力學性能可控的甲基丙烯酸化明膠（GelMA）人工軟骨性能及軟骨/骨表界面結合研究

申逸志 劉芳 左豐源 余丹 邵溢純 周鑫 殷義霞*

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是導致軟骨損傷的常見疾病，隨著人口老齡化的趨勢不斷加劇，骨關節炎患者日益增多，目前全球約有2.5 億人罹患骨關節炎，60 歲以后，大約9.6%的男性和18.0%的女性患有骨關節炎，給患者家庭及社會帶來了沉重的壓力與負擔[1-2]。同時，隨著運動性損傷的不斷增多，有關軟骨損傷疾病的發生率也日漸增高[3]。軟骨由于缺乏血管神經營養，一旦損傷很難自我修復[4]。目前，臨床上常用的對軟骨損傷的治療方法，如物理療法、藥物療法、關節鏡下清理術、骨軟骨移植、微骨折等治療措施多為對癥治療或替代治療，且因透明軟骨無法再生而難以獲得長期穩定的治療效果[5-6]。近年來，隨著組織工程學的發展，利用組織工程支架促進骨軟骨再生修復的研究日益受到重視[7-8]。但因為力學性能不匹配等多種原因，軟骨/骨表界面結合不牢固，極大地影響了軟骨損傷后的治療效果[9]。

本研究致力于研究組織工程軟骨支架甲基丙烯酸化明膠GelMA水凝膠材料，以獲得一種能夠承載誘導軟骨再生細胞（或因子）的支架，將其黏附于缺損軟骨處，達到促進軟骨再生的目的，為日后組織工程軟骨支架的進一步研發提供科學依據，為臨床上運用組織工程軟骨水凝膠支架實現軟骨再生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器

明膠（Gelatin，美國Sigma-Aldrich 公司）、甲基丙烯酸酐（Methacrylic anhydride，美國Sigma-Aldrich 公司）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS，美國Hyclone 公司）、光引發劑Irgacure2959（上海邁瑞爾化學技術有限公司）、CCK-8 試劑盒（廣州賽國生物科技有限公司）、活/死細胞染色試劑盒（上海聯邁生物工程有限公司）、TCP人工仿生骨（武漢華威生物材料工程開發公司）、電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）、恒溫磁力攪拌器（DF-101S型，鞏義市予華儀器有限公司）、倒置顯微鏡（上海光學儀器廠）、移液槍（上海大龍設備有限公司）、紫外光源（GHS-LFLG365，深圳光華士科技有限公司）、三維光學顯微鏡（KH-1000，日本HIROX 公司）、美特斯力學性能試驗機（5967，美國英斯特朗公司）、KQ2200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 甲基丙烯酸酯明膠（GelMA）的合成與GelMA水凝膠的制備

依據Van Den Bulcke 等[10]提出的方法，采用甲基丙烯酸化在明膠上引入雙鍵制得GelMA。取適量凍干后的海綿狀GelMA前體，溶解在含有1%（w/v）光引發劑的PBS中，配置成10%（w/v）的GelMA溶液，用移液槍轉移至直徑為10 mm、高為3 mm的圓柱狀模具中，分別于1、2、3 min紫外光照（UV）下光交聯后制備GelMA水凝膠樣品[11]（見圖1）。

圖1 人工軟骨材料制備及實驗示意圖

1.3 GelMA水凝膠的力學性能分析

按照1.2步驟制得的水凝膠樣品，使用美特斯力學性能試驗機進行拉伸性能測試，在室溫下以0.01 N/s 的速度對樣品進行測試。

1.4 掃描電子顯微鏡（SEM）表征

按照1.2步驟制得的水凝膠樣品，凍干后，對水凝膠樣品噴金，用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察其表面形貌。運用Image J軟件對其孔徑大小和孔隙率進行分析。

1.5 水凝膠的溶脹性和降解率分析

按照1.2步驟制得不同紫外光照時間（1、2、3、4、5 min）光交聯下直徑為10 mm、高為3 mm 的圓柱狀水凝膠樣品，分別測量凍干后的GelMA 水凝膠的干重，記為Wd。將凍干的樣品分別浸泡在37℃的PBS 中，分別在2、4、6、8、10、12 h 時取出水凝膠，稱重記為Ws，計算溶脹率S。另外將凍干后的樣品浸泡在37℃降解酶溶液（20 U/mL）中，于特定時間取出后冷凍干燥，稱重記為Wr，計算降解率C。每組測定3個平行樣本，取平均值。

