超聲波-酶輔助提取黑布林果皮色素及其抗氧化性研究

高紅芳

渭南職業技術學院（渭南 714026）

食用色素作為一種添加劑，在豐富食品顏色、增強食欲、刺激消費者購買欲等方面起著重要作用。食用色素主要分為合成色素和天然色素，大多數合成色素會對人體健康和公共健康產生不利影響[1]，因此，利用動植物資源開發天然色素成為重要研究方向。

植物中色素的提取是一種涉及傳質的固液浸出過程。由于色素與植物細胞膜緊密結合在一起，傳統溶劑浸漬提取法非常耗時，而且需要相對大量的溶劑。因此，在傳統溶劑提取的基礎上，通過一些先進的技術手段更能對色素進行有效提取，如連續加壓法[2]、超臨界流體萃取法[3]、微波輔助提取法[4]等。與這些提取技術相比，超聲輔助提取技術在實際操作中成本低、操作簡單，被廣泛應用于色素提取[5]。張曉旭等[6]研究結果表明，與傳統有機溶液浸提法相比，超聲輔助提取法可以明顯提高青花椒色素提取率。劉穎等[7]研究發現，相比傳統浸提法，超聲輔助提取法從黃花菜中提取葉綠素所用時間更短。其原因在于：一方面，超聲波因其特有的空化作用，可使細胞組織變性，造成細胞壁快速破裂，有利于色素溶出；另一方面，超聲波產生一種力學效應，可增加溶劑對原料的滲透及提取溶劑與物料間的接觸面積，大幅提高提取效率[8]。

黑布林，也稱美國黑李，是我國近年引進的豐產優質品種，果大核小，果皮呈紫紅色，色素極其豐富，是良好的天然色素資源。黑布林果皮色素提取研究較少，僅用傳統溶劑浸提法來提取[9]。試驗在傳統溶劑浸提基礎上，采用超聲-酶輔助技術提取黑布林果皮色素，對提取工藝進行優化，評價其抗氧化特性，并對色素在果凍中的應用特性進行初步探討，為黑布林果皮色素的生產及在食品行業中的進一步開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑布林（渭南馬寨村農戶果園）；纖維素酶（南寧龐博生物工程有限公司）；果凍粉（上海楓未實業有限公司）；1, 1-二苯基-2-3硝基苯肼（DPPH，源葉生物科技有限公司）；溴化鉀：光譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；抗壞血酸（國藥集團化學試劑有限公司）。

TS-1000型電熱鼓風干燥箱（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HHW-2KV-660水浴鍋（上海南榮實驗室設備有限公司）；KS-500DE型數控超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）；UV-Power紫外可見分光光度計（北京萊博泰科儀器股份有限公司）；80-2型離心機（上海坤誠科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑布林果皮色素提取工藝流程及操作要點

1.2.1.1 工藝流程

黑布林→清洗→取皮→烘干→粉碎→提取→離心→色素液→真空旋轉濃縮→低溫干燥

1.2.1.2 操作要點

選取顏色均一、新鮮的黑布林，取果皮于50 ℃鼓風干燥箱內干燥24 h，用粉碎機粉碎，過0.180 mm（80目）孔徑篩，未能過篩的較大顆粒2次粉碎后密封放置4 ℃密封保存。準確稱取0.5 g粉碎的黑布林果皮置于錐形瓶中，按照料液比1∶100 g/mL加入超純水，加入纖維素酶，酶解30 min，在超聲波條件下進行提取。將粗提液倒入試管中，經4 000 r/min離心10 min后，吸取上清液，等體積稀釋，測定在500 nm處的吸光度。

1.2.2 黑布林果皮色素溶液特征光譜的確定

取黑布林果皮色素提取液，適當稀釋后用紫外可見分光光度計進行掃描，確定其最大吸收峰的位置。

1.2.3 黑布林果皮色素提取條件的選擇

1.2.3.1 單因素試驗

參照1.2.1.2小節操作要點，以吸光度為評價指標，分別考察酶添加量（0，0.2%，0.4%，0.6%和1%）、超聲功率（50，60，70，80，90和100 W）及超聲時間（20，30，40，50和60 min）對黑布林果皮色素提取液吸光度的影響。

1.2.3.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以吸光度為指標，以酶添加量、超聲功率和超聲時間為考察因素，進行L9(33)正交試驗，試驗設計如表1所示，確定最佳提取工藝。

