橄欖葉多酚提取工藝優化及對山茶籽油氧化穩定性的影響

尚方園 潘 麗 谷克仁 李雪琴

(河南工業大學，河南 鄭州 450001)

據國際橄欖油理事會統計，2020—2021年度全球橄欖油產量及消費量分別為292萬，320萬t[1]。在橄欖油生產過程中會產生大量的副產品，如：橄欖葉、橄欖渣、橄欖加工廢水等，其中橄欖葉可占橄欖油行業加工總量的5%[2-3]。為對抗病原體和昆蟲的攻擊橄欖樹會合成大量的多酚，這些多酚主要儲存在其厚實的葉子中[4]。橄欖葉的酚類成分包括裂環烯醚萜類(主要是橄欖苦苷)、類黃酮類化合物(木犀草素、芹菜素、蘆丁)和其他酚類物質(羥基酪醇、木質素、生育酚等)[5]。

提取橄欖葉中多酚物質的方法有索氏抽提法[6]、水浴回流法[6]、微波[7]和超聲波輔助萃取[8-9]等方法。課題組在試驗前期初步對比了索氏抽提、水浴回流、超聲波輔助法3種方法，其中采用水浴回流法所得橄欖葉多酚得率最高。而且水浴回流法具有溶劑可循環使用的優點，符合綠色環保，循環利用的理念，因此試驗采用水浴回流法提取橄欖葉中的多酚物質。

研究擬采用響應面法優化橄欖葉多酚的水浴回流提取工藝條件，并使用Schaal烘箱法對比添加橄欖葉多酚物質與化學合成抗氧化劑對山茶籽油氧化穩定性的影響，以期為橄欖葉多酚物質在食品工業中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

橄欖葉：阿爾波莎拉，甘肅隴南市祥宇油橄欖開發有限責任公司；

山茶籽油：河南省鯤華生物技術有限公司；

沒食子酸、福林酚：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

特丁基對苯二酚(TBHQ)、丁基羥基茴香醚(BHA)：純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；

碘化鉀：分析純，天津市福晨化學試劑廠；

硫代硫酸鈉：分析純，洛陽市化學試劑廠；

乙醇、三氯甲烷、乙醚、異丙醇、冰乙酸、無水碳酸鈉、酚酞、可溶性淀粉：分析純，天津市凱通化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司；

電子分析天平：BSA2245型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海精宏實驗設備有限公司；

水浴恒溫震蕩器：DF-101Z型，山東菏澤正虹科技儀器有限公司；

離心機：TGL-16G型，上海安亭科學儀器廠；

旋轉蒸發儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取方法 準確稱取橄欖葉粉末2.0 g于250 mL圓底燒瓶中，在一定的乙醇體積分數、料液比、浸提時間、水浴溫度下進行水浴回流提取橄欖葉多酚。

1.2.2 單因素試驗 以橄欖葉多酚得率為指標，固定料液比(m橄欖葉∶V乙醇溶液)為1∶25 (g/mL)、水浴溫度為70 ℃、浸提時間為2.4 h,考察乙醇體積分數(30%，40%，50%，60%，70%，80%)對橄欖葉多酚得率的影響；固定乙醇體積分數為50%、水浴溫度為70 ℃、浸提時間為2.4 h,考察料液比[m橄欖葉∶V乙醇溶液分別為1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50 (g/mL)]對橄欖葉多酚得率的影響；固定乙醇體積分數為50%、水浴溫度為70 ℃、料液比為1∶40 (g/mL),考察浸提時間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)對橄欖葉多酚得率的影響；固定乙醇體積分數為50%、浸提時間為1.5 h、料液比為1∶40 (g/mL),考察水浴溫度(40，50，60，70，80，90 ℃)對橄欖葉多酚得率的影響。

1.2.3 響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，選取水浴溫度、浸提時間、料液比作為所需優化參數條件，以多酚得率為響應值，通過Box-Behnken試驗優化水浴回流提取工藝條件。

1.2.4 橄欖葉多酚對山茶籽油氧化穩定性的影響

(1) 橄欖葉多酚添加量對山茶籽油氧化穩定性的影響：按照質量分數0.02%，0.04%，0.06%，0.08%將橄欖葉多酚分別溶解在裝有200 g山茶籽油的錐形瓶中，超聲5 min 充分溶解。放入烘箱(60±2) ℃中，每隔4 d取樣測定過氧化值與酸價，觀察山茶籽油在24 d內的氧化變質情況，每次測定重復3次。

(2) 橄欖葉多酚與合成抗氧化劑的抗氧化活性比較：將質量分數為0.02%的橄欖葉多酚、TBHQ及BHA，質量分數為0.01%的橄欖葉多酚與0.01% BHA、0.01% TBHQ 2種復配劑，分別溶解在裝有200 g山茶籽油的錐形瓶中，超聲5 min充分溶解。放入烘箱(60±2) ℃中，每隔4 d取樣測定過氧化值與酸價，觀察山茶籽油在24 d內的氧化變質情況，每次測定重復3次。

