雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的生物信息學分析

連家勝， 鄔嘉琦， 宋彩銀， 康丹菊， 周光現

(廣東海洋大學濱海農業學院，廣東 湛江 524088)

抗生素耐藥性在全球廣泛存在，近些年報道每年都有幾十萬人死于抗生素耐藥。耐藥細菌產生主要歸于人們對抗生素的濫用，尤其是在畜牧業中的應用，2012年美國在畜牧生產領域售賣14 800 t抗生素，歐盟國家售賣8 000 t抗生素[1]。1950—2020年，抗生素在畜牧業飼料添加應用已有70年歷史[2-3]?？股卦谛竽翗I中使用量已超過人用量，抗生素在畜牧業養殖種起著重要作用。但為了人民生活健康，各國陸陸續續開始了抗生素在飼料添加劑中的禁用?？股氐慕?，對養殖有不小沖擊。因此，新型的抗菌方案孕育而生?？咕淖鳛樾滦涂咕镔|，具有抗菌譜廣、熱穩定性好等優良特性，在畜牧業具有較大應用價值和潛力，具備完全替代抗生素的能力[4-5]。天然抗菌肽并非完美，有的在抗菌的同時對機體有一定損傷，如溶血性和細胞毒性。通過人工設計優化抗菌肽，可以增強抗菌活性降低溶血性風險[6]。

蜂毒肽(melitten)為蛋白質多肽類，由26個氨基酸組成，據報道研究表明該多肽具有抗菌、抗病毒和抗炎等多種藥理學作用[7-8]。蜂毒肽可融入質膜，可以使細菌內物質泄漏或使細菌質壁分離，從而導致細菌死亡。金環蛇抗菌肽(cathelicidin_BF)由30個氨基酸組成，具有廣譜的抗菌活性，不僅對細菌、某些真菌以及病毒具有非常強的殺菌活性[9]?？咕牡墨@取面臨兩大難題，一是獲取具有良好抗菌效果且對動物機體無損傷的抗菌肽，一是抗菌肽制備工藝問題。天然抗菌肽含量豐富但提取成本較高，合成抗菌肽也面臨成本較高問題，不利于經濟生產。

國內外研究表明設計合成許多種雜合肽，在抑菌等效果明顯優于天然肽，且降低了毒性和溶血性?？咕淖鳛樾滦惋暳咸砑觿?，抗生素替代品，具有較高的研究價值。改造已有抗菌肽，并設計新抗菌肽分子是創造高活力抗菌肽的有效途徑，通過生物合成降低抗菌肽獲取成本。為了獲得優良的抗菌肽，這就需要在設計改造前對抗菌肽進行生物信息等理化性質分析，從而為抗菌肽分子的改造和設計提供足夠的理論依據?？傊?，新型雜合肽的設計優化等研發對解決天然抗菌肽存在的問題有著重要的意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取蜂毒肽(GI：EU753183.1)C端序列GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ為新雜合肽N端序列，選取金環蛇抗菌肽(GI：JQ867103.1)C端序列KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF為新雜合肽C端序列。

1.2 方 法

1.2.1 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的理化性質分析 借助ProtParam工具[10](https://web.expasy.org/protparam/)對雜合抗菌肽Melitten-cathelicidin_BF進行分子量、等電點、相對分子質量、親水疏水性等理化參數預測。

1.2.2 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的親疏水性分析 利用ProtScale工具[11](https://web.expasy.org/protscale/)分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF氨基酸位點的疏水性/親水性，分別選擇Hphob./Kyte & Doolittle和Hphob./Hopp & Woods算法進行分析，滑窗大小為9，線性加權模型。

1.2.3 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的跨膜區和信號肽分析 利用TMHMM-2.0工具[12](https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的跨膜區。利用SignalP 5.0 Server工具[13](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的信號肽，選擇真核生物類別進行分析。

1.2.4 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的糖基化和磷酸化位點預測 利用NetOGlyc 4.0 Server工具[14](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)和NetPhos 3.1 Server工具[15](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的糖基化和磷酸化位點。

1.2.5 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的二級結構分析 利用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的二級結構組成與分布，選擇構象狀態數4(包括螺旋、折疊、轉角和無規卷曲)、相似閾8、窗口寬度17。

1.2.6 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的酶切位點分析 通過PeptideCutterL在線工具https://web.expasy.org/peptide-cutter/分析該雜合肽蛋白酶切割的潛在位點。解析其安全性。

