不同產地黃觀音烏龍茶的廣泛靶向代謝組學分析

邵淑賢， 陳瀟敏， 林燕萍， 方德音， 蔡捷英，王金煥， 林馨穎， 金 珊， 葉乃興*

（1.福建農林大學 園藝學院，福建 福州 350002；2.武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300；3.云霄縣茶葉科學研究所，福建 云霄 363300）

烏龍茶作為我國第3大茶類，主要產區集中于我國閩北地區、閩南地區、廣東及臺灣地區等地，如武夷巖茶、鐵觀音、鳳凰單叢和東方美人等[1]。由于茶樹品種、產地和加工工藝等諸多因素，各種烏龍茶形成了獨特的滋味品質[2-3]。滋味作為評價茶葉品質的重要因素之一，受到茶湯中的氨基酸、黃酮類、茶多酚和生物堿等呈味物質的綜合影響[4]。茶葉具有明顯的地域特色和品質特征，其市場認可度和消費者喜愛程度也各有不同，近年來茶葉區域品牌建設越來越受到人們重視，因此對不同產地茶葉滋味品質特征的研究具有一定的研究意義和價值。

液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）的廣泛靶向代謝組學是一種高通量檢測與數據多元統計分析相結合的快速、可靠的方法，可用于檢測經濟作物，如枸杞[5]、枇杷[6]、柚子[7]和茶[8]等的多種代謝物。近年來，基于代謝組學對茶葉化學品質特征的相關研究也成為茶葉研究熱點之一，楊晨等采用UHPLC-QTOF/MS對不同產地普洱生茶的非揮發性代謝物進行分析，發現不同產地普洱生茶的化學成分具有明顯產地特征[9]。邱曉紅等利用兒茶素組分和生物堿含量來區分福建不同產地水仙茶，認為福建水仙茶滋味特征的形成與產地密切相關[10]。林潔鑫等采用UPLC-MS/MS對兩地紅茶的代謝產物進行比較，發現兩地紅茶具有不同的呈味特點[11]。前人這些研究闡明了不同產地、品種茶間的品質差異，但多從產地和品種的角度解釋差異，而等級對茶葉品質的影響不可忽視[12-13]。目前，對于烏龍茶品質和等級與產地之間的關系鮮有報道。

黃觀音是福建省農業科學院茶葉研究所從鐵觀音（母本）和黃旦（父本）人工雜交F1代中單株選育成的高香型國家級優良茶樹品種[14]。黃觀音是福建省的主栽品種，并在全國廣泛種植。以黃觀音鮮葉為原料制成的烏龍茶品質優異，滋味醇厚甘爽，香氣特征趨向父本，具有“通天香”[14]。近年來，黃觀音在云霄、武夷山等地大面積種植，云霄黃觀音品質優異，獨具“花香蜜韻”，云霄縣已將“云霄黃觀音”打造成茶葉公共品牌。武夷山作為烏龍茶的發源地，在茶葉發展史上具有重要地位[15]。因此，為更全面地了解不同產地對黃觀音烏龍茶品質的影響，選取云霄黃觀音和武夷黃觀音烏龍茶樣品，應用廣泛靶向代謝組學技術對其主要呈味物質進行比較分析，探究兩地黃觀音烏龍茶的品質差異。

1材 料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品為2020年春季黃觀音烏龍茶。云霄黃觀音烏龍茶由云霄縣茶葉科學研究所提供（10份市售代表性茶樣），武夷黃觀音烏龍茶由武夷學院茶與食品學院提供（10份市售代表性茶樣）。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：上海默克化工技術有限公司產品；色譜純標準品：BioBioPha公司和Sigma-Aldrich公司產品。

1.2 實驗儀器

5424R 2 Eppendorf離心機：艾本德中國有限公司產品；MM 400研磨機：德國Retsch公司產品；Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A超高效液相色譜：日本島津公司產品；Applied Biosystems 6500 QTRAP三重四級桿質譜儀：美國賽默飛世爾科技公司產品；SB-C18色譜柱：美國安捷倫公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 茶葉感官審評方法由5位國家一級評茶師作為審評專家，根據GB/T23776—2018《茶葉感官審評方法》中的烏龍茶蓋碗審評法進行審評，以標準中5項因子的綜合評分作為樣品等級的判定依據，對樣品的外形、香氣、湯色、滋味和葉底進行評價。從20個黃觀音烏龍茶樣品中篩選出具有兩地代表性的茶樣，綜合評分大于90分的樣品評定為一級，低于90分且高于80分的樣品判定為二級。

