基于RAD高通量測序的藍花楹群體遺傳分析

劉學鋒, 李小梅, 張國武*, 張沛健 , 劉果, 黃敏，陳銀霞

基于RAD高通量測序的藍花楹群體遺傳分析

劉學鋒1, 李小梅2, 張國武1*, 張沛健1, 劉果1, 黃敏1，陳銀霞3

(1. 中國林業科學研究院速生樹木研究所，廣東 湛江 524022；2. 湛江科技學院，廣東 湛江 524000；3. 江西省林業科技推廣和宣傳教育中心，南昌 330033)

為了解藍花楹()種質資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構，對168份種質材料進行RAD-seq測序，構建了系統進化樹并進行主成分、群體結構和遺傳多樣性分析。結果表明，比對參考基因組平均比對率為81.02%，平均測序深度23.18×，最終獲得45 552個高質量的SNPs。群體遺傳結構分析表明，供試藍花楹可劃分為2個大的類群，來自川、渝地區的種質材料基本歸為一類；其余地區歸為另一類。19個地區的藍花楹在SNP水平上的遺傳多樣性較高，云南昆明(YNKM)居群的核苷酸多樣性(π)和期望雜合度()最大，表現出最高的遺傳多樣性。因此，來自川、渝地區的藍花楹具有相對較近的親緣關系，推斷來自同一祖先，而其余地區的種質可能是隨機引種栽培。

藍花楹；RAD-seq；遺傳多樣性；群體遺傳

藍花楹()是紫葳科(Bigno- niaceae)藍花楹屬植物，落葉喬木，原產南美洲，廣泛分布于澳大利亞、南非、秘魯、墨西哥、巴西、阿根廷等國，我國引種栽培于廣東、廣西、四川、福建和云南等地[1]。藍花楹樹形優美，藍紫色花, 可作行道樹，具有觀花、觀葉、觀形等觀賞價值，是一種值得推廣應用的園林樹種[2–3]。

對藍花楹的研究主要集中在潛在栽培區預測、與木霉真菌的相互作用[4]、藥用成分分析[5]和土壤重金屬及化合物吸附[6–7]等方面。迄今為止，藍花楹在分子水平上的研究僅限于染色體[8–9]、質體序列[10]、ISSR分子標記[11–12]等。因藍花楹早期引種栽培的品種來源未知，種源關系混亂，嚴重影響了藍花楹的種質資源保護、良種選育及創新利用，因此亟待新的方法來揭示國內藍花楹的遺傳多樣性和群體遺傳結構。近年來，隨著基因組測序技術的飛速發展，為種質資源鑒定及遺傳多樣性研究提供了新的方法。限制性酶切位點關聯DNA測序技術(restriction-site-associated DNA sequencing, RAD-seq)是在二代測序基礎上發展起來的一種基于全基因組酶切位點的簡化基因組測序技術。隨著高通量測序技術和生物信息技術的發展，RAD-seq分析也日趨完善，并在很多生物上得以應用[13–15]。RAD-seq不僅可以得到可靠的高密度遺傳標記，而且適用于沒有參考基因組的物種研究[16]。Premarathne等[17]利用RAD-seq技術對來自不同地區的93份日本胡椒()種質資源進行了分析。Feng 等[18]利用RAD-seq技術對甘薯()的全基因組遺傳多樣性進行檢測并分析群體結構，開發了相應的SSR標記。Fukuda等[19]利用RAD-seq 技術生成的SNP標記構建了枇杷()高密度遺傳連鎖圖譜，可用于農藝性狀的QTLs研究。黃承玲等[20]基于RAD-seq測序技術對貴州百里杜鵑保護區杜鵑花屬()植物進行了分類，證實RAD-seq技術在復雜植物類群的物種分類方面比傳統分子標記具有明顯優勢。

群體遺傳學是研究植物群體遺傳結構及其變化規律的遺傳學重要學科。因此，本研究以在國內收集的168份藍花楹種質為材料，利用RAD-seq技術進行藍花楹的群體遺傳分析，從基因組水平上揭示不同種質間的遺傳分化關系，為藍花楹種質資源的保存利用、育種策略的實施、分子標記輔助育種和關聯圖譜的構建提供理論依據和實踐參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