1.2.7 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的三維結構分析 通過SWISS-MODEL在線工具https://swissmodel.expasy.org/interactive分析比對雜合肽Melitten-cathelicidin_BF匹配情況，再通過I-TASSER在線工具https://zhanggroup.org/I-TASSER/構建雜合肽三維結構。

1.2.8 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的功能分析 通過interpro在線工具http://www.ebi.ac.uk/interpro分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF功能作用。

2 結果與分析

2.1 雜合抗菌肽Melitten-cathelicidin_BF的理化性質分析

該雜合肽一級序列為GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQKFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF。利用ProtParam進行理化性質分析，結果表明Melitten-cathelicidin_BF共含有56個氨基酸殘基，分子式為C307H516N86O66，預測分子量為6.47 kDa，理論等電點為12.20。該雜合肽由14種基本氨基酸組成，其中賴氨酸(Lys)含量最高，占氨基酸總數的21.4%，其次為精氨酸(Arg)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和纈氨酸(Val)，分別均占氨基酸總數的8.9%，帶負電的殘基(Asp+Glu)數為1個，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)數為17個(表1)。該雜合肽在不同環境中半衰期預測，在哺乳動物細胞中約為30 h，在酵母中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。不穩定指數為25.95，脂肪族氨基酸指數為100.89，總親水性平均系數GRAVY值為-0.161，表明該雜合肽為親水性蛋白。

表1 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的氨基酸組成

2.2 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的親疏水性分析

利用ProtScale進行雜合肽Melitten-cathelicidin_BF氨基酸位點的親疏水性預測。Hphob./Kyte & Doolittle方法其值大于0表示具有較強疏水性，小于0具有較強的親水性；Hphob./Hopp & Woods方法其小于0表示具有較強疏水性，大于0具有較強親水性。綜合兩種方法，該雜合肽在預測結果顯示位點5～19區域具有強疏水性；位點20～49區域表現為親水性。雖然Hphob./Kyte & Doolittle和Hphob./Hopp & Woods算法不同，但每個氨基酸親疏水性強弱都能夠在一定程度上得到展現。這兩種算法，都表明該雜合肽整體呈親水性。

注：橫坐標表示氨基酸位置，縱坐標表示不同算法的值。

2.3 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的跨膜區和信號肽分析

經TMHMM-2.0分析雜合肽Melitten-cathelicidin_BF無跨膜區(圖2A)。第4～21氨基酸，在膜上和在里面的概率在0.1～0.2，而在外的概率均大于0.6。第22～56氨基酸，在外的概率均大于0.7，在膜上概率為0。SignalP分析結果表明雜合肽Melitten-cathelicidin_BF無信號肽(圖2B)。

注：A-跨膜區預測；B-信號肽預測。

2.4 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的糖基化和磷酸化位點分析

經NetOGlyc軟件分析，雜合肽Melitten-cathelicidin_BF存在5個糖基化位點，分別是第10和11位的蘇氨酸殘基，第18、35和53位的絲氨酸殘基，得分分別為0.175，0.264，0.220，0.100，0.052。經NetPhos軟件分析，雜合肽Melitten-cathelicidin_BF共有1個絲氨蘇氨酸磷酸化位點(得分0.886)和1個蘇氨酸磷酸化位點(得分均>0.5)(圖3)。

圖3 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的磷酸化位點預測

2.5 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的二級結構分析

經SOPMA軟件分析，雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的二級結構中，α螺旋占比64.29%，由36個氨基酸殘基參與；延伸帶占比8.93%，由5個氨基酸殘基參與；轉角占比7.14%，由4個氨基酸殘基參與；無規則卷曲占比19.64%，由11個氨基酸殘基參與(圖4)。表明雜合肽Melitten-cathelicidin_BF二級結構的主要元件為α螺旋和無規則卷曲。

注：①為α螺旋，②為延伸帶,③為無規則卷曲，④為β轉角。

2.6 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的酶切位點分析

由表5可知：雜合肽Melitten-cathelicidin_BF可被17種蛋白酶剪切，同一位點可被多種蛋白酶剪切，該肽含有的56個氨基酸殘基均可作為酶切位點。其中，13種蛋白酶有≥5個剪切位點，天冬氨酸-N端+谷氨酸-N端肽鏈內切酶、糞臭素酶、谷?；逆渻惹忻?、Iodosobenzoic acid、脯氨酸肽鏈內切酶和葡萄球菌的肽酶I僅有1個剪切位點。

