動物藥水牛角基礎與應用研究進展

湯佳瑤,武文星,朱悅,郭盛,趙明,2,曹鵬,2,劉睿,2,段金廒,2

(1.南京中醫藥大學/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/國家中醫藥管理局中藥資源循環利用重點研究室,江蘇 南京 210023;2.動物類中藥與功能肽國際合作聯合實驗室,江蘇 南京 210023)

角類動物藥為傳統中藥的重要組成部分,它指特定動物的角及其加工品,屬于皮膚衍化物的組織,由角質細胞組成[1]。角類動物藥可分為表皮角和角質角,表皮角如犀牛角,由表皮角質層所產生的毛狀角質纖維組成;角質角又分兩種,由真皮形成的骨質芯與表皮形成角質鞘構成的為洞角,如水牛角、牦牛角、羚羊角;已骨化的角為骨角,如鹿角和麋鹿角[2]。2020年版《中國藥典》收載3種角類中藥,包括鹿角、羚羊角和水牛角,其中水牛角為?？苿游锼ubalusbubalisLinnaeus的角,具有清熱涼血,解毒,定驚的功效,主要用治溫病高熱,神昏譫語,發斑發疹,吐血衄血,驚風,癲狂等疾病[3]。水牛角始載于《名醫別錄》:“療時氣寒熱頭痛”[4]，其作為傳統動物藥,在中醫臨床已有上千年應用歷史,其功能主治及臨床用途廣為人知。

水牛角及其濃縮粉作為犀角代用資源廣泛應用于中醫臨床與中藥制藥行業[5-8],取得了良好的社會與經濟效益。40多年來,中醫藥科技工作者圍繞水牛角功效物質基礎、生物效應機制、質量控制等方面開展系列研究,取得了階段性進展與成效[9-11]。在此基礎上,本文進一步梳理與挖掘水牛角資源價值,從水牛角本草記載、物質基礎、質量評價、藥理藥效評價進行綜述,結合團隊前期研究進展,提出水牛角基礎與應用研究方向,并以水牛角為示范,建立科學、系統角類動物藥科學研究模式與評價體系,助力中藥資源產業可持續發展,進一步提升角類動物藥的經濟效益與社會效益。

1 藥用記載與歷史沿革

1.1 基原記載

古籍中對于水牛角的原動物基原鮮有記載,大多認為水牛角即水牛的雙角。在現代文獻中,《中華本草》記錄：“水牛四肢較短,蹄較大。皮厚無汗腺,毛粗而短,體前部較密,后背及胸腹較疏。體色大多灰黑色,但亦有黃褐色或白色的。全國大部分地區均飼養,以南方水稻地區較多”[12]。2020年版《中國藥典》記錄:“水牛角為?？苿游锼ubalusbubalisLinnaeus的角”[3]。

水牛為一種草食反芻家畜,頭向前伸,額部突起,眼大稍突出,口方大,鼻孔大,鼻鏡寬呈黑色(白水牛為肉色)。水牛角角基近方形,向左右平伸、呈新月形或弧形;水牛全身被毛為深灰色或淺灰色,隨年齡增長,毛色逐漸由淺灰色變成深灰色或暗灰色。大型水牛體質量平均在600 kg以上,體高在135 cm以上;小型水牛體質量平均在500 kg以下,體高平均在126 cm以下。水牛主供役用,挽力強,行步穩重,特別適宜于水田耕作。中國水牛屬沼澤型水牛,大多數分布于東南和西南,以在淮河以南的水稻產區最多。

