超聲波輔助酶解山茶籽油提取工藝優化及人工神經網絡搭建

包澤偉， 林建原， 張 瑱， 于佩斕， 劉 樂

(浙江萬里學院，寧波 315100)

山茶起源于我國云貴高原，國內種植比例占全球95%。山茶樹大致分布于亞洲東部及東南部地區[1]，多見于山區丘陵地帶。我國對于油茶種植的政策支持力度持續增大，目前種植面積約為6.3×107萬畝，高產油茶林高達1.4×107萬畝，年產量約為6.3×105t[2-4]。山茶籽油中主要成分為多不飽和脂肪酸與低級飽和脂肪酸，此外還有許多生物活性物質如茶多酚、茶皂素、角鯊烯等，具有一定抗衰老和抗菌作用，被廣泛應用于食品、保健品、化妝品以及醫藥等行業[5,6]。

超聲波輔助酶水解山茶籽油提取工藝能在提高其提取率的條件下，免于有機溶劑等污染，降低食用中毒風險，同時還能保存大部分山茶籽中山茶皂苷、茶多酚等活性物質，相比于傳統壓榨提油工藝具有提取條件溫和、無需二次提取、耗能低、廢氣排放少等優勢，其浸出、去雜和精煉工藝步驟更為簡單，可大幅度降低對設備的投資[7]，成為新時代環境友好工業發展的必經之路[8]。

研究表明，酶種類的選擇對最終游離油得率起決定作用。Fang等[9]采用水酶法提取山茶籽油，通過比較多種酶對提取率的影響發現，使用中性蛋白酶與纖維素酶對油脂的提取率明顯高于其他方法，目前此方法的提取率仍受乳化現象等問題的影響。馮紅霞等[10]通過超聲酶法在0.6 mm物料顆粒、60 ℃酶解溫度、3 h酶解時間及2%酶質量分數等條件下，以減少乳狀液的方式使游離油提取率達59.2%。本實驗采用超聲酶解與破乳等步驟減少了水酶法乳化的影響，通過BP神經網絡與響應面預測確定與實際更加擬合的方法，使推算最佳工藝更為準確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茶籽，2021年購于浙江省開化縣；氫氧化鉀、無水乙醇、石油醚、無水硫酸鈉：分析純；甲醇、正庚烷：色譜純；37種脂肪酸甲酯混合標樣，純度≥99.0%；中性蛋白酶(100 U/mg)。

Eppendorf AG 22331 Hamburg型高速冷凍離心機，TYQ2-IIDN型超聲細胞粉碎機，VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀，8890 GC型快速探針桿，7697A型頂空進樣器，7693A型自動液體進樣器。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波輔助酶解提取山茶籽油工藝

1.2.2 山茶籽油單因素實驗

對超聲功率、超聲溫度、超聲時間、料液比、酶解時間進行單因素實驗設計。各單因素四梯度設計：料液比：1∶3～1∶7.5 g/mL；超聲時間：5～35 min；超聲溫度：15～45 ℃；超聲功率：50～350 W；酶解時間：1～5.5 h；單因素其他條件分別選擇：1∶5 g/mL，25 min，180 W，3 h。并將每項最佳水平設為下一項固定值。設計空白對照實驗：料液比1∶4.5 g/mL；酶解時間3 h。

1.2.3 山茶油理化指標測定

總油脂含量測定：GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》[11]。

1.2.4 山茶油成分分析測定

稱量樣品100 mg于50 mL的比色管中，加入0.125 mol/L KOH-CH3OH溶液5 mL，放置于85 ℃水浴鍋中搖晃5 min；加入14% BCl3-CH3OH溶液5 mL,放置于85 ℃水浴鍋中不斷搖晃5 min；加入正庚烷5 mL，加熱3 min，再加入Na2SO45 g，充分振蕩。取上清液置于進樣小瓶中進行GC-MS分析[12]。GC-MS儀器分析使用1.0 mL/min流速，10∶1分流比，200 ℃進樣口溫度，EI電離方式，程序升溫為100 ℃ 2 min，10 ℃/min至160 ℃；0.4 ℃/min至180 ℃；4 ℃/min至240 ℃保持15 min[13-15]。

1.2.5 響應面設計

根據單因素實驗結果并通過Design Expert 12 設計響應面實驗表，結果見表1。

表1 響應面實驗設計

1.2.6 BP神經網絡的建立

BP神經網絡是一種模擬大腦進行運算的特殊方式，分為輸入層、隱藏層、輸出層,每層之間相互關聯，但同層各因素之間沒有聯系[16]。BP神經網絡在其基礎上增加反向調節功能，即當正向計算時產生的誤差大于設定值時反向傳遞信號，通過修改隱藏層權值以減小誤差直到小于設定值的運作方式，該網絡具有操作簡單、誤差小等優點[16]。BP神經網絡的建立使用Matlab2021a軟件，不同影響因素樣本共計17個，其中74%樣本用于模型訓練，13%樣本用于驗證訓練，13%樣本用于測試，神經網絡結構搭建如圖1所示[17]。