分別從四川、重慶、福建、江西、云南、廣東、廣西7省(區、直轄市)的19個地區早期引種的藍花楹()樹上采集種子(表1), 每個自然居群選擇9～16棵植株，相鄰植株間隔約50 m,個體在10株以下的居群全部采樣。福建莆田(1)和云南文山(1)居群為大樹，福建莆田(2)和云南文山(2)居群為小苗，且相隔50 km以上。種子在位于廣東湛江的南方國家級林木種苗示范基地分產地播種培育成1 a生小苗，于2018年6月從每個產地小苗中隨機選取8株，剪取其新鮮健康的幼葉適量, 分別裝入5 mL離心管中，再放入液氮速凍后帶回, 編號并保存在–80 ℃冰箱備用。

表1 藍花楹試驗材料及其來源

1.2 基因組DNA提取

采用CTAB法提取樣本基因組DNA并進行質量檢測，對質量合格的DNA進行下一步上機測序。

1.3 RAD文庫構建

首先應用限制性內切酶R I對基因組進行酶切，然后每個樣本分別進行物理打碎，選取200～ 400 bp插入片段文庫。利用Illumina HiSeq2000測序平臺進行雙末端(Paired End-150)測序，所有的文庫構建及上機測序都由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 測序reads過濾

對原始數據進行過濾，首先去除帶接頭(adapter)的reads pair；當單端測序read中含有的N含量超過該條read長度的10%時，需要過濾paired reads;當單端測序read中含有的低質量(Q≤5)堿基數超過該條read長度的50%時，去除此對paired reads[21]。

1.5 比對和變異檢測

將組裝樣本帶有酶切識別序列的reads進行聚類,并按照深度進行降序排序。將深度高的reads作為種子進行聚類。根據深度信息對聚類后的reads進行糾錯、過濾重復區域等。根據聚類的結果，將一端的reads進行contig拼接，結合insert的大小和overlap關系，將拼接后的contig與聚集在另一端的reads連接起來，組裝成最終的contig序列。使用VelvetOpti- miser軟件對個體RAD局部組裝，得到最后的組裝序列，并對100 bp以下的contig進行過濾得到基因組[22]?；蚪M大小為82 851 747 bp，群體樣本比對率為78.21%～83.46%，基因組平均測序深度為23.18×, 平均覆蓋度為92.64%。有效的高質量測序數據通過BWA軟件[23](參數：mem-t4-k32-M)比對到藍花楹組裝后的參考基因組，并過濾掉無法匹配和匹配到多處位點的序列；比對結果經SAM-TOOLS[24]去除重復(參數：rmdup)并歸類[25]用于變異檢測。經HWB (Hardy-Weinberg equilibrium)過濾后進行HWB檢驗,<0.05為遺傳不平衡，需要過濾掉，軟件：無，腳本執行。再進行LD (linkage disequilirium)過濾，連鎖強度2>0.8, 軟件：plink1.9–allow-extra-chr–indep- pairwise 50 5 0.8。

1.6 數據的統計分析

群體遺傳結構分析 經檢測和過濾后的高質量SNP可用于計算種群間的距離。運用Treebest- 1.9.2軟件計算距離矩陣，然后通過鄰接法(neighbor- joining method)構建系統進化樹判斷樣本間的親緣關系，使用Bootstrap為置信度檢驗統計方法，重復抽樣次數設為1 000次。運用GCTA軟件進行群體主成分分析。利用ADMIXTURE軟件進行群體遺傳結構分析[26]。群體進化樹分析、主成分分析和群體遺傳結構分析是群體遺傳學的常用分析方法。其中系統進化樹是描述群體間分化順序的分支圖或樹，可用來揭示群體間的進化關系，并根據群體遺傳特征推斷它們的親緣關系[27]。主成分分析是一種研究群體遺傳結構的多元統計方法。它主要基于個體基因組中SNP差異的程度，根據不同的性狀將個體聚類為不同的亞群，是確定物種亞群數量的有效方法[28]。為了進一步明晰168份種質間的遺傳關系，對其遺傳結構進行解析。采用PLINK軟件進行群體結構分析。首先創建PLINK的輸入文件-Ped文件，然后利用ADMIXTURE軟件構建群體遺傳結構和群體世系信息。