表5 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的酶切位點

2.7 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF的三維結構分析

利用SWISS-MODEL數據庫比對雜合肽Melitten-cathelicidin_BF結構信息。比對發現該雜合肽分別與數據庫中Melittin(SMTL ID：3qrx.1)(圖5A)和Cathelicidin-like peptide(SMTL ID：2mwt.1)匹配率高(圖5B)，相似度達到100%和73.53%，GMEQ值分別為0.19和0.44。通過I-TASSER在線軟件對雜合肽建模分析(圖5C)，其C-score值為-2.17，說明蛋白質模型相對可靠。

注：A，與Melittin匹配模型；B，與Cathelicidin-like peptide匹配模型；C，I-TASSER在線分析模型。

2.8 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF功能分析

雜合肽Melitten-cathelicidin_BF為人工合成肽，具有蜂毒肽和金環蛇抗菌肽部分或全部功能。通過功能分析，該雜合肽為蛋白酶抑制劑類肽，具有蛋白酶抑制劑系列功能(圖6)。該雜合肽無信號肽、無跨膜區，且該雜合肽為陽離子肽，可通過靜電吸附作用貼在細菌表面形成“氈子”結構，從而破壞細胞膜結構。

圖6 雜合肽Melitten-cathelicidin_BF功能預測分析

3 討 論

絕大部分抗菌肽為陽離子肽，可以通過與帶負電荷的細胞膜相互作用，破壞膜完整性從而殺死細胞，也可通過抑制蛋白質、DNA和RNA的合成，或相互作用有特定的細胞內目標，從而達到抑菌或殺菌效果[16-19]。然而抗菌肽的抗菌活性及其生物學特性，受到肽鏈長度、氨基酸組成和空間結構等因素的影響[20-21]。因此，可以通過優化肽氨基酸組成及其數量，改變肽鏈長度或是拼接組成新型雜合抗菌肽，獲取較理想的抗菌肽片段。自然界中雖存在大量抗菌肽，但提取不易、提取成本高，故此采用基因工程技術生產抗菌肽是目前首選的方式。該技術成熟并具有一定的預測性。生產前可以通過生物信息學方式，對抗菌肽理化性質進行系統分析，進而對所生產抗菌肽抗菌效果及其抗菌方式進行評估。

本研究選取抗菌肽為蜂毒肽和金環蛇抗菌肽，分別源于蜜蜂和金環蛇兩個物種。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，由26個氨基酸組成，具有兩極性。小劑量蜂毒肽具有廣泛的抗炎作用，高劑量蜂毒肽會引起局部疼痛、瘙癢和發炎等癥狀[22]；蜂毒肽為致敏肽，需要降低致敏性再投入使用。金環蛇抗菌肽由30個氨基酸組成，具有抗菌、抗炎、調節機體免疫作用，其負面報道鮮少[23]。本研究將蜂毒肽和金環蛇抗菌肽融合表達形成56個氨基酸新肽，其作用是否具有二者效果有待進一步研究。通過生物信息學分析，發現新肽具有抗菌肽顯著特點，新型雜合肽為陽離子肽，具有兩親性，主要有α螺旋和β折疊結構組成。推測該融合肽具有一定抗菌效果。該合成肽通過蛋白質功能預測發現該肽為蛋白酶抑制劑類肽動物機體內酶系繁多，可降解不同底物。本研究通過酶切位點分析發現，雜合肽Melitten-cathelicidin_BF能被18種蛋白酶消化，雖不利于該雜合肽在機體內穩定存在，但有助于消除生物潛在危害，提高抗菌肽生物安全性。雜合肽Melitten-cathelicidin_BF多次被酶解轉化，易形成小分子氨基酸類物質，易于機體吸收?；陔s合肽Melitten-cathelicidin_BF潛在威脅較小，有望成為新型抗生素替代添加劑飼料，從而解決畜牧業中微生物耐藥等健康養殖問題。

3 結 論

雜合肽Melitten-cathelicidin_BF為人工合成小分子、無信號肽、無跨膜區，且該雜合肽為陽離子肽，可通過靜電吸附作用達到抗菌效果。該肽易被生物體內多種蛋白酶酶解，故此具有良好的安全性，具有作為抗菌飼料添加劑潛力。