水牛分為河流型水牛和沼澤型水牛兩種類型,河流型水牛包括印度摩拉水牛、巴基斯坦尼里-拉菲水牛和地中海水牛,主要分布在印度、巴基斯坦和地中海沿岸國家和地區;沼澤型水牛包括中國水牛、越南水牛、菲律賓水牛,主要分布在中國和東南亞國家。其中,中國水牛有24個品種,水牛資源較為豐富多樣[13]。江蘇地區水牛以海子水牛和山區水牛為主,由于江蘇北部沿海群眾對生長在海邊草灘上的牛群都冠以“海子”二字而得名“海子水?！?。海子水牛為亞洲野生水牛人工馴化后的變種,2006年起,“海子水?！北晦r業部列入國家級畜禽遺傳資源保護名錄。海子水牛體型碩健,背部平直,額寬而突,背寬胸深,肌肉豐滿,四肢強健,前肢直立,后肢呈適度弧形,蹄圓而色黑,質地致密,深色牛角、蹄色黑亮。海子水牛的角型大多向后成環抱形,環抱角有大、中、小之分。最大的環抱角左右兩角彎曲處的最大距離約1 m;也有兩角向左右成直線平伸,角長60 cm左右;角尖向后略彎,因左右兩角在一條直線上,形似扁擔,而被稱為“扁擔角”。山區水牛體型中等,被毛也多為石板青色。頭部適中,眼大有神,角大向后上方平彎。頸粗壯較短,前軀髻甲高長,背腰寬平,胸寬,腹大而不下垂,尻部傾斜,尾根低而粗,尾長不過飛節。四肢粗壯,蹄小質堅。

1.2 藥性及功效記載

水牛角藥用始載于《名醫別錄》,列為中品,“可療時氣寒熱頭痛”[4]?！缎滦薇静荨泛汀蹲C類本草》延用《名醫別錄》的說法[14-15]?！度杖A子本草》記載：“煎,治熱毒風并壯熱”[16]?！妒備洝酚涊d：“牛角燒灰,酒服方寸匕,日五服”，可治石淋,破血[17]?！短绞セ莘健酚涊d：“牛角、羊角(燒灰)等分,豬脂調涂”可治赤禿發落[18]?！侗静菥V目》對水牛角的藥性進行了說明,其：“苦,寒,無毒;水牛者燔之,治淋、破血”[19]?！蛾懘ū静荨吩疲骸靶?、咸,寒。涼血解毒,止衄。治熱病昏迷,麻痘斑疹,吐血,衄血,血熱,溺赤”[20]?！毒е楸静荨酚涊d其“清熱、利水、治下落水腫”[21]?！端拇ㄖ兴幹尽犯爬ㄆ涔πе髦螢椤爸物L熱頭痛,喉頭紅腫,小兒驚風及吐血”[22]?！度珖胁菟巺R編》載其“清熱鎮驚,涼血止血。主治熱病驚厥,高熱,神昏,譫語,吐血,衄血,斑疹,血小板減少性紫癜,精神分裂癥,小兒夏季熱”[23]。綜合歷代本草記載,水牛角其藥性可歸納為苦、寒,鎊片水煎入藥用治溫熱病、驚風、斑疹等疾病,而牛角燒灰后,其功效主治有所改變,主要用于治療赤禿發落和淋證、破血,不同的炮制方法,水牛角的功效有所不同,其原因可能與水牛角燒灰之后物質成分改變有關,但未見深入研究,其機制尚待闡明。歷代本草著作對水牛角的性味功效主治記載見表1。

表1 歷代本草著作對水牛角的性味功效記載

1.3 中醫藥典籍中水牛角方劑的應用

依據水牛角的性味歸經及功效,中醫臨床常以單方或復方應用。以“水牛角”為關鍵詞查詢南京中醫藥大學中藥方劑文獻數據庫、2020年版《中國藥典》和藥智網,共得到歷代方書記載含水牛角方劑23首。對水牛角方劑進行統計梳理,發現水牛角成方后多水煎,以湯劑服用,或者研成細粉入丸劑,23個古籍記載方劑中有10個方劑以湯劑服用,4個方劑以丸劑服用。根據主治病癥分布對水牛角方藥進行統計,結果如表2,水牛角方劑主要用于治療溫熱病、神昏譫語、斑疹、咽喉腫痛、目昏、小兒驚厥、中風等疾病。