1.3.2 代謝組學測定方法

1）樣品前處理 利用研磨儀將茶樣研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀，稱取0.1 g茶粉溶解于1.2 mL 70%（體積分數）甲醇提取液中；提取液每30 min渦旋一次，持續30 s，渦旋6次以提高提取率；渦旋后將樣品置于4℃冰箱，過夜；離心（12000 r/min、10 min）后吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于后續LC-MS/MS分析。

2）LC-MS/MS分析條件 利用超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）和串聯質譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）數據采集儀器系統對物質進行鑒定。

色譜條件：色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：A相為超純水（加入體積分數0.1%的甲酸），B相為乙腈（加入體積分數0.1%的甲酸）；洗脫梯度：0 min，B相體積分數為5%；9 min內B相體積分數線性增加到95%，并在95%維持1 min；10～11.1 min，B相體積分數降為5%，并以5%平衡至14 min；柱溫：40℃；進樣量：4 μL；流量：0.35 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），溫度550℃；正離子模式質譜電壓5500 V，負離子模式質譜電壓-4500 V；離子源氣體I（GS I）、氣體II（GS II）和簾氣 （CUR）分 別 設 置 為0.3447、0.4137、0.1723 MPa，碰撞誘導電離（CAD）參數設置為高；碰撞氣體（氮氣）設置為中等，三重四級桿（triple quadrupole，QQQ）掃描使用MRM模式；在QQQ中，每個離子對根據優化的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）進行掃描檢測。

1.4 數據分析

參考Wang等的方法[16]，基于碎片模式、保留時間、m/z與邁維 （武漢）生物技術有限公司自建MVDB V2.0數據庫和公共數據庫的標準對物質進行定性，代謝物定量利用多反應監測模式分析。獲得不同樣本的代謝物質譜后，對物質質譜峰的峰面積進行積分，同時對不同樣品中同一代謝物的質譜峰進行積分校正，利用軟件Analyst 1.6.3處理質譜數據。對鑒定的代謝物進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析 （orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）?；贠PLS-DA模型獲得的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）進行評分，根據VIP≥1、Fold Change≥2或Fold Change≤0.5篩選出的代謝物定義為差異代謝物（significant changed metabolites，SCMs）。利用KEGG代謝庫將鑒定出的差異代謝物進行比對并注釋[17]，進行相關代謝通路的分析。

2 結果與分析

2.1 云霄黃觀音與武夷黃觀音感官品質分析

對不同產地黃觀音烏龍茶的外形、湯色、香氣、滋味和葉底進行感官審評，一級綜合評分均高于90分，二級綜合評分均高于80分，審評結果見表1。結果表明，云霄黃觀音烏龍茶滋味多以濃醇為主，武夷黃觀音烏龍茶滋味多以濃厚為主。根據兩地黃觀音烏龍茶的感官審評滋味特點和品質得分，確定待測樣品為YX1、YX2、WY1和WY2（見圖1）。樣品中，兩地一級黃觀音烏龍茶滋味均具有鮮味和花蜜香特征。

圖1 不同產地黃觀音烏龍茶的外形、湯色和葉底Fig.1 Shape,soup and infused leaves of Huang Guanyin oolong tea from different areas

表1 20份黃觀音烏龍茶感官審評結果Table 1 Sensory evaluation results of 20 samples of Huang Guanyin oolong tea from different areas

2.2 不同產地黃觀音烏龍茶廣泛靶向代謝組學分析

為研究不同產地黃觀音烏龍茶間的滋味差異，對武夷山和云霄縣各兩個等級的黃觀音烏龍茶進行廣泛靶向的LC-MS/MS代謝譜分析。共測出11類820種代謝產物，其中包括大量可能影響茶湯滋味的代謝產物，包括黃酮類、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、生物堿、有機酸以及其他初級和次級代謝產物。

