一個天麻共生蜜環菌菌株的培養基篩選

楊文權，劉 玲，吳 娜，張躍進，孫建華，張小燕

(1.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西漢王略陽中藥科技有限公司，陜西 略陽 724300；3.西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100)

蜜環菌(Armillariamellea)是屬于擔子菌門(Basidiomycota)傘菌目(Agaricales)泡頭菌科(Physalacriaceae)蜜環菌屬(Armillaria)非常重要的真菌[1]。因其含有多種倍半萜類化合物、多糖、氨基酸及各種微量元素等，具有免疫調節、護肝、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用和重要的食用、藥用價值[2-4]。同時，蜜環菌又是名貴中藥材天麻(Gastrodiaelata)的共生菌，而天麻沒有根莖葉，只有開花時花莖才抽出地面，其余時間都在地下，營養來源全憑共生的蜜環菌供給，因此，蜜環菌是天麻生長中唯一的外來營養源，是天麻栽培中不可缺少的材料[5-6]。

蜜環菌菌種在生產中分為三個級別，一級母種用于保存和運輸，二級原種用于擴大繁殖，三級栽培種用于生產栽培[7]。其中，一級母種培養基可以確保蜜環菌得以良好保藏和運輸，三級栽培種培養基可以確保生產出優良、健壯的蜜環菌，服務天麻生產，因此，在蜜環菌生產中非常重要。蜜環菌生長過程中需要不同的營養源，主要包括碳源、氮源、無機鹽等[8]，已有研究表明，雖然蜜環菌可利用多種營養源，但對最有效利用的營養源有選擇[9]，因此，不同配方的母種和栽培種培養基上，蜜環菌的生長情況不同。在適宜的培養基上，蜜環菌萌發速度快，菌索白嫩、粗壯，分枝多，生物量大，不僅可以縮短蜜環菌培養時間，降低蜜環菌生產成本，而且培養的蜜環菌健壯，在天麻栽培過程中可快速形成菌索侵染菌棒，與天麻建立共生關系后，盡早為天麻提供營養，提高天麻產量和質量[10-11]。雖然蜜環菌母種和栽培種培養基配方已有很多研究，但由于菌株不同，研究結果差異較大，在實際中無法通用[9,12]。為此，本試驗擬以寧強真菌研究所分離的1株蜜環菌MC4為對象，研究其最佳的一級母種和三級栽培種培養基，給該蜜環菌的商品化及蜜環菌的育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試蜜環菌菌株編號MC4，由寧強真菌研究所分離提供，經rDNA-ITS序列分析鑒定為蜜環菌(Armillariamellea)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化 將MC4母種從冰箱取出，室溫黑暗放置24 h，接種到PDA平板中央，于25 ℃黑暗下培養，待菌索長滿平板備用。

1.2.2 蜜環菌母種培養基配方

(1)不同碳源培養基

1 L培養基，加碳源(紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米粉、麥芽浸粉)20 g，蛋白胨10 g，MgSO41 g，KH2PO42 g、瓊脂15 g。

(2)不同氮源培養基

1L培養基，加氮源(蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉膏)10 g，葡萄糖 20 g，MgSO41 g，KH2PO42 g，瓊脂15 g。

(3)不同無機鹽培養基

1L培養基，加無機鹽(MnSO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4)2 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g。

1.2.3 蜜環菌栽培種培養基配方

(1)Ⅰ號培養基

櫟木木屑50%，棉籽殼30%，麩皮18%，石膏1%，生石灰0.5%，蔗糖0.4%,KH2PO40.1%，料水比1∶1.4 kg·L-1，裝入5 cm×30 cm×5 cm聚丙烯袋，每袋250 g。

(2)Ⅱ號培養基

櫟木枝條40%，水60%。其中，櫟木枝條210 g，水315 mL，裝入650 ml細口組培瓶。

(3)Ⅲ號培養基

櫟木枝條50%，麩皮20%，木屑20%，玉米面7%，石膏1%，白糖2%，料水比1∶1.4 kg·L-1，裝入5 cm×30 cm×5 cm聚丙烯袋，每袋250 g。

(4)Ⅳ號培養基

櫟木枝條40%，馬鈴薯汁60%，其中馬鈴薯汁由去皮馬鈴薯200 g·L-1煮沸制成。其中，櫟木枝條210 g，馬鈴薯汁315 ml，裝入650 ml細口組培瓶。

1.2.3 培養基的制備 12種母種培養基分別按配方配制，裝入18 mm×200 mm的試管，每管裝35 ml，橡膠塞封口，121 ℃滅菌20 min，取出后自然冷卻凝固，待用。4種栽培種培養基封口后121 ℃滅菌4 h，備用。