表2 水牛角方藥主治病證分布

2 水牛角物質基礎研究

水牛角主要含有蛋白質類、肽類、氨基酸類、含硫類、核苷類、無機元素類等化合物。

2.1 蛋白質類

水牛角含有豐富的蛋白質類成分,是構成水牛角致密結構的主要成分,更是水牛角的重要功效物質。課題組前期研究通過反復抽提蛋白質類成分,將水牛角細粉制備獲得可溶性蛋白與不溶性蛋白兩部分,基于Shotgun蛋白質鑒定技術[24],從可溶性蛋白部分中鑒定了46個蛋白質,其中角蛋白17個,占比37.0%;不溶蛋白部分鑒定了72個蛋白質,其中角蛋白16個,占比22.2%。合并兩部分鑒定信息,從水牛角中共鑒定了90個蛋白質類成分,基于蛋白質的鑒定覆蓋率、多肽數量,多肽匹配圖譜(PSM)等信息比較歸類,水牛角中角蛋白(Keratins)、角蛋白相關蛋白(Keratin associated protein)、連接蛋白(Junction plakoglobin)、橋粒蛋白(Desmoplakin)等結構蛋白占主導數量。在此基礎上,課題組進一步通過iTRAQ同位素標記定量蛋白質組學的方法,對不同角類動物藥中共性蛋白質的相對含量進行比較分析,結果表明,盡管水牛角抽提液的蛋白質總量顯著低于犀角、廣角的抽提液,但水牛角與犀角、廣角的蛋白質類成分組成、相對含量比例接近。主成分分析(PCA)表明水牛角中角蛋白、角蛋白相關蛋白、橋粒芯蛋白(Desmoglein)、橋粒糖蛋白(Desmocollin)、連接蛋白、橋粒蛋白等主成分與犀角、廣角最接近。此外,水牛角中2種蛋白質交聯酶Transglutaminase 1(TGM1)與Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E(TGM3)的水平與犀角、廣角接近,TGM3參與催化角蛋白的N-(γ-谷氨酰)賴氨酸交聯形成等肽鍵,將細胞質內蛋白質相互連接,而TGM1可交聯細胞周邊的蛋白質。上述研究表明水牛角在蛋白質種類、結構組成方面與犀角、廣角接近,為水牛角作為犀角類效資源使用提供了依據。

2.2 肽類

水牛角傳統用法常以煎煮單用或入方劑使用,經過煎煮后，蛋白質類成分經非特異性降解釋放一些可溶性肽類成分。近年來隨著現代儀器與技術手段的發展進步,圍繞水牛角肽類成分的分離、純化、鑒定等方面開展了進一步研究。

課題組前期通過凝膠、離子交換、反相色譜多維色譜結合從水牛角提取液中分離純化獲得3個活性肽,氨基酸序列分別為QYDQGV、YEDCTDCGN、AADNANGLFPPN,對過氧化氫誘導的腦微血管內皮細胞損傷具有顯著的保護作用[25]?；钚詫蛳碌亩嗑S色譜聯用分離活性肽類成分是經典的肽類分離、分析方法,但效率較低。課題組進一步采用多肽組學的方法,從水牛角活性部位中鑒定了824個肽段信息,進一步通過肽序列熱圖分析,發現水牛角活性部位的肽段來源于KRT14、KRT34、KRT86等主要角蛋白的特定序列,提示我們水牛角活性多肽可能為一類具有相同或相似氨基酸序列信息的物質[26]。

角蛋白是構成水牛角的主要蛋白質類成分,角蛋白穩定的結構與其二硫鍵(-S-S-)的形成密切相關,而水牛角在特定條件下,如高溫煎煮、體內生物酶等作用下,其角蛋白發生非特異性降解,甚至可能發生-S-S-斷裂形成游離巰基(-SH)。-SH作為一種活潑基團,在多種生物過程和疾病中起到重要作用,近年來受到廣泛關注[27],如-SH經酶催化轉化為硫化氫(H2S),H2S作為重要的內源性氣體信號因子在維持內皮功能穩定等方面起到重要作用,王春雪等[28]通過熒光衍生法測定水牛角-SH含量為18.3～38.3 μmol·g-1,含有-SH的肽類成分可能為水牛角重要物質基礎,如水牛角提取液分離得到的活性肽YEDCTDCGN,即含有2個-SH。為此,課題組制備了核殼型Fe3O4@PDA@Au納米材料對水牛角中含-SH肽類成分進行富集、鑒定與表征,結果水牛角含-SH部位(富集液)中共檢測到2 254個肽類成分,其中含-SH肽類成分709個,水牛角含-SH部位的活性評價表明,相較于水牛角提取液,其抗氧化、抗炎活性均顯著提升。如此表明,活性肽類是水牛角重要功效物質,其中含-SH肽類成分是其抗炎、抗氧化關鍵物質基礎[25,29]。

