海洋中麻痹性貝類毒素的合成轉化及其影響因素研究進展

宋維佳, 宋秀賢, 俞志明, 李 靖, 張 悅

海洋中麻痹性貝類毒素的合成轉化及其影響因素研究進展

宋維佳1, 2, 3, 4, 宋秀賢1, 2, 3, 4, 俞志明1, 2, 3, 4, 李 靖1, 2, 3, 張 悅1, 2, 3

(1. 中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071；4. 中國科學院大學, 北京 100049)

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)是由某些甲藻產生的一種高毒性神經毒素, 在海洋環境中分布廣、危害大, 可對水產養殖和人類健康造成重大危害；PSTs毒素的毒性大小隨種類和結構的不同有較大差異。迄今, 國內外學者針對PSTs的來源分布、遷移轉化、生物合成及其影響因素等開展了大量的調查研究, 但目前對于藻細胞產毒的生物合成途徑、遺傳學特征及其環境調控機理等研究仍處于起步階段。PSTs的生物合成過程不僅與藻細胞自身生長階段有關, 還會受到光照、溫度、營養鹽等多種環境因素的影響, 環境條件的改變會引起藻細胞毒素組成和含量發生不同程度的變化。近年來, 研究人員應用基因組學和蛋白質組學技術, 發現了產生PSTs的典型甲藻——亞歷山大藻()細胞內與PSTs毒素生物合成相關的某些基因或蛋白質, 對我們更清晰地了解亞歷山大藻產生PSTs毒素的機制具有重要意義。本文綜合以往的研究報道, 對亞歷山大藻中PSTs的生物合成與轉化及其主要影響因素進行了總結, 以期為產毒有害藻華的防治提供科學依據。

甲藻; 麻痹性貝類毒素; 生物合成; 環境因素

隨著人類活動影響的加劇, 有害藻華已經成為一種全球性的海洋生態問題, 且呈現出暴發規模加大、持續時間更長、致災效應加重、全球擴張明顯等特點[1], 對海洋生態系統的平衡、人類的健康與安全構成嚴重威脅。尤其值得注意的是, 近年來有害藻華的原因種呈現出向甲藻類、有毒藻類演變的趨勢, 有毒甲藻藻華頻繁暴發。其中, 亞歷山大藻()是我國近海較為常見的、能夠產生麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)等多種藻毒素的甲藻類群, 2002—2017年間, 在我國近海形成了24次赤潮[2], 同時歐洲、北美等全球范圍內多個海域也曾多次暴發該藻藻華。不僅破壞了海洋生態環境, 還給海水養殖業和濱海旅游業造成巨大的經濟損失。更為嚴重的是, 當海域中暴發有毒亞歷山大藻藻華后, 由藻細胞合成的PSTs毒素將通過食物鏈的生物放大作用(如貝類等濾食有毒藻細胞后, 毒素可在其體內積累), 最終進入食物鏈頂端的人類體內。其帶有正電荷的胍基基團可以與電壓門控鈉離子通道的羧基基團發生相互作用, 阻斷鈉離子通過神經細胞膜, 影響正常的動作電位形成, 進而阻斷神經傳導, 對神經系統產生麻痹作用, 從而導致中毒, 甚至造成死亡。

從全球范圍看, 近年來PSTs中毒事件顯著增加, 分布區域和影響范圍迅速擴散, 對海洋生物乃至人類健康與安全構成了嚴重威脅。20世紀70年代以前, PSTs僅在北美、日本、歐洲沿海海域有所分布, 有記錄的PSTs中毒事件約為1 600人次; 而到2009年, 在環北太平洋沿海地區、歐洲沿海、美國東海岸、澳大利亞、北美南部等幾乎全球范圍內均有PSTs的分布[3]。據估計, 近年來全球范圍內每年發生約2 000起PSTs中毒事件, 人員死亡率約為15%[3-4], 已成為全球性的公共健康問題。在我國的廣東沿海、福建沿海、長江口鄰近海域、海州灣、北黃海和河北秦皇島近岸等海域PSTs問題也較為突出[5]。