1.2.4 接種 母種培養基每試管接活化菌株1塊(0.5 cm直徑菌塊)，栽培種每袋(瓶)接種活化菌株4塊，每處理3個重復，25 ℃，黑暗培養。

1.3 測試指標

1.3.1 蜜環菌的吃料深度 蜜環菌深入試管、袋子或瓶中培養基的深度，每3 d測1次。

1.3.2 蜜環菌的生物量 培養45 d后，將試管中的培養基和蜜環菌菌索一起倒出，蜜環菌菌索與培養基分離后用蒸餾水沖洗，60 ℃烘箱烘12 h，稱重。

1.3.3 菌索的直徑 從袋子或瓶子外面，隨機挑選10個菌索，測量其直徑。

1.4 數據統計與分析

數據用Excel 2016進行初步處理，用SPSS18.0軟件進行One-way ANOVA方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同母種培養基對蜜環菌MC4的影響

2.1.1 不同碳源對蜜環菌MC4生長的影響 由圖1可以看出，蜜環菌MC4在以紅薯淀粉為碳源的培養基上菌絲萌發最早，第9 d開始萌發，在馬鈴薯淀粉培養基上菌絲萌發最晚，15 d以后才開始萌發。以麥芽浸粉為碳源的培養基菌絲萌發的最初一段時間生長迅速，在21 d時，吃料深度已達8.533 cm。在4種不同碳源培養基中，玉米粉培養基上蜜環菌的菌索生長速度最慢，36 d時，吃料深度只有3.833 cm，顯著低于(P<0.05)在其它3個碳源培養基上的吃料深度。培養36 d時，以紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉及麥芽浸粉為碳源的3個培養基上培養的蜜環菌的吃料深度無顯著差異(P>0.05)，均在12 cm左右(圖1)。

圖1 不同碳源的蜜環菌生長

在4種碳源培養基上，蜜環菌MC4的生物量差異較大，其中馬鈴薯淀粉為碳源的培養基上，菌株生物量最大，干重為0.191 g，顯著高于(P<0.05)其它3種碳源培養基上的生物量；以玉米粉為碳源的培養基上，菌株MC4的生物量最少，只有0.050 g，顯著低于(P<0.05)其它3個培養基上的生物量；4種碳源培養基上菌株生物量由大到小為：馬鈴薯淀粉>麥芽浸粉>紅薯淀粉>玉米粉(圖2)。

注：不同小寫字母表示差異顯著，下同。

2.1.2 不同氮源對蜜環菌MC4生長的影響 以大豆為氮源的培養基上，蜜環菌MC4菌絲萌發最晚，12 d以后才開始萌發。萌發后，在酵母粉培養基中，MC4的菌索生長最快，36 d時吃料深度為12.550 cm，顯著高于(P<0.05)在其它3種培養基中的吃料深度(圖3)。在牛肉膏培養基中，MC4的生長速度也較快，36 d時吃料深度為10.125 cm。在蛋白胨和大豆粉培養基中，MC4的生長速度較慢，36 d時吃料深度分別只有6.659 cm和6.400 cm，顯著低于(P<0.05)酵母粉和牛肉膏培養基中的吃料深度。

圖3 不同氮源的蜜環菌生長

氮源顯著影響蜜環菌的生物量，從圖4可以看出，在4種不同氮源培養基中，酵母粉培養基中的生物量最大，為0.481 g，顯著高于(P<0.05)其它3種培養基中的生物量。

圖4 不同氮源的蜜環菌生物量

大豆粉培養基中的生物量最低，只有0.119 g，顯著低于(P<0.05)其它培養基中的生物量。4種培養基中菌株的生物量由大到小依次為：酵母粉>牛肉膏>蛋白胨>大豆粉。

2.1.3 不同無機鹽對蜜環菌MC4生長的影響 4種不同無機鹽對蜜環菌MC4的生長影響顯著(圖5)，在FeSO4培養基中，MC4的菌絲不萌發，隨時間推移，培養基逐漸變褐變黑。在KH2PO4培養基中菌絲萌發最早，培養第9 d時開始萌發，而在MnSO4培養基中的萌發最晚，18 d以后菌絲才開始萌發。培養36 d時，KH2PO4培養基中的生長速度最快，吃料深度為5.700 cm，顯著高于(P<0.05)在MgSO4和MnSO4培養基中的生長速度，其中，在MnSO4培養基中的生長速度最慢，只有1.740 cm。

圖5 不同無機鹽下蜜環菌的生長

從圖6可以看出，培養基中添加不同無機鹽后，蜜環菌MC4的生物量差異較大。由于添加FeSO4后，MC4沒有生長，因此生物量為零。而在添加KH2PO4的培養基中，MC4的生物量最大，為0.182 g，顯著高于(P<0.05)添加MgSO4和MnSO4培養基中的生物量。