1.2.5 測定項目及方法

(1) 多酚含量測定：采用福林酚法[10]。以沒食子酸為基準物質繪制標準曲線，分別按式(1)計算多酚得率。

(1)

式中：

R1——多酚得率，%；

C0——橄欖葉提取液中多酚質量濃度，μg/mL；

V——粗提液的體積，mL；

N——稀釋倍數；

M0——橄欖葉粉末質量，g。

(2) 過氧化值：參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》。

(3) 酸價：參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》。

2 結果及分析

2.1 沒食子酸標準曲線的繪制

沒食子酸濃度標準曲線圖如圖1所示。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度值為橫坐標，所得沒食子酸標準曲線的標準方程為：

A=0.004 3C+0.005(R2=0.999 9)，

(2)

式中：

A——吸光度；

C——沒食子酸質量濃度，μg/mL。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數對多酚得率的影響 由圖2可知，當乙醇體積分數低于50%時，多酚得率隨乙醇體積分數的增加而增加；當乙醇體積分數為50%時，多酚得率增加到最大，為4.63%；當乙醇體積分數高于50%時，多酚得率隨之增加而減小，當乙醇體積分數增至80%時，多酚得率最低?？赡艿脑蚴牵寒斠掖俭w積分數較低時，水易于滲透植物細胞內部，使部分親水性大分子物質與乙醇溶液接觸，進而影響多酚物質的得率[11]；當乙醇體積分數較高時會造成蛋白質的變性，可能對乙醇溶液斷裂多酚物質與大分子之間結合的氫鍵有一定的影響，阻礙多酚化合物的溶解，從而降低多酚的得率[12-13]。因此，最優的乙醇體積分數為50%。

圖1 沒食子酸標準曲線

圖2 乙醇體積分數對多酚得率的影響

2.2.2 料液比對多酚得率的影響 由圖3可知，當m橄欖葉∶V乙醇溶液從1∶25 (g/mL)增加到1∶50 (g/mL)時，多酚得率呈先上升后下降的趨勢，并且m橄欖葉∶V乙醇溶液為1∶40 (g/mL)時得率值最大，為4.90%，可能的原因是：當m橄欖葉∶V乙醇溶液低于1∶40 (g/mL)時，能增大樣品與提取溶劑的接觸面積，從而使多酚物質充分地從物料中溶出；當m橄欖葉∶V乙醇溶液高于1∶40 (g/mL)時，多酚得率不增反降，是由于增大料液比的同時，也增大了其他雜質從物料中溶出的機率，從而抑制了多酚的溶出，最終導致多酚得率降低[14]。從降低成本、多酚得率等方面綜合考慮得出：選取m橄欖葉∶V乙醇溶液=1∶40 (g/mL) 為優化中心點。

2.2.3 浸提時間對多酚得率的影響 由圖4可得，隨著浸提時間的增加，多酚得率先增加后減小，當浸提時間為1.5 h時，得率最大，為5.55%，可能是由于隨著浸提時間的增加，多酚能從物料中較快地溶出；達到1.5 h后，繼續增大浸提時間，伴隨著其他雜質的不斷溶出，導致多酚物質得率降低[15]。因此，選取浸提時間1.5 h為優化中心點。

圖3 料液比對多酚得率的影響

2.2.4 水浴溫度對多酚得率的影響 由圖5可知，隨著水浴溫度的升高，多酚得率呈逐漸上升的趨勢,可能的原因是分子運動速率會隨著水浴溫度的升高而加快，物料的傳質擴散速度也就會加快，從而使多酚物質更充分的溶出[16]，但是考慮到乙醇的沸點原因，最終選取水浴溫度60，70，80 ℃進行響應面試驗。

圖4 浸提時間對多酚得率的影響

圖5 水浴溫度對多酚得率的影響

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面優化試驗方案及結果 在單因素試驗基礎上，以橄欖葉多酚得率為響應值(Y)，選取水浴溫度、浸提時間、料液比作為所需優化參數條件，進行響應面優化試驗，因素及水平見表1，試驗方案及結果見表2。

表1 響應面優化試驗因素水平表

表2 響應面試驗方案及結果

2.3.2 回歸方程擬合效果分析及響應因子顯著性分析

對表3中的響應因子進行多元回歸擬合，得到二次回歸方程：

R=5.740 0+0.188 8A-0.132 5B-0.078 8C-0.045 0AB-0.102 5AC+0.110 0BC-0.483 8A2-0.116 3B2-0.473 7C2。

(3)

表3 方差分析?