2.3 氨基酸類

水牛角中的蛋白質與肽類經水解后得到多種氨基酸,氨基酸作為蛋白質的基本單位,對于維持正常生理功能和機體代謝過程具有重要意義。課題組前期研究對水牛角18種水解氨基酸進行了測定,其中谷氨酸含量最高,為12.59%,其次分別為精氨酸(10.00%)、亮氨酸(8.50%)、半胱氨酸(8.35%)、酪氨酸(8.05%)、天冬氨酸(6.95%)、絲氨酸(6.90%)、甘氨酸(6.76%)等,水牛角中8中必需氨基酸含量為36.95%[30]。此外,?；撬嶙鳛橐环N結構簡單的含硫氨基酸,是調節機體正常生理活動的活性物質,采用OPA柱前衍生法,測得水牛角中?；撬岬暮繛?.46 μg·g-1[31]。

2.4 核苷類

核苷類是具有廣泛生理活性的一類水溶性成分。課題組前期通過UPLC-Q-TOF/MS分析水牛角水提液活性部位(MW<1 000 kDa)中含有尿苷、次黃嘌呤、鳥苷和腺苷核4種苷類成分[24]。采用親水作用色譜-超高效液相色譜-三重四極桿質譜法(HLIIC-UPLC-QQQ-MS)測定了9個批次水牛角樣品14個核苷和含氮堿基類成分的含量,結果表明水牛角總核苷含量范圍為123.36～233.22 μg·g-1,其中黃嘌呤和鳥嘌呤占比較大[32]。因此,水牛角的核苷類成分含量可以為水牛角質量控制和真偽鑒別提供參考。

2.5 無機元素類

無機元素是生物體的構成元素,其參與多種生理過程,具有重要的生物功能。

王斐[30]通過微波消解制備水牛角樣品,測定水牛角中的35種無機元素,結果表明硫、鈣、鋅、磷、鉀、鈉、鐵等為水牛角主要元素,其中硫元素含量最為豐富,達28.10 mg·g-1。

3 水牛角質量評價研究

3.1 藥材鑒定

3.1.1 性狀鑒定和顯微鑒定 水牛角形狀彎曲呈弧形,根部方形或略呈三角形,中空,一側表面有多數平行的凹紋,角端尖銳。色黑褐,質堅硬,剖面紋細而不顯,氣腥。一般多用其角尖部。水牛角的基礎為額骨的角突,角突腔與額竇相通,幼牛的角突內腔有若干不完整的中隔,隨著年齡的增長,中隔逐漸為骨嵴所替。角突之外有骨膜和真皮層,最外部為角殼,真皮實角質發生部位。角的基部有豐富的血管和神經分布,是供應角生長所需營養的源泉。當水牛角處于營養好的時期,其角生長較好,角殼較厚。反之,則角生長較慢,角殼較薄。由于生理與環境等因素的影響,如懷孕、哺乳、飼草因四季變化而營養成分不同,使得水牛的角上形成了一圈圈的溝和脊,呈輪狀構造,稱之為“角輪”[33]。水牛角性狀外觀參見圖1。

水牛角粉末為灰褐色,不規則形碎塊淡灰白色、淡灰黃色或灰褐色,縱斷面可見細長梭形紋理或有縱長裂縫。布有微細灰棕色色素顆粒;橫斷面梭形紋理平行排列,呈弧狀彎曲,似波峰樣,有眾多黃棕色色素顆粒。有的碎塊表面較平整,色素顆粒及裂縫均少[3]。水牛角切片直接顯微觀察,切面呈水波紋樣。水牛角粉為不規則碎塊淡灰白色或灰黃色?？v斷面觀可見細長梭形紋理,有縱長裂縫,布有微細灰棕色色素顆粒;橫斷面觀梭形紋理平行排列,并弧狀彎曲似波峰樣,有眾多黃棕色色素顆粒。有的碎塊表面較平整,色素顆粒及裂隙較小,難于察見[3]。