海洋中PSTs毒素的生物合成受到營養鹽、溫度、光照等諸多外界環境因子的影響, 處于不同環境條件下的藻細胞其毒素的組成和含量是不同的。另外, 一些研究結果表明不同生長階段、不同細胞周期的亞歷山大藻細胞內毒素含量也有差異, 毒素的生物合成是一個不連續的過程, 這說明藻細胞的產毒情況與其自身的生長情況密切相關[6-7]。

目前, 雖然亞歷山大藻產毒機制已成為有害藻華研究領域中的一個熱點, 但對于藻細胞產毒的環境調控機理、生物合成途徑和遺傳學機制等方面的研究仍處于起步階段。近年來隨著基因組學和蛋白質組學技術的發展, 針對PSTs的生物合成研究取得了一些新的進展, 學者們篩選鑒定出亞歷山大藻細胞內與毒素生物合成相關的某些基因或蛋白質, 對揭示亞歷山大藻毒素的生物合成途徑具有重要意義。本文基于國內外大量研究對亞歷山大藻中PSTs毒素的生物合成與轉化、外界環境因素對其影響等進行了綜述, 將為揭示PSTs毒素的產生及其環境因素之間的關系提供理論指導, 對于產毒甲藻赤潮的有效防治、保障人類健康和海洋生態安全具有重要意義。

1 海洋中PSTs的來源

海洋環境中PSTs毒素主要來源于亞歷山大藻和裸甲藻, 已知的能夠產生PSTs的藻類包括塔瑪亞歷山大藻()、鏈狀亞歷山大藻()、微小亞歷山大藻()、鏈狀裸甲藻()等。近年來, 隨著城市化和工業化進程的加劇, 在沿海區域經濟快速發展的同時, 近岸海域富營養化問題日益顯現。富營養化不僅表現為海水中營養物質含量的劇烈升高, 更為嚴重的是海水中營養物質的結構也發生明顯的變化, 如N、P、Si三種主要營養鹽之間的比例發生改變, 尿素等有機態營養物質在總營養物質中所占比例上升等[8]。水體中營養物質結構的改變會導致浮游植物優勢類群的更替, 一些有毒甲藻在浮游植物群落中占據優勢, 在藻細胞快速繁殖的同時產生大量藻毒素。

亞歷山大藻屬中約有30余個藻種, 其中至少一半可以產生PSTs毒素。盡管不同藻種以及同一藻種的不同株系均具有不同的產毒特性, 甚至同一株系藻細胞在不同的環境條件下的產毒特征也有所差異, 但亞歷山大藻屬的產毒種所產生的PSTs毒素種類相對穩定, 主要可以產生兩類PSTs毒素: 氨基甲酸酯類毒素和N-磺酰氨甲?；惗舅豙9]。另外, 研究表明, 不僅亞歷山大藻營養細胞能夠產生毒素, 其在不利環境下形成的孢囊也具有較強的產毒能力[10]。濾食性貝類攝食游動細胞和孢囊都會引起PSTs在其組織內的積累。而鑒于PSTs較強的水溶性特征, 自然水體中往往也存在一定含量的溶解態PSTs毒素, 已有報道表明美國、葡萄牙等近海海域均出現過水體中PSTs高于產毒藻細胞內PSTs含量的情況[11-13]。另有研究表明, 被產毒藻釋放到胞外水體的這部分毒素對于水生生物仍具有顯著危害[14]。

多項研究發現, 貝類生物體內的PSTs含量與水體中亞歷山大藻營養細胞密度、表層沉積物中孢囊的分布與豐度具有顯著的正相關關系[15-17]。貝類生物通過濾食藻類攝入的PSTs在其體內不斷累積, 當達到一定濃度后會引起貝類生物發生殼瓣閉合反應、耗氧反應、足絲反應、心搏, 以及神經生理反應和攝食反應, 甚至影響到存活[18]。另一方面, 學者們深入分析了貝類、魚類生物體內抗氧化酶系統對攝入PSTs毒素的響應。結果表明, 在攝入一定的PSTs毒素后, 貽貝、蝦夷扇貝()、鱸魚()等生物體內的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽硫轉移酶(GSTs)等酶活性均受到不同程度的激活[19-21]。這說明PSTs毒素進入貝類、魚類等生物體內后將誘導產生大量的活性氧自由基, 進而導致脂質過氧化損傷, 對貝類、魚類生物產生一定的毒害作用。更為嚴重的是, 該毒素若通過食物鏈向更高營養級生物傳遞將會對人類的生命健康與安全造成嚴重威脅。