2.3.3 交互作用 由圖6(a)和圖6(b)可知，當料液比不變時，多酚得率隨水浴溫度及浸提時間的增加先升高后降低，響應曲面圖坡度平坦，等高線圖偏圓形，說明水浴溫度與浸提時間之間的交互作用較??；由圖6(c)和圖6(d)可知，當浸提時間不變時，多酚得率隨水浴溫度及料液比的增加先升高后降低，響應曲面圖坡度較陡，等高線呈橢圓形，說明水浴溫度與料液比之間的交互作用顯著；由圖6(e)和圖6(f)可知，當水浴溫度不變時，多酚得率隨浸提時間及料液比的增加先升高后降低，響應曲面圖坡度偏陡，等高線呈橢圓形，說明浸提時間與料液比之間的交互作用顯著。

圖6 因素交互作用對多酚得率影響的響應面和等高線圖

2.3.4 最優方法驗證 通過響應面試驗獲得橄欖葉多酚提取的最佳工藝條件為水浴溫度72.48 ℃、浸提時間1.145 h、液料比1∶40 (g/mL)，多酚得率為5.82%。為了便于工藝條件在實際應用中操作，將水浴溫度、浸提時間分別調整為72 ℃、1.0 h，在此基礎上，通過3次平行重復驗證實驗，得出多酚得率高達5.86%，預測偏差為0.77%，表明該模型能較好地預測多酚得率。

2.4 橄欖葉多酚對山茶籽油氧化穩定性的影響

2.4.1 橄欖葉多酚添加量對山茶籽油氧化穩定性的影響

前期試驗發現，當橄欖葉多酚質量分數低于0.02%時，橄欖葉多酚物質對山茶籽油的抗氧化效果不明顯，因此試驗中添加橄欖葉多酚物質從0.02%開始添加。由圖7可知，與空白山茶籽油相比，隨著時間的增加，添加0.02%，0.04%橄欖葉多酚均能明顯降低山茶籽油的過氧化值與酸值，說明添加0.02%，0.04%橄欖葉多酚均能明顯降低山茶籽油的氧化酸敗速度，相反添加0.06%，0.08% 橄欖葉多酚加速了山茶籽油的氧化酸敗速度，可能是過量的橄欖葉多酚具有助氧化的作用[18-19]。放置相同時間時，山茶籽油的過氧化值與酸值的大小順序為：0.08%橄欖葉多酚油樣>0.06%橄欖葉多酚油樣>空白油樣>0.04%橄欖葉多酚油樣>0.02%橄欖葉多酚油樣，說明添加0.02%橄欖葉多酚具有較好的抗氧化效果。

圖7 橄欖葉多酚對山茶籽油氧化穩定性的影響

2.4.2 橄欖葉多酚與TBHQ及BHA的協同作用對山茶籽油氧化穩定性的影響 由圖8可知，與空白山茶籽油相比，添加質量分數為0.02%的橄欖葉多酚、TBHQ、BHA均能明顯降低山茶籽油的過氧化值與酸值，其中添加0.02%橄欖葉多酚的過氧化值與酸值低于同等濃度的BHA，高于TBHQ，說明橄欖葉多酚的抗氧化效果優于BHA，次于TBHQ；與添加質量分數均為0.02%的橄欖葉多酚、TBHQ、BHA相比，隨著時間的增加，添加0.01%橄欖葉多酚+0.01% TBHQ的山茶籽油的過氧化值與酸值低于添加0.02%橄欖葉多酚的油樣，高于添加0.02% TBHQ的油樣；添加0.01%橄欖葉多酚+0.01% BHA的山茶籽油的過氧化值與酸值高于添加0.02%橄欖葉多酚的油樣，低于添加0.02% BHA的油樣，說明添加0.01%橄欖葉多酚與0.01% TBHQ、0.01%橄欖葉多酚與0.01% BHA均具有協同增效的作用，并且具有增強山茶籽油抗氧化效果的能力。

圖8 橄欖葉多酚與TBHQ及BHA的協同作用對山茶籽油的氧化穩定性的影響

3 結論

采用乙醇溶液水浴回流提取橄欖葉中的多酚，運用響應面法優化橄欖葉多酚的提取工藝條件為：乙醇體積分數50%、浸提時間1.0 h、料液比1∶40 (g/mL)、水浴溫度72 ℃，此條件下橄欖葉多酚得率為5.86%。橄欖葉多酚對山茶籽油的氧化穩定性影響研究表明：當多酚質量分數為0.02%時，橄欖葉多酚對山茶籽油具有較好的抗氧化效果；橄欖葉多酚對山茶籽油的抗氧化效果優于丁基羥基茴香醚，次于特丁基對苯二酚；橄欖葉多酚與特丁基對苯二酚及丁基羥基茴香醚具有協同增效作用。但是橄欖葉多酚中主要起抗氧化作用的活性成分及影響山茶籽油氧化穩定性的機制仍需要進一步研究。