盡管薄層法[34]、紅外法[35]、高效液相法[36]、毛細管等電聚焦法[37]等已應用于水牛角的鑒別及區分其他角類,但是由于專屬性不強,或檢測靈敏度不高,不能行之有效地用于水牛角鑒別。近年來DNA條形碼、蛋白質、多肽檢測的技術手段應用于水牛角專屬性鑒別,并取得了較好的效果。

3.1.2 DNA條形碼鑒定 劉旭朝[38]以COⅠ序列為DNA條形碼,取水牛角及其易混品的原動物和市售藥材樣品155份,從中獲得93條水牛角及其易混偽品的原動物COⅠ序列,經核驗后均已納入中藥材DNA條形碼鑒定系統數據庫,建立基于DNA條形碼技術的水牛角及其易混偽品鑒定方法。

3.1.3 特征肽鑒定 課題組前期基于多肽組與數學集合分析的方法,發現4條水牛角特征肽:通過nanoLC-Orbitrap-MS質譜分析12批水牛角、6批山羊角、3批豬蹄甲和2批牦牛角經胰蛋白酶酶切后的全部肽段信息,結合數學集合理論分析,從水牛角肽組中排除非水牛角的肽類,進一步通過BLAST比對,確定4個水牛角特征肽,序列分別為GPSLAGSASSVR、GGVTCGGLTYSTTAGR、ICEGVGPVDIAVSSSR、LVNELTEFAK,采用UPLC-QQQ-MS的多反應監測(MRM)模式,對4個特征肽的離子對進行優化,并對不同角類樣品進行檢測,驗證4個特征肽的專屬性,結果表明4個特征肽在水牛角與牦牛角中均可檢測到,而在山羊角、豬蹄甲中未見響應,表明可用于區分水牛角與山羊角、豬蹄甲[39]。后續基于數學集合與Label free定量多肽組學分析篩選,確定3條牛角特征肽段,序列分別為:AIGCGFGSSGGSSSTIK(特征肽1)、TCGFSTVGSGFGSR(特征肽2)及SDLEAEVESLK(特征肽3),3個特征肽在水牛角、黃牛角及牦牛角中相對含量不同,根據3個特征肽存在方式可進行判別:水牛角樣品可檢出特征肽1與3,黃牛角可檢出特征肽1與2,牦牛角可檢出特征肽2與3[40],這一策略為近緣物種動物藥鑒別區分提供思路與方法。

3.2 質量評價

為有效控制水牛角的質量,按照藥典規定方法,侯惠嬋等[41]測定水牛角中含氮量,發現12批水牛角濃縮粉與角尖、角樁間氮總量差距較小,平均值為15.9%;課題組前期測定了10批水牛角濃縮粉樣品中水分、總灰分、酸不溶灰分、浸出物和?；撬岷?結果表明10批水牛角濃縮粉水分為1.8%～13.8%,總灰分為1.0%～6.0%,酸不溶性灰分為0.2%～2.2%,水溶性浸出物含量為3.2%～6.9%,?；撬岷繛?.9～61.5 μg·g-1[42]。另外,現代研究通過高效液相法檢測水牛角中氨基酸含量,以此控制水牛角質量。裴玉等[43]采用Prevail C18柱,以磷酸二氫鈉緩沖液、甲醇、乙腈為流動相,建立了OPA-FMOC試劑聯用柱前衍生氨基酸的高效液相色譜分析方法,能夠同時測定水牛角藥材中18種常見氨基酸含量。劉博譞等[44]采用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化法建立水牛角濃縮粉氨基酸成分含量分析方法和總氨基酸HPLC特征圖譜,能夠同時測定6種氨基酸成分含量,得到14個氨基酸類特征峰。盡管科研工作者采用了多種方法對水牛角的質量進行評價與控制,但目前質控體系仍有待深入與完善,為藥材與原料、中藥制藥行業質量控制提供靈敏度高、專屬性強的方法體系。

4 水牛角生物效應評價研究

水牛角具清熱解毒、涼血定驚之功效,現代藥理研究主要圍繞水牛角解熱、鎮靜、促凝血等藥理活性展開。中醫臨床常用水牛角及其方劑治療熱證,療效確切,近10年來,水牛角生物效應研究主要以解熱效應評價為主。

