基于氣道炎癥及Th1/Th2免疫通路探究抗支糖漿對霧化煙草提取物環境哮喘模型小鼠的影響

云靖婷，胡曉陽，李志軍，孫爽

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.哈爾濱醫科大學大慶校區，黑龍江 大慶 163711)

哮喘，又名支氣管哮喘，是由多種炎癥細胞和細胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，主要表現為喘息、氣促、胸悶、咳嗽等，且會隨時間變化而加重，伴有可逆性呼氣氣流受限[1-4]。哮喘的發病機制復雜，多項研究表明，哮喘的發生與氣道炎癥、免疫調節機制密切相關，這二者是導致氣道高反應性的重要因素，也是目前哮喘機制研究的重點[5-6]。近年來，隨著空氣質量下降、飲食衛生問題頻發等，哮喘發病人數逐年增多。雖然多數患者經過藥物治療后可以緩解，但仍會影響患者的生活質量，目前臨床常用的吸入性糖皮質激素(ICS)及長效β2受體激動劑有明顯副作用，而中醫治療哮喘有較大優勢，所以探究哮喘的影響因素與發病機制進而尋找治療哮喘更加有效的方法尤為重要[7-10]。

抗支糖漿由《金匱要略》中的經典古方射干麻黃湯衍化，經過多年臨床經驗總結而成，為黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院醫療機構制劑，本藥基于射干麻黃湯宣肺清熱、化痰平喘之功，依據哮喘的特點和病因病機，對其進行加減化裁，成此良藥，諸藥配伍，共奏宣肺疏風、化痰止咳、清熱平喘之功?？怪菨{具有較好的抑制氣道炎癥和免疫調節作用，但其具體的療效機制仍需進一步探索[5]。本實驗建立霧化煙草提取物環境哮喘模型小鼠，觀察小鼠一般狀態，對其肺組織進行病理學檢查，統計肺泡灌洗液(BALF)中細胞的分類及計數，選擇輔助性T細胞1/輔助性T細胞2(Th1/Th2)以及半胱氨酰白三烯受體(CysLTRs)所介導的炎癥通路作為研究對象，用ELISA法、Western Blot法和RT-PCR法檢測相關生理生化指標，以探究抗支糖漿的相關作用機制與影響，為臨床用藥提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級健康雌性昆明小鼠90只，體質量(20±2)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001。所有小鼠均采用黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供的全營養顆粒飼養，自由飲水，晝夜節律正常，實驗操作遵守《實驗動物管理條例》。

1.2 實驗藥物

抗支糖漿(組成：炙麻黃、苦杏仁、石膏、魚腥草、射干、僵蠶、地龍、拳參、炙百部、桑白皮、黃芩、虎杖、蘆根、平貝母、甘草)，由黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院配置生產，生產批號為黑藥制字z20131020，規格為250 mL/瓶。

1.3 實驗儀器與試劑

酶聯免疫檢測儀(DG5031)，上海珂淮儀器有限公司；包埋機(JB-P5)，武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(RM2016)，上海徠卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡(NikonEclipseE10)，日本尼康；高速臺式離心機(X-22R)，美國貝克曼儀器有限公司；自制玻璃霧化箱40 cm×30 cm×25 cm。

ELISA試劑盒，安迪生物科技(上海)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術研究所；PCR試劑盒，Roche公司；雞卵清蛋白OVA、氫氧化鋁，美國Sigma公司；孟魯司特納咀嚼片，杭州默沙東制藥有限公司。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

將雌性小鼠90只隨機分為9組,空白組(A組)、模型組(B組)、模型+抗支糖漿低劑量組(C組)、模型+抗支糖漿高劑量組(D組)、模型+孟魯司特組(E組)、模型+霧化煙草提取物組(F組)、模型+霧化煙草提取物+抗支糖漿低劑量組(G組)、模型+霧化煙草提取物+抗支糖漿高劑量組(H組)、模型+霧化煙草提取物+孟魯司特組(I組)，每組10只。