2.3 不同產地黃觀音烏龍茶的相關性分析

對這些共有代謝物進行PCA發現，同等級不同產地的樣品之間被明顯地區分開來，顯著性為0.01（見圖2（a））。為消除數量對模式識別的影響，對每個代謝物的峰面積進行對數轉換，隨后進行層次聚類分析（見圖2（b）），發現兩個等級的黃觀音烏龍茶屬于不同的類群。主成分分析和聚類分析結果表明，不同產地及等級的黃觀音烏龍茶具有不同的代謝特征。

圖2 黃觀音烏龍茶代謝物的PCA圖和聚類熱圖Fig.2 PCA score plot and clustering heatmap of metabolites from Huang Guanyin oolong tea

為了鑒別出具體有哪些差異代謝物造成了分離現象，建立2組同等級不同產地黃觀音烏龍茶OPLS-DA模型，表2為模型評價參數。OPLS-DA結合正交信號矯正（OSC）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）方法，通過去除不相關的差異來篩選差異變量。在這2組模型中R2Y和Q2的值均大于0.9，說明這2組模型構建良好，該樣本預測性可靠。

表2 OPLS-DA的參數Table 2 Parameters of OPLS-DA analysis

2.4 不同產地黃觀音烏龍茶差異代謝物的分析

2.4.1 差異代謝物的篩選為了鑒定不同產地黃觀音烏龍茶差異代謝物的特點，通過OPLS-DA模型，根據VIP≥1、上調代謝物Fold Change≥2和下調代謝物Fold Change≤0.5篩選出顯著差異代謝物。鑒定出同等級的兩地黃觀音烏龍茶分別存在63種和120種差異代謝物，這些代謝物可分為不同類別，主要包括氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、酚酸類、黃酮類、萜類、鞣質、有機酸和脂質等（見圖3）。整體上不同產地的一級黃觀音烏龍茶差異代謝成分（63種）占共有代謝成分（820種）的7.68%，二級黃觀音烏龍茶差異代謝成分（120種）占共有代謝成分（820種）的14.63%，說明同等級不同產地的黃觀音烏龍茶代謝物質存在差異。

圖3 不同產地黃觀音烏龍茶差異代謝物Fig.3 Differential metabolites in Huang Guanyin oolong tea from different areas

與同等級的云霄黃觀音相比，武夷黃觀音有更多的差異代謝物呈上調趨勢，WY1有50種差異代謝產物呈上調趨勢，占兩地一級黃觀音總差異代謝物的79.37%；WY2有78種差異代謝物呈上調趨勢，占兩地二級黃觀音總差異代謝物的65.00%。

2.4.2 差異代謝物KEGG富集分析通過KEGG數據庫將差異代謝物進行通路富集分析。一級和二級黃觀音烏龍茶中鑒定出來的63種和120種顯著差異代謝物主要分布在20條代謝途徑中（見圖4）。兩地一級黃觀音差異代謝物富集程度最高的前5條通路分別是：異黃酮生物合成、黃酮類生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、單萜生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝；兩地二級黃觀音差異代謝物富集程度最高的前5條通路分別是：α-亞麻酸代謝，煙酸和煙酰胺代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，壬烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，β-丙氨酸代謝。