4.1 解熱作用

發熱模型按發熱機制的不同,可以分為兩大類:感染性發熱和非感染性發熱。課題組前期研究選擇兩種整體動物發熱模型研究水牛角水提液解熱效應,結果表明水牛角對感染性發熱(酵母致熱)與非感染性發熱(脫脂牛奶致熱)動物均有顯著的解熱作用,2種發熱模型均與PGE2水平升高有關[45-46]。進一步研究發現水牛角顯著降低酵母致熱大鼠體溫的同時,亦可顯著降低發熱大鼠血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2等炎癥因子水平[47]。

基于UPLC-Q-TOF-MS和多變量統計分析方法檢測水牛角提取物對解熱相關的所有生物標志物干預情況,結果表明,水牛角可調節包括甘油磷脂、花生四烯酸(Arachidonic acid)、氨基酸、鞘脂和嘌呤代謝等生物標志物,水牛角解熱作用與干預花生四烯酸代謝通路與氧化應激通路相關[48]。

在炎癥發生過程中,腦微血管內皮細胞受到IL-1β或TNF-α等炎癥因子刺激后釋放PGE2類物質,從而影響中樞體溫調定點進而引起體溫上升。課題組前期研究發現,水牛角提取液可下調腦微血管內皮細胞炎癥應激下釋放的PGE2水平,且水牛角對過氧化氫(H2O2)誘導微血管內皮細胞氧化損傷也具有保護作用,可抑制乳酸脫氫酶(LDH)的釋放,提高超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性[47]。

此外,水牛角水提液<3 kDa部位可顯著降低發熱大鼠體溫,顯著降低發熱大鼠血漿IL-1β、TNF-α、PGE2與cAMP水平[24],有報道含-SH的化合物具有一定的解熱作用,如α-硫辛酸和N-乙?；?L-半胱氨酸能夠通過抑制NMDA受體依賴羥基自由基通路降低自由基產生來緩解發熱[49-50]。而水牛角肽類分析結果表明,His、Pro、Cys、Tyr、Trp、Phe、Met等氨基酸的出現頻次較高,Cys為含-SH氨基酸,且作為良好的質子供體,Cys可參與氧化還原反應對抗氧化應激,亦具有發揮解熱、抗炎作用的潛力。此外,-SH及活性硫簇(Reactive sulfur species,RSS),如HS·、H2Sn、H2S等可降低腦內視前區PGE2、cAMP、cGMP等的釋放,從而緩解炎性,-SH作為關鍵RSS類物質與解熱作用密切相關[51-52]。因此,水牛角解熱作用確切,與其干預炎癥發生過程、氧化應激發生過程密切相關。

4.2 鎮靜作用

研究表明,水牛角具有較好的鎮靜作用,可顯著減少小鼠自發活動次數,可協同戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時間[10]。李寶國等[53-54]研究給予小鼠以水牛角不同相對分子質量的酶解液,發現水牛角能延長戊巴比妥鈉致小鼠睡眠的時間,其中相對分子質量<3 kD和10～30 kD的酶解液有明顯的鎮靜作用。

4.3 止血作用

通過小鼠斷尾模型和玻管凝集試驗測定水牛角的凝血時效,發現水牛角止血作用起效快,止血作用持續6 h左右。其中,相對分子質量>30 kD酶解液有明顯的止血作用。此外,在體外血小板聚集試驗結果發現水牛角水解物具有血小板激活作用,但作用強度較弱,水牛角的止血作用可能與激活血小板有關[54-57]。