2.2 建模及給藥方法

稱取5 mg OVA，溶于50 mL生理鹽水，配置成致敏液。稱取5 g OVA，溶于100 mL生理鹽水中，得5% OVA溶液，霧化激發備用。稱取煙葉20 g，加入100 mL蒸餾水，開啟真空泵，調節流速，點燃煙葉，使其燃燒的煙霧過水，待20 g煙葉完全燃盡后，得煙草提取物溶液(質量濃度為20%，甲醛濃度為1.056 μg/mL，符合污染大氣標準)，霧化備用。

除空白組外，其余各組于實驗第0、7和14天給予每只小鼠腹腔+雙大腿皮下注射致敏液共0.2 mL致敏?？瞻捉M則以生理鹽水代替致敏液注射，部位及注射劑量與其余各組相同。實驗第1～27天，模型+霧化煙草提取物組、模型+霧化煙草提取物+抗支糖漿低劑量組、模型+霧化煙草提取物+抗支糖漿高劑量組、模型+霧化煙草提取物+孟魯司特組,4組小鼠置于自制霧化箱內，煙草提取物溶液甲醛濃度1.056 μg/mL霧化吸入，3 h/d，連續27 d。其余組不予任何處理。實驗第21～27天，除空白組外，其余各組將小鼠置于自制霧化箱中，以5%(m/v)OVA進行霧化吸入激發，45 min/d，連續7 d，觀察并記錄小鼠哮喘發作情況；空白組以生理鹽水代替OVA霧化激發。給藥組于實驗第21天開始進行藥物干預，給藥劑量按動物體表面積比值換算，在霧化激發前0.5 h給藥。

2.3 取材

末次霧化結束24 h內處死小鼠，切開其頸部及前胸正中皮膚，分離氣管，并結扎右主支氣管，在左側主支氣管處進行氣管插管，進行支氣管肺泡的灌洗。針管抽取0.5 mL生理鹽水，緩慢注入后保留20 s回抽，重復3次，每只小鼠收集肺泡灌洗液(BALF)1.2 mL，4 ℃保存，1 500 r/min離心10 min，沉淀物涂片固定；取上清液保存于-80 ℃的環境中，作為待測樣品；分別剪取右肺上葉組織與右肺下葉組織各100 mg，放入凍存管中標記，立即置液氮保存；取右肺中葉在4%多聚甲醛中室溫固定，用以病理組織檢查。

2.4 檢測指標及方法

2.4.1 一般狀況

觀察記錄動物模型整體狀態，判斷是否有異常，包括體質量、皮毛、活動情況、精神狀態、睡眠、進食與飲水及二便等，分析相關原因，判斷造模是否成功及藥物作用效果。

2.4.2 HE染色觀察肺組織病理情況

處死小鼠后取下肺組織塊投入預先配制好的10%福爾馬林固定液中固定24 h，采用70%、80%、90%、100%的梯度酒精與二甲苯使組織塊脫水透明，經浸蠟包埋后對其進行切片與貼片，再經由脫蠟、脫色與染色等過程，用中性樹膠封片，待樹膠干后，即可觀察。

2.4.3 BALF中白細胞的分類及計數

將收集到的肺泡灌洗液1 500 r/min 離心10 min，去上清后沉淀制備細胞懸液，分別取細胞懸液和0.4%臺盼藍染液按9∶1的比例混勻，取10 μL混合液加入血細胞計數板進行活細胞計數。用Hank’S液調整細胞懸液的濃度為4×105/mL，取50 μL的細胞懸液制備細胞涂片并干燥固定，先后滴加瑞氏染液與磷酸鹽緩沖液，染色5 min后流水沖去染液，待涂片自然干燥后鏡檢。

2.4.4 ELISA法檢測相關指標

在板條中設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL，樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，而后每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min，取出進行重復洗板5次后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光15 min，最后每孔加入終止液50 μL，15 min內在450 nm波長處測各孔的OD值。

2.4.5 Western Blot檢測CysLTR1的蛋白表達水平

混勻Western及IP細胞裂解液，取1 000 μL加入苯甲基磺酰氟(PMSF)10 μL，取100 mg肺組織置于含有PMSF的裂解液中，勻漿機粉碎組織后裂解30 min，12 000 r/min離心10 min提取蛋白。配制分離膠后配制5%濃縮膠，灌膠后插入齒梳，水平放置等待膠凝。根據所測蛋白的濃度計算25 μg蛋白的溶液體積為上樣量，置入100 ℃水浴鍋中進行蛋白變性。濃縮膠凝固后，電泳跑濃縮膠至出分離膠，按照目的蛋白分子量大小切取分離膠進行轉膜，再經TBST洗滌兩次后將膜封閉于封閉液中，經一抗、二抗孵育后將ECL發光液滴于PVDF膜上，使發光液與蛋白充分反應。