群體遺傳多樣性 類群的遺傳多樣性包括核苷酸多樣性、觀測雜合度(o)、期望雜合度(e)和群體間遺傳分化指數(st)。運用vcftools V 0.1.14軟件計算單位點核苷酸多樣性[()][29–30]。

2 結果和分析

2.1 測序基本數據分析

對168份藍花楹種質進行了RAD簡化基因組測序，共獲得測序數據量355.51 Gb，平均2.12 Gb。經過對測序數據的嚴格過濾，得到高質量的cleandata為353.28 Gb，平均2.10 Gb，平均GC含量為35.14%，堿基質量Q30達到92.10%，表明測序質量較高(表2)。每份種質資源平均獲得高質量序列13 920 867條，平均有11 290 873的序列條數可以比對到參考基因組，比對率為81.02%，平均測序深度為23.18×。平均比對率和平均測序深度均滿足分析要求，可以進行后續分析。

進行群體SNP的檢測，共獲得573 704個原始SNP。通過Q20質量控制、SNP的支持數(覆蓋深度)在4以上、miss小于20%、maf大于5%過濾和篩選，得到185 054個SNPs；經HWB過濾，共保留60 285個SNP；經LD過濾，共保留45 552個SNP，后續分析均基于HWB和LD過濾后高質量SNP進行分析。

表2 文庫構建測序信息

2.2 群體進化樹和主成分分析

利用鑒定到的高質量SNP對這168份藍花楹種質資源構建進化樹(圖1)，可見，供試藍花楹可分為2大類群，其中SCNJ、CQBB、SCYB、SCXC和SCPZH共5個地區的種質材料歸為類群I。其余14個地區的種質材料歸為類群II，包括SCCD、YNKM、FJQZ、YNDL、FJPT1、FJPT2、JXGZ、YNKY、GDGZ、GXRS、FJXM、YNMZ、YNWS1、YNWS2、GXNN和FJFZ。從SNP中提取關鍵信息，采用GCTA軟件對168份藍花楹材料進行PCA主成分分析, 圖2為基于3個主成分的PCA聚類圖, 可以清楚地反映個體的聚類情況，群體之間的距離能夠反映親緣關系的遠近。PCA分析中PCA1、PCA2和PCA3的解釋度分別為：0.182 476 058 936 713、0.046 452 359 970 902和0.040 372 436 296 260 5。從3個主成分PC1、PC2和PC3可知：來自SCNJ、SCYB、SCXC、SCPZH、SCCD、CQBB等6個地區的種質材料被歸為同一類群；其余13個地區的種質材料歸為另一類群, 與群體進化聚類分析結果基本一致。

2.3 群體遺傳結構分析

為了確定合適的分群數(K值)，用ADMIXTURE軟件分析樣品的群體結構，預先假定K值為2～15，分別進行運算，并使用交叉驗證確定K值，結果表明當K=2時為最優分群，即分為2大類群。結果表明(圖3)，群體Ⅰ為橙色，種質材料分別來自SCCD、SCNJ、CQBB、SCYB、SCXC和SCPZH等6個地區；群體II為藍色，種質材料來自其余13個地區。這與群體進化分析、主成分分析結果基本一致。為了解藍花楹的遺傳差異，計算了藍花楹群體間的遺傳分化系數(st)(表3)?？梢? 21個藍花楹群體間的st為0.016～0.178，其中CQBB與FJPT1、CQBB與FJPT2、CQBB與JXGZ的st分別為0.178、0.173和0.174；SCPZH與JXGZ和SCPZH與FJPT1分別為0.175和0.173，st均大于0.15，說明遺傳分化較大。FJPT1與FJPT2、YNWS1與YNWS2的st<0.05，說明遺傳分化很小，采樣時分別對大樹和小苗取樣的做法無意義。

圖1 168份藍花楹資源的群體系統進化樹

圖2 168份藍花楹種質資源的群體主成分分析

圖3 168份藍花楹種質資源的遺傳結構關系

表3 藍花楹群體間遺傳分化系數(Fst)

1～21見表1。

1-21 see Table 1.

