黑素小體的結構及功能研究進展

鐘敏，岳蕓蕓*，尚靖,2,3,4*

（1.中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198；2.中國藥科大學江蘇省中藥評價與轉化重點實驗室，江蘇 南京211198；3.中國藥科大學天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；4.國家藥品監督管理局化妝品研究與評價重點實驗室，北京 100050）

0 引言

黑素細胞中的黑素小體是黑色素合成和儲存的細胞型特異性細胞器，黑素在黑素小體中合成后，黑素小體被進一步轉運到角質形成細胞，最終隨著角質形成細胞的分化而被降解。成熟黑素小體的功能決定了人類皮膚的顏色。深色皮膚的黑素小體比白色皮膚的黑素小體更大，色素更稠密[1]，并且更頻繁地轉移到角質形成細胞[2]。色素紊亂性疾病的發生和黑素小體發育、轉運密切相關，研究證明黑素小體的功能異常會導致嚴重的色素性疾病的發生。

1 黑素小體的來源及分類

黑素合成是黑素細胞最重要的生物學功能，黑素小體作為黑素細胞特有的細胞器是合成和貯存黑素的主要場所，也是一種溶酶體相關的細胞器[3]。它起源于核周的多囊泡小體，隨著囊泡的不斷分化、成熟，多種黑素合成相關蛋白進入囊泡，使得前黑素小體具有了黑素合成能力[4]。根據所包含的黑色素不同，分為真黑素小體和褐黑素小體。真黑素小體呈橢圓形，往往比褐黑素小體大，有明顯的蛋白質樣纖維基質，它是真黑色素在黑素小體成熟早期整齊有序排列所必需的；而褐黑素小體是呈圓形，色素表面粗糙，所包含的蛋白多于真黑素小體，且為無定型的蛋白纖維基質[5-6]。早期的真黑素小體可以在透射電鏡下觀察到完整的黑色素纖維堆積產生的條紋，而褐黑素小體在鏡下呈不完全黑化斑點狀的條紋[7]。

2 黑素小體的發生

2.1 黑素小體成熟過程

黑素小體經過四個階段成熟并產生黑色素（圖1）。第Ⅰ階段為前黑素小體階段，這一階段含有很多腔內囊泡 (intraluminal vesicles，ILVs)，PMEL(也稱為Pmel17或gp100)一種膜蛋白在此被蛋白水解，從而使腔內囊泡伸出不規則纖維[8]，此階段不含任何色素且細胞器呈球狀。第Ⅱ階段，黑素小體伴隨著腔內囊泡延長，外部形成纖維狀結構，內部產生纖維基質，這一階段有黑素生成酶從反式高爾基網絡或早期內體系統運輸來[9]；第Ⅲ階段，合成的黑素存儲在PMEL有序纖維上，產生第三階段黑素小體特有的厚紋[10]；第Ⅳ階段，黑色素繼續在淀粉樣纖維上合成和沉積直到充滿內部纖維結構，形成完全著色的成熟黑素小體[11]。

2.2 黑素小體的生物發生及功能行使

2.2.1 第一階段

第Ⅰ階段為前黑素小體階段，這一階段含有很多腔內囊泡 (intraluminal vesicles，ILVs)，PMEL(也稱為PMEL17或GP100)是一種膜蛋白，它被轉運到未成熟的黑素小體是黑素小體生物發生的早期步驟，但其實現機制尚不完全清楚。PMEL被帶入I期未成熟黑素小體的管腔，并被蛋白水解，這一過程是腔內囊泡伸出不規則纖維所必需的[12]。許多蛋白質形成淀粉樣纖維與神經退行性疾病(包括阿爾茨海默病和帕金森氏病)等有關。而PMEL纖維，由于一種名為ApoE[13]的脂蛋白的存在，表現為生理性、非致病性的淀粉樣纖維[14]，并且表現出有序的纖維化。這種脂蛋白集中在ILV的表面，并覆蓋PMEL的片段，推測ApoE通過ILV來引導PMEL有組織的纖維化[15]，此階段不含任何色素且細胞器呈球狀。