PSTs作為一類由石房蛤毒素(saxitoxin, STX)及其衍生物組成的生物毒素, 其對海洋生物及人類的毒性效應隨毒素的種類和結構的不同有較大差異。了解產毒藻和其他海洋生物體內PSTs的種類、結構的動態變化, 對于評估有害藻華暴發海域PSTs毒素污染的危害性至關重要。

2 PSTs的化學結構與相互轉化

PSTs毒素是一類四氫嘌呤的衍生物, 其結構上的4個位點(R1-R4)可以發生乙?；?、磺?；?、羥基化、氨甲?；榷喾N取代反應(見圖1)。

根據R4基團的不同可以將常見的PSTs毒素分為4類: 1) 氨基甲酸酯類毒素(carbamate toxins), 包括STX、新石房蛤毒素(neosaxitoxin, neoSTX)和膝溝藻毒素1-4(gonyautoxin 1-4, GTX1-4); 2) 脫氨甲?；惗舅?decarbamoyl toxins), 包括脫氨甲?；扛蚨舅?decarbamoyl saxitoxin, dcSTX)、脫氨甲?；率扛蚨舅?decarbamoyl neosaxitoxin, dcneoSTX)和脫氨甲?；显宥舅?-4(decarbamoyl gonyautoxin 1-4, dcGTX1-4); 3) N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfocarbamoyl toxins), 包括膝溝藻毒素5-6(gon-yautoxin 5-6, GTX5-6)和N-磺酰氨甲?；显宥舅?-4(N-sulfocarbamoylgonyautoxin 1-4, C1-4); 4)脫氧脫氨甲?；惗舅?deoxydecarbamoyl toxins), 包括脫氧脫氨甲?；扛蚨舅?deoxydecarbamoyl saxitoxin, doSTX)和脫氧脫氨甲?；显宥舅?-3 (deoxydecarbamoyl gonyautoxin 2-3, doGTX2-3)(見表1)。

表1 不同種類PSTS的毒性和結構

注: STX: 石房蛤毒素; neoSTX: 新石房蛤毒素; GTX: 膝溝藻毒素; dcSTX: 脫氨甲?；扛蚨舅? dcneoSTX: 脫氨甲?；率扛蚨舅? dcGTX: 脫氨甲?；显宥舅? C, N-磺酰氨甲?；显宥舅? doSTX: 脫氧脫氨甲?；扛蚨舅? doGTX: 脫氧脫氨甲?；显宥舅?/p>

取代基的差異導致不同種毒素的毒性水平呈現出多樣化[22-23]。其中, 氨基甲酸酯類毒素具有較高的毒性, STX和neoSTX的毒性最高; N-磺酰氨甲?；惗舅? 包括GTX5-6和C1-4, 毒性最低。

多項研究表明, 有毒藻和以其為食的貝類生物兩者體內PSTs的組成及其相對含量有所差異。比如Kwong等研究了暴露于產毒甲藻的貝類體內毒素情況, 發現這些以微藻為食的貝類生物體內毒素組分與藻細胞相似, 但各組分相對含量卻存在較大差異,藻細胞內的PSTs以N－磺酰氨甲?；惗舅?C1&2)為主, 其含量占PSTs總含量的66.6%, 氨基甲酸酯類毒素(GTX1-4、STX、neoSTX)只占PSTs總含量的33.4%; 而在貝類生物體內, C1&2毒素相對含量明顯降低, 氨基甲酸酯類毒素(GTX1-4、STX、neoSTX)所占比例升高至53.0%[24]。生物攝食含有毒素的亞歷山大藻后, 其體內的酶可促進不同結構、不同種類的PSTs發生相互轉化[25-27]; 學者還從蟹、貽貝、牡蠣等多種生物體內篩選出可促進PSTs相互轉化的細菌[28-30]。也就是說不同結構的PSTs毒素可在生物體內某些酶或細菌的作用下發生轉化, 從而導致產毒藻和以其為食的其他海洋生物兩者體內PSTs的含量和組成有較大差異。另外, 部分研究表明在某些不存在酶或細菌的條件下, PSTs基團也可以發生改變從而導致不同結構PSTs之間發生相互轉化, 且其轉化速率受到pH和溫度的影響, 這說明PSTs之間的轉化還包括一些不依賴于酶或細菌即可發生的化學過程[31]。