2.4 群體遺傳多樣性分析

為了解藍花楹群體遺傳多樣性水平，進行了核苷酸多樣性和雜合度分析，核苷酸多樣性是指樣本中所有可能匹配成對的序列間核苷酸位點差異百分比的平均值，用表示。雜合度反映了群體中的遺傳變異程度，雜合度越高，表明群體內遺傳多樣性越高，包括觀測雜合度()和期望雜合度()。從表4可知，居群水平上，藍花楹的為0.293～0.347, 平均為0.320，為0.406～0.474，平均為0.433,為0.273～0.323，平均為0.298。其中, YNKM居群的和最大，分別為0.347和0.323，表現出最高的遺傳多樣性；其次為YNDL,、和分別為0.345、0.474和0.321；遺傳多樣性最小的是GXRS,、和分別為0.293、0.406和0.273。

3 結論和討論

藍花楹為國外引進的具有高景觀價值的觀花喬木，其種質資源利用還處在起步階段，進行遺傳多樣性分析和背景研究是十分必要的。本研究首次通過RAD-seq測序技術在全基因組水平上分析藍花楹群體的遺傳結構和遺傳多樣性，共獲得測序數據355.51 Gb，過濾后的高質量clean data為353.28 Gb。測序質量較高, 平均GC含量為35.14%，堿基質量Q20達到97.02%，Q30達到92.10%，說明建庫測序成功。共檢測獲得原始SNP 573 704個，鑒定出185 054個高質量SNP標記，經HWB和LD過濾保留45 552個SNP。這些標記信息將為藍花楹的遺傳育種、保護研究提供了基礎。

表4 21個藍花楹群體的遺傳多樣性參數

對168份藍花楹種質進行群體進化樹構建、主成分分析和群體結構分析，其結果基本一致。群體I的種質材料基本來自川、渝的6個地區，包括SCNJ、SCYB、SCXC、SCPZH、SCCD和CQBB，顯示親緣關系較近，這些地區的行政權屬早期均歸屬四川省管轄，引種栽培時有條件共享同一批種質材料, 說明行政權屬歸屬或地理區域近的材料遺傳距離比較接近，這與屈洋等[31]的研究結果一致。由系統進化樹的支持率可知，SCNJ、CQBB、SCYB、SCXC和SCPZH的支持率為48%，YNDL和GXRS為44%, YNKY、GDGZ、GXRS和FJXM為43%，YNMZ、YNWS1、YNWS2、GXNN和FJFZ為14%，這些種質無法通過系統進化樹分開，可能與種源引入我國后是以種子實生苗繁殖，多年的混亂雜交造成的; 也可能是在來源地已經有充分的基因流，沒有形成顯著分化。GXRS和YNDL、FJXM，FJFZ和JXGZ以及GDGZ和FJPT群體間呈現出少數的個體混雜現象，表明群體間存在基因交流。

遺傳多樣性分析基于SNP位點的核苷酸多樣性()、觀測雜合度()、期望雜合度()[32]。本研究結果表明，21個藍花楹群體的、和均較高，意味著藍花楹在SNP水平上的遺傳多樣性較高, 與海南風吹楠()[33]的研究結果相似。