2.2.2 第二階段

第Ⅱ階段，黑素小體伴隨著囊泡延長，在Pmel17的促進下，黑素小體外部形成纖維狀結構，內部產生纖維基質[16]。這一階段有酪氨酸酶等黑素小體蛋白從反式高爾基網絡或早期內體系統運輸來[17]。據報道，參與黑素小體蛋白運輸主要有兩種途徑：一種是溶酶體相關細胞器復合體(BLOC-1)依賴途徑，另一種是BLOC-1非依賴/AP-3依賴途徑（圖1）。BLOC-1是由8個亞基組成的蛋白質復合體，最初定位于早期內體，具有彎曲結構[18],主要調節某些黑素小體蛋白（包括ATP7A和Tyrp1）從早期核內體到黑素小體的轉運[19-20]。BLOC-2是由三個亞基組成的蛋白質復合體，也定位于早期內體，研究推測它在BLOC-1下游發揮運輸載體的作用，并且能夠促進含有黑素小體蛋白的循環核內體和成熟黑素小體之間的融合[21]。APs是四聚體蛋白質復合物，能夠介導蛋白進入囊泡后的分選。目前已有五種APs被報道，其中AP-3依賴途徑主要用于酪氨酸酶向黑素小體的轉運[22]。

圖1 調節黑素小體生物發生的內體和黑素小體運輸系統示意圖[31]

2.2.3 第三階段

這一階段，BLOC-3作為Rab32/38特定的鳥嘌呤核苷酸交換因子，能夠使Rab32/Rab38與GTP結合從而被激活[23]。研究發現BLOC-3基因表達缺陷會導致無法招募Rab32/Rab38-錨蛋白重復蛋白(ankyrin repeat protein，Varp)，并且使包括酪氨酸酶、Tyrp1和Dct在內的黑素生成酶的運輸受阻[24-27]。Rab32/Rab38-Varp復合體也被認為能調節酪氨酸酶和Tyrp1從早期內體到黑素小體的順行運輸[28]。在黑素小體第Ⅲ階段，黑素小體膜上a-促黑素皮質激素(a-MSH)與黑皮質素受體1(MC1R)結合后，通過上調cAMP水平，激活真黑素的合成， 這一過程在各種黑素生成酶催化下將酪氨酸轉化為多巴醌類，并最終生成真黑素[29]。若Agouti基因編碼的刺豚鼠信號蛋白高表達，就會與a-MSH競爭性結合MC1R，從而下調cAMP水平，激活褐黑素的合成[30]。最終黑素合成并存儲在淀粉樣纖維上，并使其變黑增厚。

2.2.4 第四階段

第四階段Rab32/Rab38-Varp復合體通過與肌球蛋白Ⅵ合作，能夠從成熟的黑素小體中回收膜囊泡蛋白7 (VAMP7)[26]?；厥盏腣AMP7被認為會返回到早期的內體中，進行下一輪的黑素生成酶運輸。在這一階段黑色素繼續在淀粉樣纖維上合成和沉積直到充滿內部纖維結構，形成完全著色的成熟黑素小體[11]。

3 黑素小體的運輸與轉運

3.1 黑素小體在黑素細胞內的運輸

20世紀70年代的開創性工作表明，在非哺乳動物黑素細胞中，微絲[32]和微管[33]負責將黑素小體從細胞體向外運輸到樹突尖端(即離心)，并從樹突的遠端返回細胞體(向心)。非洲爪蟾的黑素細胞表達Kinesin-Ⅱ和dynein，前者是一種微管相關的負責正端定向運動的蛋白，后者是一種微管相關的負端定向運動蛋白[34]。在低等脊椎動物中，黑素小體沿著樹突的雙向移動更快。這種黑素小體在細胞內的選擇性移位可以使其在細胞體內聚集，也可以分散在樹突上，這種特性與皮膚顏色的深淺相關，能夠很快地適應環境。相反，哺乳動物黑素細胞中黑素體沿樹突的運動不是通過雙向運動的方法進行的。

在哺乳動物皮膚黑素細胞中，黑素小體在核周區域成熟，并與驅動蛋白(一種正端導向的微管馬達)結合。黑素小體以離心方式沿著微管向細胞外圍移動。一旦黑素小體到達細胞的外圍，它就會從微管中分離出來，并通過分子馬達肌球蛋白Ⅴa與臨近的肌動蛋白細絲結合在一起，在其上經歷局部的短程運動(圖2)[35]。這一步驟將黑素小體均勻分布在細胞的外圍，從那里它們可以轉移到相鄰的角質形成細胞。

圖2 表皮黑素細胞中黑素小體轉運模型[36]

那么哺乳動物中肌球蛋白Ⅴa又是如何與黑素小體連接的呢？目前研究發現主要有Rab27a、leaden一起參與了黑素小體的運輸,猜測可能存在2種模型機制:在模型1中，Rab27a的膜結合需要leaden，Rab27a進而通過其尾巴招募肌球蛋白Ⅴa。在模型2中，Rab27a首先與成熟的黑素小體結合，然后招募leaden，leaden又將肌球蛋白Ⅴa招募到黑素小體。在這兩種模型中，肌球蛋白Ⅴa的頭部結構域與肌動蛋白細絲的結合將黑素小體與外周肌動蛋白網絡聯系起來(圖3)[36]。