表1 正交試驗因素和水平

1.2.4 提取率測定[10]

準確稱取一定量干燥后的黑布林果皮粉末（m0），按照1.2.3.2小節確定的最佳提取工藝提取，離心收集濾液后，將濾液置于旋轉蒸發儀，蒸發至提取液少量時即轉入已知質量的燒杯（m1），將燒杯烘干至恒重，稱量燒杯和提取物質量（m2），按式（1）計算提取率。

1.2.5 黑布林果皮色素紅外光譜特征分析

黑布林果皮色素紅外光譜特征分析采用溴化鉀壓片法。將適量黑布林果皮色素粉末與干燥后的溴化鉀粉末混合后放入瑪瑙缽中，充分磨細，在壓片機上壓片。在400～4 000 cm-1范圍內測其紅外吸收光譜，并進行分析。

1.2.6 黑布林果皮色素對DPPH·的清除作用[11]

取2 mL不同濃度的色素溶液及抗壞血酸溶液，分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液（無水乙醇配制），避光反應30 min，測定其在波長517 nm處的吸光度Ai，以無水乙醇代替DPPH·作為對照組，測定其吸光度Aj，并用超純水代替色素溶液作空白組，測定其吸光度A0，按式（2）計算清除率。

1.2.7 數據處理

為保證試驗精確度，每個水平進行3組平行試驗，結果取平均值。采用SPSS 17.0統計分析軟件進行方差分析，數據以均值±標準差表示。采用Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 黑布林果皮色素最大吸收波長確定

提取的黑布林果皮色素經過濾、離心、稀釋之后，在400～700 nm的掃描光譜如圖1所示。試驗提取的黑布林果皮色素最大吸收峰在500 nm處，與詹嘉紅等[12]報道的黑布林果皮色素在510 nm處有最大吸收峰存在一定差異：一方面可能是由于所用原料不同，另一方面由于提取溶劑不同。

圖1 黑布林果皮色素的吸收光譜

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶添加量對黑布林果皮色素提取的影響

由圖2可知，纖維素酶添加量0～0.4%時，隨著纖維素酶添加量增加，黑布林果皮色素提取液吸光度增加，且高于未添加纖維素酶時的吸光度。這是由于纖維素酶水解植物細胞壁，改變細胞壁的通透性，使組織細胞內含物與溶劑充分接觸，增強了提取效果[13]。纖維素酶添加量0.4%時，吸光度達到最高，酶添加量繼續增加時，吸光度下降，可能是由于底物濃度與纖維素酶量相比過低，使纖維素酶受到抑制，從而降低色素的提取效果[14]。

圖2 纖維素酶添加量對黑布林果皮色素提取的影響

2.2.2 超聲功率對黑布林果皮色素提取的影響

超聲功率對色素提取效果的影響如圖3所示。超聲功率50～80 W時，隨著超聲功率增加，色素吸光度增加。超聲過程中產生的機械效應會破壞細胞組織結構及狀態。功率較小時，細胞破碎不完全，果皮色素未完全釋放，隨功率增大，超聲波的空化效應和機械波動效應對細胞壁破壞作用增強，色素易析出，且超聲的空化作用可增大分子的運動速度、增大提取溶劑的穿透力，使溶劑快速進入細胞組織，促進色素提取[15]。超聲功率80 W時，色素吸光度達到最大值。隨著超聲功率繼續增大，色素提取率下降，后趨于平穩。前人研究甜菜色素提取時中也發現同樣規律，超聲功率83 W時，甜菜色素的提取率最大，隨著提取功率不斷增加，提取率下降[16]。這可能是由于功率過大時，溶劑中的氣泡在空化過程中不斷增加，過多的能量會以熱的形式散發，引起色素降解[17]。

圖3 超聲功率對黑布林果皮色素提取的影響

2.2.3 超聲時間對黑布林果皮色素提取的影響

提取時間對色素提取效果的影響如圖4所示。超聲時間10～50 min時，隨著超聲時間的增加，色素吸光度隨之增大。超聲時間超過50 min時，吸光度稍有下降。超聲提取能在較短時間內迅速將目標物提取出來，在超聲波輔助提取色素的過程中，超聲時間過長色素易發生降解且結構被破壞，導致吸光度降低。另外，超聲時間過長，果皮色素易氧化分解，提取效果下降[18]。