總結前人的研究結果, 不同結構PSTs之間的轉化方式主要包括以下幾種(見圖2)。

注: STX: 石房蛤毒素; neoSTX: 新石房蛤毒素; GTX: 膝溝藻毒素; dcSTX: 脫氨甲?；扛蚨舅? dcGTX: 脫氨甲?；显宥舅? C: N-磺酰氨甲?；显宥舅?/p>

1) N－磺酰氨甲?；惗舅乜梢悦摰?1位N原子上的磺酸基, 生成相應的氨基甲酸酯類毒素, 如: C1→GTX2, C2→GTX3, GTX5→STX等[32-33]。該反應除在貝類組織內發生外, 在沒有酶或細菌的水體中也可發生, 轉化速率隨著溫度和pH的升高而加快[31]。由于氨基甲酸酯類毒素的毒性遠遠高于N－磺酰氨甲?；惗舅? 這一轉化將使PSTs的總毒性升高4～10倍[34]。

另外, N－磺酰氨甲?；惗舅匾部梢悦摰艋酋０奔柞；D化為相應的脫氨甲?；惗舅? 如: C1→dcGTX2, C2→dcGTX3, GTX5→dcSTX等。這類轉化一般只發生于某些貝類的組織中[25]。

2) 在某些可利用PSTs作為碳源的細菌作用下, 氨基甲酸酯類毒素可以脫掉氨基甲?；鶊F, 生成對應的脫氨甲?；惗舅? 如: GTX2&3→dcGTX2&3等。這一轉化導致PSTs的毒性降低, 常常發生于貝類生物體內[30]。

3) 氨基甲酸酯類毒素可以在磺基轉移酶(sulfo-transferase)的作用下發生磺化反應, 一分子磺酸基團被轉移到21位N原子上, 生成毒性相應較低的N-磺酰氨甲?；惗舅? 如GTX2→C1, GTX3→C2, STX→GTX5 等[35]。這一類轉化可在亞歷山大藻細胞內大量發生, 被認為是C類毒素的合成路徑。

4) 11位C原子上的R2、R3基團可發生空間異構化。PSTs在有毒藻和貝類體內可以發生由不穩定的β異構體向穩定的α異構體的轉化, 如C2→C1, GTX3→GTX2, GTX4→GTX1等[24], 最終兩種異構體的比例一般約為α∶β=3∶1[25]?？梢岳眠@一比例來判斷貝類生物染毒時間的長短; 此外, Jones 等利用藻細胞毒素提取物, 配置成pH=7的毒素溶液在25 ℃下進行了孵育實驗, 90 d后α、β異構體的比例由0.8增長至2.0[31], 也即PSTs在水體中也可發生由β異構體向α異構體的轉化。

5) 在sp、sp等某些細菌的作用下, PSTs毒素1位N原子上發生脫羥基過程, 11位C原子上的硫酸酯基團也可以被消除, 完成毒素之間的轉化, 如GTX1→GTX2, GTX4→GTX3, C1&2→GTX5, neoSTX→STX, GTX1-4→STX、neoSTX等[28-30, 36-37], 這一轉化在厭氧環境中具有更高的轉化速率。貝類中的一些天然還原劑, 如谷胱甘肽和半胱氨酸, 也可以介導該還原性反應[33]。研究發現在改性粘土去除有毒藻的過程中, 沉積物-海水環境中也會發生高毒性組分GTX1&4向低毒性組分GTX2&3的轉化[38]。

另外, 氯化處理和臭氧處理能夠有效促進水體中的PSTs轉化為無毒性的物質[40-42], 其機理是促進PSTs的氧化降解, 這一原理被廣泛應用于水源受PSTs污染的飲用水處理中。