圖3 黑素小體轉運分子機制模型[36]

3.2 黑素小體從黑素細胞轉運到角質形成細胞

3.2.1 轉運機制

黑素小體從黑素細胞轉移到角質形成細胞是唯一已知的細胞器在細胞間移動的例子。近年來提出了4種黑素小體在黑素細胞和角質形成細胞之間運輸的機制(圖4)[38]。

①細胞吞噬模型(圖4A)：Singh等人[39]通過檢測和跟蹤正在發育的黑素小體表面的蛋白gp100得到證實，角質形成細胞可以吞噬黑素細胞中富含黑素小體的樹突尖端。②膜融合模型(圖4B)：在人類皮膚中，Scott等人[40]研究發現黑素細胞樹突在肌球蛋白Ⅴa的存在下，能夠形成絲狀偽足，隨后有一列單獨的黑素小體沿著絲狀偽足移動，并穿過這個快速形成的通道進入角質形成細胞。③脫落吞噬模型(圖4C)：Wu等人[41]研究報導黑素細胞將黑素小體包裝成珠狀，然后將其轉移在黑素細胞外圍，角質形成細胞隨后捕獲并吞噬這些黑素小球。④胞外分泌內吞模型(圖4D)：黑素細胞通過胞外分泌作用將不含黑素小體膜的黑色素內核釋放到黑素細胞和角質形成細胞之間的細胞外間隙。隨后，黑色素內核通過吞噬作用被角質形成細胞內化，并在核周區域成簇存在[38]。目前多項研究支持黑素小體的轉運主要通過機制3和機制4完成。

3.2.2 轉運關鍵蛋白

最近有研究表明，質膜糖蛋白、凝集素可能調節黑素細胞和角質形成細胞之間黑素小體的識別、相互作用以及物質轉移。Kieda等人發現各種凝集素或新糖蛋白可以抑制人黑色素瘤細胞和鱗狀細胞癌來源的角質形成細胞之間的黑素小體轉移[42-43]。作者通過一種體外模型，用熒光染料(羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯)預先標記黑素細胞，隨后與角質形成細胞共培養，通過共聚焦顯微鏡監測熒光的轉移并通過流式細胞術定量證實黑素小體的轉移。利用該模型系統，證實了Kieda等人的觀察結果，即各種凝集素和新糖蛋白可以抑制黑素小體向角質形成細胞的轉移。此外，也有研究證明了煙酰胺也能抑制黑素小體的轉移[44]。

蛋白激酶受體2（PAR-2）在角質形成細胞吞噬黑素小體的過程中也非常重要。它是質膜上的一種跨膜G蛋白偶聯受體，被絲氨酸蛋白酶在細胞外切割發生自激活[45]。Seiberg等人通過一系列實驗證明，PAR-2受體位于角質形成細胞的膜上，通過激活角質形成細胞對分離的黑素小體[46]或微球[47]的吞噬活性參與黑素小體的轉移從而調節色素顆粒的吞噬量。

3.3 黑素小體在角質形成細胞內的分布

黑素小體在角質形成細胞內的分布根據膚色的不同而不同[48-49]。在深色皮膚的個體中，黑素小體直徑約0.8mm，以單個細胞器的形式存在于角質形成細胞的胞質中。相反，在淺色皮膚的個體中，黑素小體直徑明顯小于0.8mm，并聚集成由4-8個細胞器組成的膜結合簇。目前還不確定這些不同的分布模式是由轉移的黑素小體內的因素決定的，還是由于受體角質形成細胞固有的性質決定。在最近的一項研究中，利用不同膚色的幾組黑素細胞和角質形成細胞，評估了體外皮膚重建模型角質形成細胞中黑素小體的分布，研究人員得出結論，受體黑素小體的分布模式由供體黑素細胞的類型決定[50]。相反，最近在黑素細胞和角質形成細胞共培養中的實驗證明，轉移的黑素小體的分布模式受受體角質形成細胞來源的皮膚類型調節[51]。然而，這兩種實驗方法都相對主觀，因此黑素小體在皮膚中的分布調節問題仍然沒有解決。