溶脹率（S）=（Ws-Wd）/Wd×100%

降解率（C）=（Wd-Wr）/Wd×100%

1.6 GelMA水凝膠的黏附性能

將制備而成的直徑為10 mm，高為1 mm，UV 1 min，10%（w/v）的圓柱狀GelMA 水凝膠黏附于TCP 人工仿生骨上，定性評估其黏附性能。

使用KQ2200DE型數控超聲波清洗器分別對直徑10 mm，高為1 mm和0.1 mm的兩組黏附于TCP人工仿生骨表面的水凝膠樣品進行超聲分散處理，將樣本浸泡于生理鹽水中，時間60 min、功率99%、溫度控制在35 ～40℃，待其自然干燥后，用三維立體光學顯微鏡及掃描電鏡觀察其表界面結合情況。

分別取120 μL 10%GelMA 溶液采取滴加/吸附的方式到d=10 mm，h=5 mm 的立方體仿生骨材料上，UV 1 min，對其進行超聲分散處理，室溫干燥24 h后，使用刀片將其從中間切開，用游標卡尺分別測得兩種操作方式下GelMA溶液的浸潤深度；噴金后，用SEM觀察切面結合的表面形貌。每組3個重復樣本。

1.7 CCK-8細胞增殖實驗

骨髓間充質干細胞分別接種至培養基（對照組）與UV 1 min 樣品中（實驗組）培養1、3、5、7 d 后，加入CCK-8 試劑與培養基以1∶9 比例配置的工作液0.5 mL，37℃下孵育2 h，取100 μL移入96孔板中，在450 nm測定吸光度（A值）。每組5個平行樣本。然后根據如下公式計算細胞的相對增殖率（relative proliferation rate，RGR）：

相對增殖率（RGR）=（A/A0）×100%

其中，A是實驗組吸光度，A0是對照組吸光度。

1.8 Live/Dead染色觀察

選用24孔板，將密度為1.0×104cells/mL骨髓間充質干細胞細胞懸液，每孔加入200 μL。置于37℃、5%CO2孵箱中培養24 h 后，棄去原培養基，用PBS 清洗3 次后分別加入培養基（對照組）和10%GelMA（實驗組），放置孵箱內分別培養1、3 d，取出進行Live/Dead染色。測試前分別事先配好活/死細胞染液，先用活細胞染液進行染色，培養20 min后，再用死細胞染液進行染色，培養5 min后，即可取出拍照。利用熒光顯微鏡進行觀察，拍照記錄活/死細胞分布。

1.9 統計學方法

應用Graph Prism 軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較用Student'st檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GelMA水凝膠的力學性能

GelMA 水凝膠的拉伸性能如圖2 所示?？梢钥闯?，隨著UV的延長，材料的彈性模量變大，拉伸性能變強。

圖2 A.1 min UV GelMA水凝膠的拉伸模量；B.2 min UV GelMA水凝膠的拉伸模量；C.3 min UV GelMA水凝膠的拉伸模量

2.2 掃描電子顯微鏡（SEM）表征

不同UV 水凝膠樣品凍干后的表面形貌SEM 圖如圖3A-C所示。根據此SEM圖，分別計算孔徑大小和孔隙率，如圖3D、3E 所示。UV 1 min 樣品平均孔徑為（110.25±6.51）μm，孔隙率為（45.24±2.78）%；UV 2 min 樣品平均孔徑為（80.42±6.28） μm，孔隙率為（37.79±2.63）%。UV 1 min樣品平均孔徑大于UV 2 min樣品平均孔徑，差異有統計學意義（P＜0.05）。UV 3 min 樣品平均孔徑為（75.74±5.59）μm，孔隙率為（34.96±2.82）%，UV 1 min樣品平均孔徑大于UV 3 min 樣品平均孔徑（P＜0.05），UV 2 min 樣品平均孔徑小于UV 3 min 樣品平均孔徑（P＞0.05）?？梢钥闯?，隨著紫外光照時間的增加，GelMA水凝膠的孔隙率相對降低，孔的數目有減小的趨勢。