3 PSTs的生物合成

關于甲藻中PSTs合成轉化途徑, 主要存在兩種學術觀點: 一種是Sako等提出的“STX-GTX-C”合成路線, 即在甲藻細胞中首先由前體物合成STX, 在磺基轉移酶的作用下轉化GTX2&3, 并進一步轉化生成C1&2毒素[43]; 另一種是Taroncher-Oldenburg等提出的“C-GTX-STX”合成路線, 即甲藻細胞中前體物首先構建C1&2毒素, 并在酶的作用下轉化生成GTX2&3, GTX2&3進一步發生酶促反應轉化為STX[6]。近年來, 隨著基因組學和蛋白質組學的迅速發展, 學者們發現了藻細胞中與PSTs生物合成相關的基因簇, 并對由基因編碼的多種酶的功能進行了推定, 從分子水平上佐證了甲藻細胞中“STX- GTX-C”合成轉化路線的存在。

3.1 STX-GTX-C生物合成途徑

Shimizu利用同位素標記前體物進行產毒甲藻的培養實驗, 提出了精氨酸、乙酸鹽與甲硫氨酸作合成前體的推測, 首次提出了STX生物合成路線[44]。STX在一系列修飾酶的作用下, 通過轉移羥基、氨基甲酰、磺酰等基團, 轉化為其他PSTs毒素。Shimizu等還提出了一個可能的關鍵步驟: PSTs的骨架是由一個乙酸單元或衍生物與精氨酸或其前體在α碳上經過克萊森縮合反應形成的[45]。

Yoshida等在鏈狀亞歷山大藻()中分離純化到一種硫轉運酶(sulfotransferase, ST), 該酶通過催化磺酸化過程, 將STX轉化為GTX5, 將GTX2&3轉化為C1&2[46]。Sako 等在一種裸甲藻()中報道了兩種硫轉運酶: N-ST和O-ST。N-ST可以將STX轉化為GTX5, GTX2&3轉化為C1&2; O-ST可以將11-α, β羥基石房蛤毒素轉化為GTX2&3[43]。同時, Sako等在研究中發現,藻細胞中C1&2毒素約占毒素總含量的65%, GTX5和GTX1&4分別占毒素總含量的25%和10%, 而未檢測到STX、neoSTX、11-α, β羥基石房蛤毒素的存在, 由此推測硫轉運酶將大量其他毒素轉化為C毒素。Sako等在此基礎上提出了毒素的生物合成與轉化途徑: 前體物首先合成STX, STX的11位C原子上發生氧化反應生成11-α, β羥基石房蛤毒素, 并在O-ST的作用下轉化為GTX2&3, 而后經過N-ST的催化以PAPS為磺基供體發生磺酸化反應生成C1&2; 或者STX在N-ST的作用下直接發生磺酸化反應轉化為GTX5[43]。

然而在上述對于PSTs合成轉化途徑的推測中, 未能對毒素合成的直接前體物、參與毒素合成轉化的基因和功能酶等進行系統的闡述, 因此該PSTs的生物合成轉化途徑未能形成定論。而在此前, Taroncher- Oldenburg等通過研究細胞周期不同階段的產毒情況, 提出了與之相反的“C-GTX-STX”合成轉化路線[6], 難以判定這兩種途徑哪一種更接近實際情況。直到近年來, 學者們發現了藻細胞中與PSTs生物合成與轉化相關的基因簇和多種功能酶, 為藻細胞中STX-GTX-C合成轉化途徑的存在提供了直接證據。