注：X1～X3為輸入層3種影響因素；為隱藏神經元；Y為輸出值提取率/%；ε為設定誤差值。圖1 神經網絡結構與構建流程圖

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

根據表1進行單因素實驗設計，空白對照組提取率為11.2%。相較與空白組實驗，隨著超聲時間及超聲功率的加大，使得對細胞粉碎強度增大，進而解除了蛋白質、多糖對油脂的包裹，而提取溶劑占比在較時由于無法形成超聲對流，提取效果有較大影響，隨著占比增提高增加了液體流動性，蛋白酶能更好與底物進行接觸，利于提高提取率，但隨著溶劑占比繼續提高，使酶無法與底物充分接觸，導致提取率下降。超聲溫度對山茶籽油提取率的影響說明溫度改變了物料中蛋白質、皂素的結構影響油脂提取率。由于酶解時間的提高，進一步破壞細胞結構，使蛋白質降解為多肽釋放更多油脂，則最優條件為：超聲時間25 min，超聲功率250 W，酶解時間4 h，料液比1∶4.5 g/mL，超聲溫度35 ℃。

圖2 單因素實驗結果

2.2 響應面結果分析

在單因素結果的基礎上進行響應面實驗設計，二次模型方差見表2。

表2 二次模型方差分析

由表2可知，該模型F值為22.47，P值為0.002，表示此模型顯著。其中A、C、A2、B2、C2的P值均小于0.01，說明差異極顯著。通過響應面軟件分析可得到模型。

Y=-216.564+41.501A+0.756B+34.308C+0.007AB-0.094AC-0.031BC-4.592 59A2-0.001B2-3.092C2

該模型最優解為料液比4.68 g/mL，超聲功率258.51 W，酶解時間4.19 h，提取率為50.05%。

2.3 BP神經網絡結果分析

數據選擇為隨機選擇，以均方誤差為性能判定，分別選擇3～12個隱藏神經元進行1 000次訓練[18]。神經元數量與神經網絡準確度密切相關，當神經元數量較低時網絡的自由度不足時無法準確計算條件與結果的關系，神經元數量過多會使計算量龐大，耗時更長甚至降低準度。如表3所示，當隱藏神經元數量為5時訓練誤差最小為0.028(均方誤差越低越好，0代表沒有誤差)。

圖3表明，選擇3×5×1網絡結構回歸系數均為0.997。該網絡結構具有良好相關性，能準確模擬超聲波輔助酶法提取山茶籽油工藝提取率與3種因素之間的關系。

表3 隱藏神經元個數篩選

圖3 BP神經網絡訓練誤差圖與回歸系數

2.4 人工神經網絡與響應面比較

響應面及神經網絡回歸預測結果如圖4所示。表4為分別通過響應面設計、BP神經網絡進行最佳工藝預測并與實際提取率相比的結果。

響應面能通過圖形與函數的直觀反映實驗快速得出各因素對結果的影響。但是由于本實驗中3種因素分別都能對提取率造成較大影響并能二次交互，相較于響應面的多元二次計算，BP神經網絡通過多次模擬訓練更能實現結果仿真且在最優條件下得出提取率較高，實際值與預測值誤差較小。通過其預測最佳工藝，表明該神經網絡能有效優化超聲輔助酶解法提取山茶籽油工藝。

圖4 17組人工神經網絡與響應面回歸預測

表4 最優條件下響應面與神經網絡提取率比較

圖5 山茶籽油紅外吸收光譜圖

2.5 紅外吸收光譜對山茶籽油脂肪酸成分分析

山茶籽紅外吸收光譜圖分析：在3 005.31 cm-1處有強度較弱的吸收譜帶，可能為不飽和C—H鍵的伸縮振動；在1 746.58 cm-1附近有吸收強度較強的吸收譜帶，可能為羰鍵的伸縮振動；在1 164.28 cm-1附近有吸收譜帶，可能為醚鍵的對稱伸縮；在2 925.35 cm-1和2 854.42 cm-1附近有2個強度較高的吸收譜帶，可能為飽和C—H鍵的伸縮振動；在1 464.51 cm-1和1 377.51 cm-1，可能存在—CH2—的不對稱剪式振動和—CH3的彎曲振動。在722.82 cm-1附近有中強度的吸收譜帶，說明存在長鏈飽和烴(n≥4)[19，20]。

2.6 GC-MS對山茶籽油脂肪酸成分分析

將脂肪酸進行甲酯化，設定色譜、質譜條件進行測定，并通過NISTI7.L數據庫進行檢索，各組分含量如表5所示。

表5 山茶籽中脂肪酸甲酯化合物含量

3 結論

采用超聲波輔助酶解山茶籽油提取工藝，結果表明，可表明超聲波與中性蛋白酶的結合作用能起到良好的破碎細胞、降低對油脂的包裹、提高油脂提取率等作用。通過構建響應面與BP神經網絡，發現其預測值的標準誤差比響應面預測降低0.39%，能更好地反映提取因素對提取率的影響。經GC-MS測定得知山茶籽油脂肪酸主要為油酸89.36%、棕櫚酸6.27%、亞油酸2.25%、硬脂酸1.79%、順式-十八烷酸0.34%，山茶籽油不飽和脂肪酸質量分數達到89.70%，是優質的可食用植物油。