圖3 A.1 min UV GelMA水凝膠的截面SEM圖；B.2 min UV GelMA水凝膠的截面SEM圖；C.3 min UV GelMA水凝膠的截面SEM圖；D.三種UV下GelMA水凝膠的孔徑大??；E.三種UV下GelMA水凝膠的孔隙率

2.3 GelMA水凝膠的溶脹性和降解率

GelMA水凝膠的溶脹性能測試結果如圖4A、4B所示?？梢钥闯?，水凝膠在2 h 后的平衡溶脹比基本穩定，其中UV為1 min組別的水凝膠樣品在12 h時的平衡溶脹比數值最大為（148.43±3.84）%，與其他組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨著光照時間的增加，GelMA 水凝膠的溶脹速率和平衡溶脹比都會減小，說明其溶脹能力減小。

GelMA 水凝膠的降解性能結果如圖4C 所示。結果顯示，水凝膠前7 d的降解速率最快，之后趨于平緩，其中UV為1 min組別的水凝膠樣品在28 d失重率（17.40±2.38）wt%。同時，隨著光照時間的增長，最終水凝膠的失重率越高，最高達（42.8±1.83）wt%。

圖4 A.各組GelMA水凝膠的平衡溶脹比隨時間變化曲線；B.12 h時各組GelMA水凝膠的平衡溶脹比；C.各組GelMA水凝膠的失重率隨時間變化曲線

2.4 GelMA水凝膠軟骨材料與骨修復材料的表界面結合

定性觀察GelMA水凝膠黏附性能如圖5所示?？梢钥闯?，制備的GelMA水凝膠可以較好地黏附于TCP人工仿生骨、橡膠、人皮膚表面，而無需使用其他黏合劑。

超聲分散處理后GelMA水凝膠三維立體光學顯微鏡觀察結果如圖6 所示，SEM 結果如圖7 所示。通過三維立體顯微鏡觀察發現，超聲分散后，GelMA水凝膠仍黏附于仿生骨表面，未見明顯脫落。SEM觀察下，GelMA水凝膠形成膜樣結構與TCP人工仿生骨緊密黏附在一起，超聲分散對TCP 人工仿生骨的結構不會有明顯的破壞，不會導致GelMA水凝膠從TCP人工仿生骨表面脫落。

圖6 超聲分散前后，空白對照組、高為1 mm組、高為0.1 mm組各組三維立體光學顯微鏡觀察示意圖

圖7 超聲分散前后，空白對照組、高為1 mm組、高為0.1 mm組各組TCP人工仿生骨與GelMA結合面的SEM圖

采取滴加方式使GelMA 與仿生骨結合的切面SEM 結果如圖8A、8B 所示；采用吸附方式使GelMA 與仿生骨結合的切面SEM結果如圖8C、8D所示。GelMA浸潤仿生骨的深度界限大致清晰，兩種試驗方式下所觀察到的浸潤情況無明顯的差異性，SEM下所觀察到填充滿仿生骨孔樣結構的微小顆粒狀物為切開操作過程中，仿生骨磨損所掉落下來的白色粉末狀物質。

圖8 A.滴加方式下GelMA與TCP人工仿生骨結合表界面切面SEM觀察圖（×30）；B.滴加方式下GelMA與TCP人工仿生骨結合表界面切面SEM觀察圖（×100）；C.吸附方式下GelMA與TCP人工仿生骨結合表界面切面SEM觀察圖（×30）；D.吸附方式下GelMA與TCP人工仿生骨結合表界面切面SEM觀察圖（×100）

滴加方式用游標卡尺測得大致浸潤深度（2.06±0.08）mm；吸附方式用游標卡尺測得大致浸潤深度（2.03±0.09）mm。兩種試驗方式的平均浸潤深度的相近，無統計學差異性（P＞0.05）?？梢哉J為，滴加或吸附的試驗方式對GelMA與仿生骨的結合無影響。