3.2 與PSTs合成相關的基因和蛋白質

隨著基因組學和蛋白質組學的迅速發展, 對于PSTs合成機制的研究逐漸深入到基因和蛋白質的水平, 為研究PSTs的生物合成轉化途徑提供了新的證據。

與藍藻相比, 甲藻的基因組更為龐大, 基因調控更為復雜, 因此PSTs生物合成分子水平的研究在藍藻中起步較早。2008年, Kellmann等率先在藍藻T3中發現了用于STX生物合成的基因簇, 提出了由功能酶系催化的 PSTs 生物合成途徑[47], 為闡明甲藻中PSTs的產生機制和生物合成途徑奠定了基石。在該合成途徑中, 首先在的參與下, 精氨酸與乙?；l生克萊森縮合反應, 產生中間產物 A; 然后編碼脒基轉移酶, 將另一分子精氨酸的脒基轉移到上述產物A上, 得到中間產物B; 新產物B經過由編碼的胞嘧啶核苷脫氨酶的作用, 形成含有雜環的化合物C; 隨后在編碼的甾醇脫飽和酶類作用下, 產物C末端兩個碳原子間形成雙鍵, 然后編碼產生酮戊二酸依賴的雙加氧酶, 在其催化下雙鍵兩端的碳原子發生環氧化反應形成環氧基團, 該環氧基團在上述酶作用下繼而形成醛基。經過所編碼的乙醛還原酶的作用, 醛基被還原為羥基, 至此完成PSTs基本骨架的構建。隨后在編碼的末端加氧酶、編碼的O-氨甲酰轉移酶等酶的催化下發生一系列反應, 形成目標產物STX。在此基礎上, 產物STX在、、、等多種基因的參與下發生一系列反應, 完成向neoSTX、GTX2&3等多種PSTs的轉化。

隨后基因簇在其他幾種合成PSTs的藍藻中相繼被鑒定出來[48-50], 這種PSTs的合成路線得到了廣泛認可與接受, 但針對甲藻中PSTs產生機制與合成途徑的研究, 受限于甲藻龐大的基因組和較高的基因拷貝數, 目前仍然處于起步階段。

2011年, Stüken等發現了甲藻中第一個與PSTs合成相關的基因——, 驗證了STX生物合成途徑在甲藻中的存在[51]。同時發現中存在的長短兩種轉錄本, 長轉錄本與藍藻一樣包含全部功能位點(: 活性腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶;: 乙?；D移酶;: 乙?；d體蛋白;: 氨基轉移酶), 而短轉錄本只包含的功能位點; 通過對產毒甲藻和無毒甲藻進行比較, 發現和與甲藻中PSTs毒素的合成密切相關[51]。另一個與PSTs合成相關的基因——也在甲藻中被成功鑒定出來[52]。值得注意的是在一些無毒甲藻中也存在, 因此推測在細胞內除了參與毒素合成外可能還參與其他一些生物學過程。隨后, Hackett等在中鑒定出多種與PSTs合成相關的基因, 如直接參與STX合成的基因、、、、、, 參與STX向其他結構PSTs轉化的基因, 如、、, 以及PSTs轉運相關的基因等[53]。Zhang等在針對及其無毒突變體的研究中, 成功鑒定到與PSTs轉化相關的基因和PSTs合成的調控基因, 為更清晰的認識甲藻中PSTs的合成路徑做了進一步的補充與完善[54](見圖3)。

目前, 關于產毒甲藻中PSTs合成機制的研究在基因水平已取得了較大進展, 但PSTs合成過程中直接發揮作用的是其翻譯后的蛋白質, 且細胞內包括毒素合成在內的許多生理生化過程是由轉錄后調控的。因此, 蛋白質水平的研究對揭示細胞中PSTs的合成機制具有更為直接的意義。

學者利用2-DE技術對比研究了亞歷山大藻產毒株和不產毒株, 鑒定到毒素指示蛋白——T1, 然而這一蛋白在毒素合成中的具體功能和作用尚不清晰[55-56]。Wang等對比了亞歷山大藻產毒株和不產毒株的蛋白質特征, 發現與產毒株相比有34種蛋白質在不產毒株表現為下調, 56種蛋白質表現為上調; 在這些差異表達蛋白中有多個可能與毒素合成直接相關, 如表達的聚酮合酶(polyketide synthase)、表達的組氨酸激酶(histidine kinase)以及表達的分子伴侶類似蛋白(chaperone-like protein)等蛋白質在不產毒株中的表達被顯著抑制[57]。另外, Wang等通過比較不同時期產毒亞歷山大藻的蛋白質組,篩選出了9個可能與甲藻PSTs合成相關的蛋白質, 分別為: 甲硫氨酸S-腺苷轉移酶(methionine S-adenosyltransferase, MAT)、S-腺苷高半胱氨酸酶(S-adenosylhomocysteinase, SAH)、腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase, AdoHcy)、無機焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase, PPi)、鳥氨酸氨甲?；D移酶(ornithine carbamoyltransferase, OTC)、磺基轉移酶(sulfotransferase, SULT)、醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶(ferredoxin-NADP+reductase, FNR)、精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase, ADI)[58]。