水牛角藥理作用以解熱、鎮靜、止血作用為主,作為一種活潑基團,-SH水平及正常機體血漿中-SH與-S-S-的比例(-SH/-S-S-)穩態平衡與多種疾病相關,病理狀態下機體的-SH/-S-S-水平會發生不同程度的上調或下調[58]。機體在發熱、炎癥、驚厥等狀態下,-SH/-S-S-水平會發生不同程度改變。例如,在驚厥動物模型中,血漿-SH的水平顯著降低,而-S-S-的水平顯著升高[59];有研究表明,GSH、N-乙酰半胱氨酸(NAC)等含-SH化合物可降低LPS誘導的發熱大鼠體溫,并降低腦內視前區PGE2、cAMP、cGMP等的釋放,從而緩解炎性發熱[60-61],-SH、H2S等關鍵RSS與發熱、炎癥等密切相關;另有研究表明,-SH/-S-S-的平衡與凝血酶功能、血液凝固有關,-SH/-S-S-的交換可能是諸多凝血因子活性的限速步驟,也可能是凝血級聯的整合和控制的基礎[62]。根據文獻報道及課題組前期研究結果,水牛角中含-SH類化合物與其清熱、鎮靜、止血等藥理作用緊密相關。

5 水牛角作為犀角代用資源的應用歷史

犀角為哺乳綱奇蹄目犀科動物印度犀RhinocerosunicornisLinnaeus、爪哇犀RhinocerossondaicusDesmarest、蘇門犀RhinocerossumatrensisFischer的角;廣角為黑犀RhinocerosbicornisLinnaeus或白犀RhinocerossimusCottoni的角。犀(廣)角具有清熱定驚、涼血解毒等功效,可用治熱盛火熾、壯熱不退、神昏譫語、驚厥抽搐等癥,《神農本草經》始載道:“味苦寒”“治百毒,蟲疰,邪鬼,瘴氣,殺鉤吻,鴆羽,蛇毒,除邪,不迷惑,魘寐,久服輕身”[63]。1963年版《中國藥典》記載犀角“味苦、酸、咸,性寒”“具有清熱,涼血,解毒之功效;主治傷寒時疫,熱入營分,驚狂,發黃,班疹,神昏譫語,血熱妄行,吐血,衄血,下血,熱毒瘡腫”[64],臨床療效顯著,但犀角多依賴進口,價格昂貴,且資源匱乏,應用于臨床治療受到一定限制。1970年,犀牛被CITES列入瀕危物種,受到國家保護;1993年5月29日,國務院發布《關于禁止犀牛角和虎骨貿易的通知》,明令禁止交易和使用犀角產品。此外,加之賽加羚羊的數目驟減,犀角、羚羊角在臨床使用受到極大限制。珍稀角類藥材臨床使用的必要性與現有法令禁止使用的矛盾加劇,因此越來越多的研究人員開展尋找珍稀角類動物藥材替代資源的研究。

20世紀70年代,為尋找犀、廣角替代資源,國家行業部門對多種角類進行了比較性研究與評價,結果認為水牛角具有相似和確切的功效,且資源豐富、取材廣泛、價格低廉,有效地緩解了中醫臨床對于犀、廣角的依賴性與法律禁止使用犀、廣角的矛盾。而后1977年版《中國藥典》收載了“水牛角濃縮粉”,即以水牛角管狀部分磅片、水煎、取煎液濃縮后加入經微粉化的角尖粉混合制粒所得,并廣泛代用犀、廣角用作醫藥工業和臨床調劑,取得了良好療效。據統計,現制藥行業和臨床上使用的現代水牛角處方制劑共計172種,包括濃縮水牛角顆粒、紫雪膠囊、安宮牛黃丸等,在臨床上主要用治高熱、神昏譫語、驚風抽搐、小兒熱急驚風、頭暈目眩、高血壓等疾病。

目前中醫臨床及中藥制藥行業以水牛角或水牛角濃縮粉替代犀角應用于方劑及中成藥，如：清營湯、犀角湯、犀角地黃湯等均以水牛角替代犀角使用,這些方劑在清熱解毒、定驚涼血等方面均取得了較好的功效。3 871例臨床資料分析表明,水牛角替代犀角治療乙腦、小兒夏季熱、急性扁桃體炎等高熱病證的效果明顯[65]。藥理學研究表明水牛角與犀角在解熱、止血、鎮靜等方面具有相似的藥理作用。犀角水煎液與水牛角濃縮粉水煎液均能明顯降低大腸埃希菌內毒素所致小鼠死亡率;縮短DIC模型大鼠凝血活酶時間、凝血酶原時間、凝血酶時間,升高血小板數;能協同戊巴比妥鈉延長小鼠睡眠時間,二者均具有抗炎、止血、鎮靜的作用[10]。在松節油致大鼠發熱模型中,2.5 g·mL-1犀牛角和水牛角的水提物均表現出顯著的解熱作用[55]。但是在實際臨床應用中,水牛角替代犀角入藥時,往往需要加大劑量,其功效才能與犀角相當。例如,水牛角代用犀角使用的比例(犀角∶水牛角),在清營湯中為3∶10～3∶20或1∶15，在犀角地黃湯中為1∶10～1∶20，在紫雪中為3∶5或4∶15，在蘇合香丸中為1∶10，在清瘟敗毒飲中為1∶10，在安宮牛黃丸中為1∶20，在至寶丹中為1∶10[23,66-69]。犀角藥用歷史及水牛角代用現狀見圖2。