2.5 樣本內細胞增殖評估

CCK-8實驗結果如圖9所示，UV 1 min GelMA水凝膠浸提液的骨髓間充質干細胞在1、3、5和7 d的相對增殖率分別為95.37%、95.98%、98.05%和98.77%。

圖9 培養不同時間點兩組樣本內的細胞增殖

2.6 細胞Live/Dead染色結果

共培養1 d后Live/Dead染色結果如圖10所示。對照組可見紅色細胞（死細胞）數量明顯多于實驗組，細胞形態正常、包膜完整。10%GelMA對骨髓間充質干細胞無明顯抑制作用。

圖10 骨髓間充質干細胞在10%GelMA培養1d時的Live/Dead染色（綠色：活細胞；紅色：死細胞）

3 討論

骨關節炎（OA）和創傷帶來的軟骨損傷都面臨著軟骨缺損無法再生修復的問題，只有軟骨再生才是治療上述疾病的具有確切療效的方法[12-13]。眾多學者從組織工程學入手，已獲得了一定的研究成果與結論。但迄今為止，尚未發現性能理想，并運用于臨床的軟骨支架。

明膠是膠原蛋白部分水解而來的產物，是一種天然的高分子材料，具有良好的生物相容性、生物降解性和溫敏性，但純明膠水凝膠存在著熱穩定性差與力學穩定性差等問題[14-15]。故將其采用光交聯的方式與甲基丙烯酸酐結合，能夠提高其理化性能，使其更適合應用于軟骨支架[16]。明膠與官能團結合后可通過酶促反應或光反應共價交聯，相較于酶促交聯，光交聯更易于控制，反應條件較溫和，可以影響預期強度，降解率和相容性[17-18]。同時，光交聯的操作簡便且對環境友好，可將光敏性的材料直接在病損位置原位交聯，通過改變光交聯反應條件，可以調控GelMA的多孔結構，使其孔徑大小和密度適合于凝膠內的營養物質、氧氣和代謝產物的輸送[19]。路冬冬等[20]使用紫外光交聯制備出負載BMSCs 的GelMA 水凝膠支架能夠產生較多的骨基質，有效重現軟骨下骨的骨小梁結構，促進軟骨下骨的修復，也能夠有效形成軟骨樣組織來填充軟骨缺損。

本實驗通過紫外光交聯的方法，優化配比，對材料的力學性能進行了可控性探索，實驗顯示：紫外光照1 min交聯的10%（w/v）GelMA 水凝膠其孔隙大?。?10.25±6.51）μm，孔隙率（45.24±2.78）%；12 h時的平衡溶脹比達（148.43±3.84）%；28 d 失重率（17.40±2.38）wt%。其吸水速率和平衡溶脹比最佳，降解速快，拉伸性能與天然軟骨結構類似，具有良好的生物相容性，與骨修復材料力學匹配。與其他機械性能較差、降解速率過快、穩定性不足天然高分子材料（如膠原蛋白、透明質酸、殼聚糖），以及難降解、細胞難黏附的人工材料（如聚乙二醇等）相比，本實驗所選擇的GelMA 水凝膠具有良好的力學性能，合適的孔隙大小及孔隙率，適宜的平衡溶脹比及生物降解率。Costantini 等[21]運用3D 打印技術制造了類細胞外基質的GelMA 水凝膠支架負載BMSCs，發現BMSCs 的成骨、成軟骨分化能力增強。與文獻的結果類似，本研究發現該水凝膠能促骨髓間充質干細胞增殖，且活/死染色實驗顯示，GelMA水凝膠中的細胞存活率較高，表明其具有良好的生物相容性。因此，該水凝膠在軟骨缺損修復方面有潛在的臨床應用價值。

本實驗還通過與骨修復材料表界面的研究顯示，10%（w/v）GelMA 水凝膠制備的人工軟骨材料，經過1 min 紫外交聯，與骨修復材料結合牢固，具有較好的表界面穩定性能。該材料運用于軟骨損傷患者時，將能夠承受患者日?；顒铀鶐淼臋C械沖擊力，構建利于關節軟骨物質運輸的三維立體微環境，并在軟骨/骨相關修復過程中與骨組織附著良好，能夠促進軟骨修復，為軟骨/骨修復中的界面和促進修復等問題提供了新方法和新思路。