然而, 盡管蛋白質組學技術的發展為甲藻PSTs合成途徑的研究提供了更為直接的工具, 但這些產毒相關蛋白質與基因的關系及它們在PSTs合成中的具體功能及作用尚待確定, 甲藻PSTs合成的具體途徑仍待進一步完善。

4 影響PSTs合成的環境調控因素

甲藻PSTs的生物合成過程會受到溫度、營養鹽、光照等多種外界環境因素的影響, 環境條件的改變會引起藻細胞毒素的組成和含量發生不同程度的變化。目前受限于對PSTs生物合成機制的了解不足, 對于環境因素對藻細胞毒素合成的影響, 雖然國內外有較多的報道, 但在具體的調控機制方面尚需進一步研究。

4.1 溫度對PSTs合成的影響

許多研究考察了溫度對PSTs生物合成的影響。如Anderson等對比了在8 ℃和15 ℃下的生長情況和毒素含量, 發現在8 ℃下細胞內毒素含量、精氨酸含量均顯著升高, 且毒素含量與精氨酸含量隨著時間呈現出相反的變化趨勢[59]。因此, 推測低溫一方面可能通過抑制藻細胞蛋白質合成, 使細胞內積累了大量精氨酸, 而大量精氨酸的積累可能促進藻細胞毒素的合成; 另一方面低溫降低了藻細胞分裂速率, 細胞在生長周期中有更長的時間用于毒素的合成, 有利于藻細胞內毒素的積累[59]。然而, Hwang等對不同溫度下的生長和產毒情況進行了研究, 發現在25 ℃生長的藻細胞總毒素含量和單細胞毒力水平均遠遠高于10 ℃和30 ℃下生長的微藻, 有關作用機制尚不清楚[60]。

注: 紅色實線框表示基因編碼的催化酶或結構域; 黑色球形表示PSTs組分; SAM: S-腺苷甲硫氨酸; SAH: S-腺苷高半胱氨酸; arginine: 精氨酸; ornitine: 鳥氨酸; adenylylsulfate: 腺苷酰硫酸; PAPS: 3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸; STX: 石房蛤毒素; GTX: 膝溝藻毒素; dcSTX: 脫氨甲?；扛蚨舅? C: N-磺酰氨甲?；显宥舅?/p>

此后, 多項研究結果也均表明產毒亞歷山大藻在某一適當溫度條件下會產生大量PSTs, 過高或過低的溫度條件均會導致毒素含量的降低[61-62]。溫度對藻細胞產毒的影響, 可能是因為過高或過低的溫度會影響產毒藻的生長及體內的產毒酶促反應, 從而引起產毒的變化。

4.2 氮對PSTs合成的影響

從PSTs的化學結構可以看出, N是構成PSTs的主要元素, 占其分子量的30%。充足的N有利于藻細胞積累大量精氨酸, 作為毒素合成的前體物, 有利于藻細胞毒素的合成; 而N限制時, 轉運蛋白和酶等富含氮的細胞化合物的合成減少, 藻細胞內的精氨酸含量也大量減少, 這些精氨酸主要被藻細胞的生長等代謝活動所利用, 無法參與毒素的合成, 因此氮限制將同時減少藻細胞分裂和毒素的合成。

多項研究結果表明, 隨著N濃度的升高, 亞歷山大藻單位細胞毒素含量升高[63-65]。Anderson等指出與氮限制的培養環境相比, 在氮營養鹽充足時,藻細胞密度和單位細胞的毒素含量明顯升高[59]。Leong等的研究也發現, 隨著硝酸鹽濃度從6 μmol/L增加到100 μmol/L,的單細胞毒素含量也隨之增加[65]。Waal等分別在氮限制和營養鹽充足的環境對進行了培養, 結果表明, 氮限制環境下生長的微藻毒素含量與氨基酸的含量均明顯低于對照組, 且PSTs含量與細胞N∶P比值、細胞精氨酸含量均有很好的相關性, 因此PSTs的合成與細胞內的氨基酸含量尤其是精氨酸的含量密切相關, 而精氨酸的合成依賴于氮的同化[66]。