2.4.6 RT-PCR檢測CysLTR1的基因表達水平

取100 mg肺組織加入裂解液中充分勻漿，加入0.2 mL氯仿，12 000 r/min離心15 min，記錄上清液體積，加入與上清液等體積的異丙醇充分混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL預冷的75%DEPC乙醇洗滌沉淀，10 000 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀溶于40 μL 1‰DEPC水中提取RNA。將提取的RNA在20 μL反應體系中逆轉錄為cDNA。在DEPC預處理的管中加入OligodT 1 μL，6 000 r/min離心2 min，置入PCR儀，70 ℃金屬浴10 min，最后4 ℃直到結束，依次加入5×反轉錄酶Buffer 4 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL、Rnase Inhabitor 1 μL、M-mLV 1 μL，短暫離心后置入PCR儀進行熒光定量PCR測定。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 一般狀態

空白組小鼠的毛色正常，毛質光澤柔順，動作協調，反應敏捷，呼吸順暢，正常進食飲水，二便正常，體質量增長穩定，狀態健康。其余組小鼠在霧化刺激前呼吸順暢，霧化開始后則相繼出現咳嗽喘促、呼吸頻率加快，口鼻分泌物增多等表現，甚至有腹部抽動，撓抓口鼻，咳喘劇烈等情況，模型組、模型+霧化煙草提取物組癥狀加重明顯。經藥物干預后，各組癥狀均有明顯減輕，僅少數有蜷臥懶動情況。

3.2 HE染色結果

空白組支氣管及肺泡結構正常，連續、清晰，壁無明顯增厚，極少量炎癥細胞浸潤。模型組與模型+霧化煙草提取物組支氣管周圍、黏膜層、肺泡壁和血管周圍發現較多炎癥細胞浸潤，其中EOS、MAC、LYM增多明顯；支氣管壁增厚，氣道上皮被破壞，有脫落死皮，管腔有黏液栓；基底膜形態不規則，黏膜有充血水腫現象，部分肺泡壁變薄或斷裂，間距增寬，體積明顯變小甚至萎縮，腔內有炎性細胞。藥物干預后病理變化減輕明顯，支氣管黏膜充血較少，水腫及炎性細胞浸潤有不同程度改善，分泌物明顯減少，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色(×400)

3.3 BALF中細胞的分類及計數

與空白組相比，模型組、模型+霧化煙草提取物組白細胞總數、EOS絕對計數，EOS、LYM、NEU各組所占百分比比例增多，MAC占比雖減少，但絕對計數增加明顯(P<0.05)。與模型組相比，模型+霧化煙草提取物組白細胞總數、EOS絕對計數，LYM、NEU、EOS所占百分比比例均增加，MAC所占百分比雖減少，但絕對計數增加明顯(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組、孟魯司特組與模型組、模型+霧化煙草提取物組的統計結果相比，白細胞總數、EOS絕對計數，EOS、LYM、NEU各組所占百分比比例降低(P<0.05)，MAC占比雖有所增加，但絕對計數降低(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組與孟魯司特組相比，白細胞總數、EOS絕對計數，MAC、EOS、LYM、NEU各組占比差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組BALF中白細胞總數、EOS絕對計數及細胞分類

3.4 抗支糖漿對BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、LTD4的影響

與空白組相比，其余各組IL-4、IL-5、IL-13、LTD4含量均增多，而IFN-γ含量減少(P<0.05)。與模型組相比，模型+霧化煙草提取物組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、LTD4的含量增多，IFN-γ的含量減少(P<0.05)。孟魯司特組、抗支糖漿高低劑量組與模型組、模型+霧化煙草提取物組相比，IL-4、IL-5、IL-13、LTD4的含量減少，IFN-γ的含量增多(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組與孟魯司特組的結果相比，IL-4、IL-5、IL-13、LTD4、IFN-γ含量差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、LTD4測定比較