6 水牛角資源利用與前景展望

水牛角為傳統角類動物藥,在中醫臨床與中藥制藥行業應用廣泛,歷史悠久。然而一直以來水牛角的基礎研究薄弱,盡管多年來中醫藥科研工作者圍繞水牛角等角類動物藥的物質基礎、生物效應、質量控制等方面開展研究,但尚不完善,符合水牛角以及角類動物藥資源功效特點、化學物質組分特點的方法體系與開發模式亟待構建。

6.1 深入開展水牛角功效物質基礎研究,闡釋水牛角功效物質基礎與效應機制的科學內涵

前期研究表明,蛋白質、肽類為水牛角重要的功效物質基礎,其中豐富的含-SH肽類成分更是關鍵的功效物質。緊扣水牛角清熱、鎮靜、止血等藥理作用,合理運用有機化學、分析化學、材料化學等交叉學科的技術手段,有針對性地富集、表征并制備水牛角含-SH肽類成分,如利用制備高效-SH富集納米材料,通過親和層析方法批量制備水牛角含-SH肽類成分,采用高通量液質聯用分析手段,結合“蛋白質組-多肽組-修飾組”等多組學聯用策略[2,28-29,38],對水牛角功效物質進行全面表征;進一步采用經典藥理學、分子生物學、化學生物學、生物信息學等技術方法,合理利用模式生物建立符合水牛角傳統功效的動物模型,并從整體動物、細胞、離體器官、分子水平,圍繞其解熱、鎮靜、止血作用深入開展效應機制研究,從而系統闡釋水牛角功效物質基礎與效應機制的科學內涵。

6.2 構建水牛角質量控制和評價體系

2020年版《中國藥典》中水牛角項下僅有性狀與鑒別項,水牛角濃縮粉項下有性狀、檢查、浸出物、含量測定,這些方法與指標無法全面評價水牛角藥材、中間體、含水牛角成藥或配方顆粒等樣品的質量,對中藥制藥過程的質量控制、產品溯源、臨床用藥安全等方面不能形成全面質控,因而,科學、系統的水牛角質量控制和評價體系亟待構建。在2020年版《中國藥典》中,DNA條形碼、專屬肽檢測已應用于多個動物藥品種的鑒別,如基于COⅠ序列的DNA條形碼可用于區分水牛角及其偽品,課題組前期發現的水牛角特征肽可用于水牛角配方顆粒的檢測。2020年版《中國藥典》阿膠品種除了以氨基酸為含測指標外,增加了驢源多肽的含量指標,如此可顯著提升含量測定指標的專屬性,更適合于藥材中間體、成藥、配方顆粒等產品的質量控制。因此,以特征性肽類成分的含量對藥材及其產品的質控模式亦可應用于水牛角及水牛角濃縮粉。此外,采用Q-maker法[83],根據“屬性-效應-成分”理論,對水牛角進行“質量標記”,對多個活性成分進行同步測定,這種方法用于藥效成分復雜的中藥的質量評控更加科學、高效[84-85]。

本文從水牛角的本草記載、物質基礎、質量評價、藥理藥效評價進行梳理與歸納,結合課題組前期在水牛角基礎與應用研究,在水牛角清熱解毒、涼血定驚的傳統功效應用基礎上,圍繞水牛角功效物質基礎與效應機制科學內涵的闡釋,水牛角質量控制和評價體系的構建等方面提出設想與展望,以期更好地服務于中藥動物藥資源產業的提質增效及可持續發展。