4 黑素小體的降解

隨著角質形成細胞的終末分化，受體黑素小體也會發生降解。最終，除極少數出現在顏色非常深的皮膚情況下，當角質形成細胞變成角質細胞后，黑素小體結構將不復存在[52]。

黑素小體的解體是一個漸進的過程。輕度解體的色素顆粒在邊緣出現磨損，附近有黑色素碎片。隨著解體程度的加深，黑素小體出現解體，密度降低。在晚期，黑素小體的基質結構逐漸變得明顯并與黑色素碎片混合[53]。但目前研究發現，除了黑素小體成分可被水解降解，黑素小體中的黑色素部分很難被分解。日本科學家在用溶酶體水解酶處理放射性標記的黑素小體后，注意到黑素小體的脂類快速降解，蛋白質成分緩慢降解，但黑色素部分仍然很穩定[54-56]。有研究表明黑素小體的黑色素部分能在120℃抵抗強鹽酸 72小時[57-58]。在組織學中，黑色素主要是通過用氧化劑如高錳酸鹽[59]或過氧化氫[60]進行色素漂白來去除的。用過氧化氫高溫加熱會使黑色素部分分解，并產生強熒光，可用于黑色素定量[61-62]。但產生的熒光素的性質尚不清楚，目前有人提出熒光表明黑色素聚合物中的結構發生損壞[63]。

5 調節黑素小體形態和內環境的相關基因

除了黑素小體結構蛋白和黑素生成酶外，黑素合成還需要某些轉運蛋白(或離子通道)來優化黑素小體的管腔pH和其他離子(如Cu2+和Zn2+)的濃度。最近，一些定位于黑素小體膜的轉運蛋白的功能已被揭示。

5.1 OCA2

OCA2是眼皮膚白化病的致病基因產物，在黑色素細胞和視網膜色素上皮細胞黑色素生物合成中有著重要作用[64-65]。研究發現OCA2蛋白有12個跨膜結構域，相當于Na+/H+離子泵，OCA2通過泵出H+來維持黑素小體腔內PH，使酪氨酸酶發揮最佳活性來催化酪氨酸產生黑色素[66]。OCA2表達量降低可使黑素小體內PH降低，從而導致酪氨酸酶活性減低，黑色素合成減少[67]。S.Park等[68]通過電鏡觀察發現，下調OCA2的表達，將導致黑素小體形態、結構、數量以及黑色素含量顯著減少。

5.2 P轉運蛋白

P轉運蛋白是一種含有12個跨膜結構域的蛋白，在pink-eyed dilute小鼠和人類眼皮膚白化病2型患者中缺乏。P轉運蛋白的突變影響了黑素小體的酸性、形態和蛋白定位[69-71]?；赑蛋白與某些細菌轉運蛋白的同源性，Brilliant提出P蛋白通過轉運陰離子來抵消未成熟黑素小體中的高質子含量[72]。通過改變管腔內的酸堿度或膜電位，P轉運蛋白缺乏可能影響轉運小泡與靶前黑素小體融合的能力，導致小泡聚集或錯誤靶向溶酶體。

5.3 TPC2

兩孔通道2(Two-pore channel 2，TPC2)也與人類色素沉著疾病有關。據推測，TPC2可以使Na+、Ca2+等陽離子穿過黑素小體膜。已有研究表明抑制TPC2可提高黑素小體的管腔pH值來促進色素沉著。雖然TPC2是通過轉運哪種陽離子來對黑素小體的酸化起作用尚不清楚，但已提出通過Na+或Ca2+外流介導的黑素小體膜電位的增加來調節V-ATPase酸化黑素小體的功能[73-74]。

6 總結

黑素小體是一種特殊的含有黑色素的細胞內細胞器。它在高度樹突化的黑素細胞內發育，從無色素前體開始，到黑色素包被膜包住的階段結束。在表皮黑素細胞中，黑素小體被運輸到樹突的頂端，隨后轉移到鄰近的角質形成細胞（黑素小體轉移到大約36個相鄰的角質形成細胞[75]），角質形成細胞在基底層保留黑色素，并在黑色素移動到皮膚表面分化時將其降解。黑素小體內環境的穩定依賴于OCA2、P轉運蛋白和TPC2等對腔內PH的調控，酸性環境的破壞將會影響酪氨酸酶活性，直接導致黑色素產生受阻。所以以黑素小體為核心黑素小體的形態發生和成熟，黑素小體蛋白的正常轉入，黑素小體的轉運以及其穩定的內環境，都是黑色素合成的基礎條件。因此對黑素小體的正確認識將有助于對色素性疾病的治療提供重要的研究思路和理論指導。