圖6 不同無機鹽下蜜環菌的生物量

2.2 不同栽培種培養基對蜜環菌MC4的影響

2.2.1 不同栽培種培養基對蜜環菌MC4生長的影響 從圖7可以看出，MC4在Ⅳ號培養基中培養時最先萌發，但前14 d均生長緩慢，14～20 d內生長迅速，后基本保持平穩速度生長，44 d時長滿菌瓶。在Ⅰ號培養基中，MC4生長速度較快，33 d時已經長滿。在Ⅲ號培養基中，MC4萌發最晚，12 d后菌絲才開始萌發，36 d時長滿整個菌袋。在Ⅱ號培養基中，前18 d長勢緩慢，后加速生長，48 d時吃料深度達10.833 cm，54 d時基本長滿。

圖7 不同三級栽培種培養基的蜜環菌生長

2.2.2 蜜環菌MC4在不同栽培種培養基上的形態特征 從表1可以看出，在Ⅰ號和Ⅲ號培養基上培養時，MC4的菌絲萌發較慢，接近10 d左右，菌索形成時間也較長，需要15 d左右。而在Ⅱ號和Ⅳ號培養基上培養時，菌絲不僅萌發時間較短，而且菌索形成時間也較快。但是，Ⅲ號和Ⅳ號培養基上形成的菌索較粗，直徑均為0.45 cm，且均較Ⅰ號和Ⅱ號培養基上的菌索茂密。因此，菌株在Ⅳ號三級培養基中不僅萌發時間短，生長速度快，且菌索粗壯，分枝茂密。

表1 蜜環菌在不同三級栽培種培養基上的形態特征

3 結論與討論

微生物生長需要碳源、氮源、無機鹽等不同的營養物質[13]，碳源可提供菌體細胞的碳架和生命活動所需的能量，氮源是構成菌體蛋白質、核酸的不可或缺的原料，而無機鹽可作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑等，參與代謝反應[14-15]。以往的研究表明，蜜環菌對營養物質要求并不嚴格，馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、玉米粉、麥麩、葡萄糖、蔗糖等均是其優質的碳源，菜籽餅、蠶蛹粉、蛋白胨、酵母浸粉、尿素等均是其常用的氮源[9，16-18]，而KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2等是常用的無機鹽[8,17]。但是，由于不同營養物質的添加比例及不同菌株對營養物質的利用差異，因此直接影響蜜環菌的生長狀況。如彭述敏對2株分離自昭通的蜜環菌的研究表明，葡萄糖為其最佳的碳源，酵母膏和蛋白胨為最佳的氮源，最適無機元素為K2SO4和KH2PO4[8]。李再新的研究表明，葡萄糖和酵母粉為蜜環菌培養最佳的碳、氮源[19]。程顯好通過1株蜜環菌對15種碳源和6種氮源的研究表明，碳源因素對蜜環菌生長的影響大于氮源因素，在以甘露糖為碳源的培養基上生物量最高，但在不同氮源條件下，蜜環菌都能很好的生長，形態無顯著差異[20]。

本試驗結果也表明，以馬鈴薯淀粉為碳源、以酵母粉為氮源、以KH2PO4為無機鹽的一級母種培養基上，蜜環菌MC4的生長速度及生物量顯著高于其它培養基。這可能是因為相比馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉和麥芽浸粉，玉米粉的養分較少，所以不利于蜜環菌的生長，因此生長速度和生物量均較低，而蜜環菌雖然在紅薯淀粉和麥芽浸粉培養基上的生長速度與馬鈴薯淀粉接近，但由于菌索分枝少、較細，因此生物量顯著低于馬鈴薯淀粉培養基。與彭述敏[8]、閆軍[21]試驗所得蛋白胨是蜜環菌最佳氮源不同，本試驗在以蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉膏為不同氮源的研究中發現，MC4在酵母粉培養基上的生物量最高，在大豆粉和蛋白胨中不僅吃料深度最淺，生物量也低。由此可知，不同菌株對氮源有不同喜好，以酵母粉為氮源的培養基更適合菌株MC4的生長。在添加不同無機鹽的培養基中，蜜環菌MC4在添加了FeSO4的培養基中沒有生長，無菌絲和菌索萌發，可能是因為FeSO4濃度過高，抑制了蜜環菌的萌發和生長[22-23]。與彭述敏[8]結果一致，MC4在添加KH2PO4的培養基上，生長最好，吃料深度最深，生物量顯著高于其他處理。而在生產三級栽培種培養基時，不僅要考慮蜜環菌的生長速度，縮短培養時間，還要考慮生產成本和工藝的復雜性[24]。本試驗研究表明，在以櫟木枝條40%+馬鈴薯汁60%配制的Ⅳ號培養基上，不僅菌株萌發最早，生長最快，菌索最粗，而且生產成本低，工藝簡單，易于操作，因此列為首選栽培種培養基。