3.5 CysLTR1蛋白表達檢測結果

模型組、模型+霧化煙草提取物組CysLTR1的蛋白表達水平，較空白組增多(P<0.05)。與模型組相比，模型+霧化煙草提取物組CysLTR1的蛋白表達水平升高(P<0.05)。孟魯司特組、抗支糖漿高低劑量組CysLTR1的蛋白表達水平較模型組、模型+霧化煙草提取物組減少(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組CysLTR1的蛋白表達水平與孟魯司特組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、圖3。

圖2 CysLTR1、β-actin的蛋白條帶圖

注：與A組比較，#P<0.05；與B組比較，*P<0.05。

3.6 CysLTR1mRNA相對表達量檢測結果

模型組、模型+霧化煙草提取物組CysLTR1 mRNA相對表達量，較空白組增多(P<0.05)。與模型組相比，模型+霧化煙草提取物組的CysLTR1的蛋白表達水平升高(P<0.05)。孟魯司特組、抗支糖漿高低劑量組CysLTR1 mRNA相對表達量較模型組、模型+霧化煙草提取物組減少(P<0.05)?？怪菨{高低劑量組CysLTR1mRNA相對表達量與孟魯司特組差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠CysLTR1mRNA相對表達量的比較

4 討論

抗支糖漿有清熱解毒、宣肺止咳、清肺化痰之功效，臨床應用十數年，療效顯著。有研究發現，抗支糖漿對兒童咳嗽變異性哮喘及小兒支氣管哮喘的治療效果良好[11-13]。

研究發現，煙草煙霧暴露已成為兒童支氣管哮喘發病的重要因素之一，此外，有研究結果表明，妊娠期婦女吸煙，也可以成為兒童與青少年哮喘發病的重要危險因素[14-16]。有研究提示，煙草煙霧能夠影響包括健康人群呼吸道的免疫系統，與多種呼吸道疾病如鼻炎、鼻竇炎及哮喘等的發生、發展密切相關[17]。煙草煙霧不僅會導致哮喘發生，還會加重哮喘癥狀，吸煙患者的癥狀較不吸煙的患者更嚴重[18]，更有研究表明，煙草煙霧暴露可能會導致哮喘患者對糖皮質激素治療不敏感[19]。因此本實驗建立煙霧哮喘模型，以模擬空氣污染時哮喘發作情況。

哮喘常由免疫異常引起，但其免疫調節機制尚不明確。Th1/Th2在人體免疫方面有著很大的作用，兩者的平衡與免疫功能關系密切，Th1/Th2失衡目前被認為是哮喘最重要的病機之一。CysLTRs通道是哮喘氣道炎癥的重要通道之一，CysLTRs通過與靶細胞上CysLTR1結合，聚集并活化炎癥細胞，增加血管滲透性及氣道黏液分泌導致哮喘，Th1/Th2失衡會導致哮喘CysLTRs介導的炎癥通路的氣道炎癥形成，二者相互影響。Th1細胞主要分泌IFN-γ，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13，其中IFN-γ與IL-4相互拮抗，可抑制IL-4mRNA的轉錄水平。氣道炎癥發生時，IL-4水平增加與IFN-γ水平減少，可反映Th1/Th2失衡。IL-4和IL-13可增強單核細胞和巨噬細胞CysLTR1的表達，并在氣管平滑肌細胞中促進CysLTR1的產生。有研究表明IFN-γ能上調支氣管上皮細胞CysLTR1及CysLTR1mRNA的表達，增強LTs對呼吸道的炎癥效應[20-22]。

實驗結果顯示，抗支糖漿可以改善霧化煙草提取物環境哮喘模型小鼠的一般狀態，降低炎性細胞數量，減少黏膜下水腫及黏液的分泌，減輕氣道炎癥，改善呼吸道高反應?？怪菨{與孟魯司特均可調節Th1/Th2免疫平衡狀態，下調CysLTR1mRNA的表達干預CysLTR1介導的哮喘CysLTs炎癥作用達到防治霧化煙草提取物環境哮喘的目的。