且低溫改變了細胞膜的通透性，使得細胞質物質流出胞外，但是SCs細胞的細胞膜完整性較好，細胞內容物流出最少，這可能由于形成SCs后細胞膜比普通菌株細胞膜更完整，具有存活優勢。而能形成SCs細胞可能與rsb-rsbW/sigB系統發揮作用有關，能夠使細胞在惡劣環境下做出有利的響應，并且該系統還可能調控細胞膜脂肪酸合成基因(fabD、fabF、fabG、fabH和fabI)的表達量增強，使得SCs細胞的細胞膜完整性更好，細胞內環境更加穩定，并且有助于細胞在低溫下存活。但SCs細胞的低溫脅迫抗性調節分子機制及關鍵基因的作用，仍有待于今后進一步的研究探討。提醒我們即使長期冷藏的食品也會有金黃色葡萄球菌存活，更要避免低溫耐受性強的菌株污染食品造成更大的危害，要求我們能找到對冷藏食品更有效的殺菌方式。