圖4 差異代謝物KEGG富集圖Fig.4 KEGG enrichment map of differential metabolites

兩地一級黃觀音差異代謝物在KEGG數據庫注釋的途徑中，存在7條與兩地一級黃觀音品質相關的代謝途徑（見圖4），包括17種關鍵的顯著差異代謝物（見圖5）。其中，差異代謝物富集程度最高的前5條通路中有3條通路與11種黃酮類差異代謝物相關，包括異黃酮生物合成、黃酮類生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成。柚皮素查爾酮作為黃酮類物質合成途徑中必不可少的前體物質，在武夷黃觀音中顯著上調2.81倍。柚皮素和芹菜素作為這3條代謝途徑共有的差異代謝物，在武夷黃觀音中分別顯著上調2.90倍和2.64倍。山柰酚是異黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成的共有差異代謝物，在武夷黃觀音中顯著上調2.26倍。異黃酮生物合成途徑中所注釋的差異代謝物上調倍數均在2.00倍以上，如香橙素、柚皮素查爾酮、圣草酚、山柰酚和根皮素。黃酮及黃酮醇的生物合成通路中槲皮素-3-O-桑布雙糖苷在武夷黃觀音中上調達到7.49倍，Li等研究表明槲皮素-3-O-桑布雙糖苷具有促進神經中樞興奮的作用，認為武夷黃觀音可能更具有促進興奮的作用[18]。硫是植物生長發育所需的大量營養元素之一[19]，半胱氨酸和蛋氨酸的代謝通路與含硫有機物合成相關，在這一途徑中的O-乙酰絲氨酸在云霄黃觀音中顯著上調2.79倍。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中L-天冬酰胺在武夷黃觀音中顯著上調2.39倍，γ-氨基丁酸作為這兩條代謝通路中必不可少的物質，在武夷黃觀音中顯著上調3.14倍。Liao等研究表明γ-氨基丁酸作為一種信號分子，被認為是茶樹碳氮代謝的交匯點[20]。Ren等認為γ-氨基丁酸多與類黃酮代謝中酶活性成正相關，可能作為信號分子參與黃酮類化合物代謝的調節[21]。

圖5 兩地一級黃觀音烏龍茶關鍵差異代謝物的代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways of the key differential metabolites of first-grade Huang Guanyin oolong tea from different areas

兩地二級黃觀音差異代謝物在KEGG數據庫注釋的途徑中，存在5條與兩地二級黃觀音品質相關的代謝途徑（見圖4），包括13種關鍵的顯著差異代謝物（見圖6）。其中，差異代謝物富集程度最高的前5條通路中有2條與氨基酸類物質合成相關的代謝途徑，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及β-丙氨酸代謝。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中的L-天冬酰胺、L-谷氨酸和草酰乙酸均在武夷黃觀音中顯著上調，值得注意的是，L-天冬酰胺顯著上調5.10倍。煙酸和煙酰胺代謝途徑中鑒定出5種差異代謝物，其中，具有一定保健功效的煙酸在云霄黃觀音中顯著上調2.20倍。乙醛酸和二羧酸代謝通路中鑒定出3種差異代謝物，酪胺在云霄黃觀音中顯著上調2.25倍，該物質存在于發酵茶中[22]。

圖6 兩地二級黃觀音烏龍茶關鍵差異代謝物的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathways of the key differential metabolites of second-grade Huang Guanyin oolong tea from different areas

2.4.3 主要滋味成分比較根據差異代謝物KEGG的富集通路分析結果，把研究重點放在可能對兩地黃觀音烏龍茶滋味產生影響的差異代謝物上，如黃酮類、氨基酸及其衍生物類。

在兩地一級黃觀音烏龍茶中，基于Fold Change（FC）和VIP值，鑒定出18種黃酮類差異代謝物和7種氨基酸及其衍生物類差異代謝物（見圖7（a）、7（b））。澀味是形成烏龍茶特有滋味的重要因素之一[23]，黃酮類物質對茶湯的苦澀味有一定貢獻[24]。一級武夷黃觀音中含有較豐富的黃酮醇糖苷及其前體物質，如香橙素、柚皮素、柚皮素查爾酮、圣草酚、山柰酚、根皮素、槲皮素-3-O-桑布雙糖苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷和芹菜素-7-O-蕓香糖苷等。楊梅素、槲皮素和山柰酚是茶葉中常見的黃酮醇類，其不同的苷元與糖基結合形成了不同的黃酮醇糖苷。黃酮苷類物質閾值極低，呈味特征是較柔和的澀感[4]。前人研究發現黃酮醇糖苷對咖啡因的苦味有增強作用[25]，黃酮醇糖苷類物質含量低，則滋味醇和，反之則苦澀[26]。游離氨基酸作為茶湯鮮味的主要貢獻成分，對茶葉品質有重要貢獻[27-28]。兩地一級黃觀音中L-脯氨酸、L-天冬酰胺和γ-氨基丁酸被鑒定為差異代謝物，且均在武夷黃觀音中呈上調趨勢。L-脯氨酸和L-天冬酰胺是茶葉中直接影響茶湯鮮爽度和口感的鮮味氨基酸[28-29]。γ-氨基丁酸作為茶葉中的非蛋白質游離氨基酸，對收斂性澀味有貢獻[28]。Ren等研究表明γ-氨基丁酸可能參與黃酮類化合物代謝的調節[21]。這些差異物質可能對兩地黃觀音烏龍茶的滋味形成具有一定貢獻，其中黃酮類物質可能對區分兩地一級黃觀音烏龍茶的滋味特征具有積極作用。