st是分析群體遺傳分化程度的重要指標之一[30]，Wright[34]提出，當st為0～0.05時群體間遺傳分化很小，可以忽略不計；當st為0.05～0.15時群體間的遺傳分化表現中等；當st為0.15～0.25時群體間遺傳分化較大；當st大于0.25時，群體間有很大的遺傳分化。本研究中群體間的st為0.016～0.178，表明各群體間的遺傳分化程度較高。其中，來自川、渝地區的群體I (SCNJ、SCYB、SCXC、SCPZH、SCCD和CQBB)與群體II (FJFZ、JXGZ、YNDL、FJPT1、FJPT2、YNKM、GXRS、FJQZ、FJXM、YNKY、YNWS1、YNWS2、YNMZ、GDGZ和GXNN)的遺傳分化程度較高，這與群體系統進化樹、主成分分析與群體遺傳結構分析結果一致。即兩大群體間遺傳分化比較大，群體內部居群間遺傳分化較小。FJPT1與FJPT2居群和YNWS1與YNWS2居群間的遺傳分化最小，說明同一地域大樹和小苗采樣對遺傳多樣性和遺傳分化無差異，說明該地區藍花楹種苗無遷移。

盡管藍花楹最早于20世紀20年代就引入中國，主要作為城市景觀樹種，但早期保存下來的數量并不多，90年代后期藍花楹在中國得到了較快推廣，遺憾的是，早期引種的藍花楹的來源地、具體栽培時間等遺傳背景均不清晰，后期栽培的藍花楹基本來自國內種子繁殖培育，或許正是由于這種不清晰的遺傳背景，從而難于尋找出類群II中來自其余13個地區種質材料彼此間親緣關系的遠近規律。少數幾個種質材料在不同的研究中被劃分到不同類群或亞群，呈現出較細微差別，這可能是計算依據不同而導致的，這與王小柯等[35]的研究結果一致。

盡管藍花楹引種栽培到中國的遺傳背景不清,影響了對本研究部分結果的深入研判，但本研究通過對藍花楹的遺傳多樣性和群體結構分析，構建起了藍花楹的遺傳圖譜，為藍花楹育種、系統發育研究、遺傳保護、分子標記開發以及產業開發應用等提供了理論基礎。同時較系統完整的保存了一批早期引種到中國的藍花楹遺傳材料，為后續的深入研究奠定了基礎。對于藍花楹種質資源遺傳背景的判定，相比于性狀鑒別法和ISSR分子標記[36]來說, RAD-seq技術更具優勢，更能準確地反映種質資源間的親緣關系。

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Population Genetic Analysis ofby RAD Hight Throughput Sequencing Technique

LIU Xuefeng1, LI Xiaomei2, ZHANG Guowu1*, ZHANG Peijian1, LIU Guo1, HUANG Min1, CHEN Yinxia3

(1. China Eucalypt Research Centre,Zhanjiang 524022, Guangdong, China; 2. Zhanjiang University of Science and Technology,Zhanjiang 524000, Guangdong,China; 3.Jiangxi Forestry Sci-tech Promotion and Propaganda Education Center,Nanchang 330033, China)

In order to understand the genetic diversity ofgermplasm resources, 168 germplasms ofwere restriction-site associated DNA sequencing (RAD-seq), and then the phylogenetic tree was constructed, principal component (PCA), population structure and genetic diversity were analyzed. The results showed that the mean alignment rates to the reference genomes were 81.02% with an average sequencing depth of 23.18×. After cleaned and filtered, a total of 45 552 SNPs were obtained. All tested germplasms could be clustered into two groups, those from Sichuan-Chongqing region were in one group, and the rest were in another group.has a high genetic diversity at the SNP level. Among them, nucleotide diversity (π) and expected heterozygosity () in YNKM population is the largest, showing the highest genetic diversity. Therefore,from Sichuan-Chongqing region showed relatively close genetic relationship, suggesting that they might from the same ancestor, and those from other regions might be randomly introduced and cultivated.

; RAD-seq; Genetic diversity; Population genetic

10.11926/jtsb.4517

2021-09-02

2021-12-13

中央級公益科研院所專項資金項目(CAFYBB2019MB004)；廣東省林業科技創新項目(2018KJCX024)資助

This work was supported by the Project for Central Public Research Institutes (Grant No. CAFYBB2019MB004), and the Project for Forestry Science and Technology Innovation in Guangdong (Grant No. 2018KJCX024).

劉學鋒(1985生)，工程師, 從事森林培育及園林植物學研究。Email: cercliuxf@caf.ac.cn

. E-mail: fyzgwu@163.com