圖4 超聲時間對黑布林果皮色素提取的影響

2.3 正交試驗結果與分析

由表2中極差R值可知，黑布林果皮色素提取3個因素對提取效果存在不同程度影響，影響大小依次為C（超聲時間）＞B（超聲功率）＞A（酶添加量）?？梢?，最重要的影響因素是超聲時間。由R值分析結果可知，黑布林果皮色素提取的最佳方案為A3B2C2。由于該組試驗并未在正交試驗表中，因此進行驗證實驗，得到吸光度值為0.572，略低于正交表中A1B2C2組合。因此，選擇最佳的工藝條件為酶添加量0.2%、超聲功率80 W、超聲時間50 min。

表2 正交試驗結果

2.4 最優工藝條件驗證試驗

為保證試驗的準確性，在A1B2C2的工藝條件下進行3組重復試驗，黑布林果皮色素的平均吸光度為0.580，與正交試驗結果接近，證明正交試驗結果可信。在該工藝條件下得到的黑布林果皮色素提取率為35.65%。

2.5 黑布林果皮色素紅外光譜分析

黑布林果皮色素的紅外光譜如圖5所示。在3 411 cm-1處存在較強吸收峰，屬于羥基的重要吸收峰，是由于O—H伸縮振動引起的，說明結構中有醇類、酚類或者有機酸。指紋區1 220 cm-1與1 080 cm-1分別為酚羥基及醇羥基C—O的伸縮振動吸收峰。1 718 cm-1為雜環中羰基C＝O的伸縮振動峰。1 624 cm-1為C＝C的變形振動吸收峰。1 402 cm-1為芳環的特征吸收峰，在867，777和815 cm-1出現一些弱吸收峰，主要是苯環取代面上C—H面外彎曲振動的吸收峰，說明存在各種類型取代結構芳環[19]。該色素存在的羰基、酚羥基、芳香環等結構對應花青素類物質的基本官能團，初步推測提取的黑布林果皮色素屬于花青素類物質[20]。

圖5 黑布林果皮色素紅外光譜圖

2.6 黑布林果皮色素DPPH·清除能力

不同濃度黑布林果皮色素對DPPH·的清除率如圖6所示。黑布林果皮色素對DPPH·有一定的清除能力，且隨著色素濃度提高，清除率增強。將黑布林果皮色素與VC對DPPH·清除能力進行比較，2 mg/mL黑布林果皮色素自由基清除率為80.8%，0.08 mg/mL VC自由基清除率為77.5%，可見，黑布林果皮色素DPPH·清除率相比VC較弱。但與從植物中提取的紅藍草紅色素（質量濃度30 mg/mL，DPPH·清除率＜ 60%）相比，黑布林果皮色素表現出較強的DPPH·清除率[21]，這可能是由于黑布林果皮色素為花青素類物質。

圖6 黑布林果皮色素與維生素C對DPPH·的清除能力

2.7 在果凍中的應用研究

將試驗提取的黑布林果皮色素用于果凍的制作，果凍透亮，色澤均一，如圖7所示?？赏ㄟ^改變黑布林果皮色素添加量對其呈現的顏色進行調整，色素添加量不同時，果凍呈現不同顏色。色素添加量0.25 mg/mL時，果凍呈水蜜桃粉色；添加量0.5 mg/mL時，果凍呈玫紅色。該色素屬天然植物色素，安全性高，有良好的水溶性，在不引起果凍風味、口感和質地改變的同時，可賦予果凍誘人的色澤，具有開發為天然食品色素的潛力。

圖7 黑布林果皮色素對果凍的著色效果

3 結論

試驗以水為溶劑，采用纖維素酶輔助超聲波法從黑布林果皮中提取天然色素，確定黑布林果皮色素的最佳提取條件：纖維素酶添加量0.2%、超聲功率80 W、超聲時間50 min。按此條件提取的黑布林果皮色素的提取率為35.65%。通過紅外光譜分析，推測該色素屬花青素類物質，對DPPH·具有一定的清除能力。將該色素應用于果凍著色，不同色素添加量可使果凍呈現不同顏色，在實際生產中可根據需要選擇合適的添加量對食品顏色進行調配。試驗結果為黑布林果皮色素的工業化生產與應用提供一定理論支撐，能更好滿足食品加工行業對天然色素的需求。試驗只通過紅外光譜分析黑布林果皮色素中可能存在的基團，后續研究尚需采用合適的方法對黑布林果皮色素進行進一步分離和結構確認。