在兩地二級黃觀音烏龍茶中，基于FC和VIP值，鑒定出11種黃酮類差異代謝物和14種氨基酸及其衍生物類差異代謝物（見圖7（c）、7（d））。其中3種游離氨基酸被鑒定為差異代謝物，包括L-谷氨酸、L-天冬酰胺和γ-氨基丁酸，它們均在武夷黃觀音中呈上調趨勢。相比于一級黃觀音，具有鮮味特征的游離氨基酸在二級黃觀音烏龍茶中含量較低。二級武夷黃觀音中也含有較豐富的黃酮類差異代謝物，如異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、表茶黃酸-3-O-沒食子酸等，但作為黃酮醇糖苷前體物質的楊梅素，在二級云霄黃觀音中顯著上調2.58倍。兩地二級黃觀音的20條主要KEGG富集通路中沒有發現與黃酮類物質相關的代謝通路。但黃酮苷類物質閾值極低，前人研究表明黃酮苷類物質可與其他物質相互作用，從而對茶葉滋味品質產生影響[26，30]。二級黃觀音中的黃酮糖苷類物質含量更高，其可能與茶葉滋味品質呈負相關[30]。

對比不同產地及等級黃觀音烏龍茶的呈味物質發現，云霄黃觀音烏龍茶呈苦澀味的黃酮糖苷類物質含量較低，可能是其滋味具有醇和特征的原因[26]，而武夷黃觀音滋味醇厚的原因也可能是具有豐富的黃酮糖苷類和氨基酸類物質。一級黃觀音烏龍茶滋味更具鮮爽特征，可能與其含有豐富的氨基酸類物質密不可分，這與前人的研究結果一致[12]。不同產地黃觀音烏龍茶在黃酮類物質和氨基酸含量上的差異可能也與不同的加工工藝相關，Liu等研究表明隨著半發酵時間的延長，烏龍茶中黃酮醇或黃酮糖苷類物質含量有所增加[31]，氨基酸的含量在加工過程中也會發生變化[32]。

3 結語

采用UPLC-MS/MS技術，對同等級不同產地的黃觀音烏龍茶非揮發性物質進行比較分析。結果表明，不同產地黃觀音烏龍茶的非揮發性物質含量具有較大差異，呈味物質含量在分布上具有明顯的產地特征。其中，兩地一級黃觀音烏龍茶差異代謝成分（10類63種）和兩地二級黃觀音烏龍茶差異代謝成分（11類120種）分別占共有代謝成分（11類820種）的7.68%和14.63%。KEGG代謝通路分析發現，兩地一級黃觀音差異代謝物在黃酮類和氨基酸及其衍生物相關代謝通路的富集程度較高，兩地二級黃觀音差異代謝物在氨基酸及其衍生物、煙酸和煙酰胺代謝通路的富集程度較高?；贔C與VIP值，進一步篩選到與滋味品質相關的槲皮素-3-O-桑布雙糖苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-蕓香糖苷、L-脯氨酸、L-天冬酰胺和γ-氨基丁酸等代謝物，且含量在兩地一級黃觀音中的差異達到顯著水平；L-谷氨酸、L-天冬酰胺和γ-氨基丁酸等差異代謝物含量在兩地二級黃觀音中的差異達到顯著水平。通過對影響兩地同等級黃觀音烏龍茶滋味品質的代謝物進行比較，有利于彌補茶葉產地鑒別通常依賴感官判定的不足，為辨別云霄黃觀音與武夷黃觀音烏龍茶提供理論參考。由于不同產地及等級黃觀音烏龍茶的滋味品質還可能受到其他因素的影響，還需進一步控制變量并增加樣本，同時課題組在后續研究中，將結合電子鼻、電子舌和近紅外光譜等技術，為云霄黃觀音和武夷黃觀音烏龍茶的品質評定提供客觀依據。