另外, 研究表明銨鹽和硝酸鹽這兩種不同類型的N營養鹽對亞歷山大藻產生PSTs的影響有一定差異[67-68]。以銨鹽為氮源的亞歷山大藻的毒素含量要明顯高于以硝酸鹽為氮源, 這可能是因為在硝酸鹽下生長的藻細胞, 其胞內毒素合成對于N的利用還要受到硝酸還原酶的限制。但以銨鹽為氮源培養的藻細胞內, 氮含量與毒素含量無明顯關系, 而以硝酸鹽為氮源培養的藻細胞內, 氮含量與毒素含量成明顯正相關關系, 毒素生物合成速率受硝酸鹽還原速率的限制。

4.3 磷對PSTs合成的影響

磷營養鹽在甲藻細胞代謝和生長中起著重要的作用, 充足的磷有利于促進藻細胞分裂和生長。環境中的磷濃度也可間接影響藻類PSTs毒素合成, 很多研究表明, 藻細胞內毒素含量隨著環境中磷含量的升高而降低, 磷限制可以導致亞歷山大藻細胞內毒素含量顯著增加[69-71]。因為磷含量的升高會導致細胞N∶P比率暫時下降, 當環境中磷含量較高時, 細胞可能會將大多數氮優先分配給含磷化合物的合成, 因此, 可以用于PSTs合成的N減少, 從而導致在磷充足的條件下藻細胞內毒素含量降低這一現象的出現。

而當環境中磷限制時, 藻細胞的分裂活動減慢或停止, 藻細胞內會出現大量氮過剩的現象, 毒素的合成過程在氮源充足的情況仍可繼續進行, 合成的毒素在細胞內持續積累, 從而導致磷限制時細胞內的毒素含量顯著升高。另外, 研究發現, 在磷限制的環境條件下, 藻細胞內過剩的氮主要以銨鹽的形式存在。過量的銨鹽積累對藻細胞自身造成毒害作用, 藻細胞為了緩解對自身的毒害作用, 會激活精氨酸的合成[72]。而精氨酸是PSTs生物合成的重要前體物質, 這也是導致在磷限制環境條件下藻細胞內毒素含量升高的原因之一。

4.4 其他因素對PSTs合成的影響

多項研究表明, 藻細胞毒素含量與光照強度呈現出正相關關系[60-61, 73-74], 足夠的光照對于甲藻細胞內PSTs的合成至關重要。Hwang等通過研究不同光照條件下的產毒情況, 發現在240 μE?m–2?s–1光照強度下, 單細胞毒素含量明顯高于120 μE?m–2?s–1下單細胞毒素含量[60]。這是因為很多甲藻作為光合自養生物, 毒素及其前體物質的合成需要足夠的光照為其提供能量[73]。

另外, 還有研究表明, 秋水仙素能夠抑制亞歷山大藻細胞分裂和PSTs產生, 但其分子機理尚不清楚。Zhang等利用iTRAQ技術進一步研究秋水仙素處理后藻細胞內蛋白質組的變化, 結果同樣表明, 經過秋水仙素處理的藻細胞內毒素含量明顯低于對照組毒素含量, 且細胞內多種蛋白質發生差異表達[75]。然而, 有趣的是經秋水仙素處理的藻細胞內與毒素合成有關的蛋白質表達量與空白組相比無明顯差異, 這說明毒素的合成可能受到翻譯后調控[75]。

5 結語與展望

PSTs毒素在海洋中分布廣、危害大, 對海洋生物乃至人類健康與安全構成了嚴重威脅, 其毒性大小隨種類和結構的不同有較大差異。不同結構PSTs毒素在一定條件下可以發生相互轉化, 了解產毒藻和其他海洋生物體內PSTs種類、結構的動態變化, 對于評估有害藻華暴發海域PSTs毒素污染的危害性至關重要。另外, 甲藻中PSTs毒素的生物合成是一個非常復雜的過程, 受到環境脅迫、基因調控等多種外界因素和內在因素的共同作用, 目前對于藻細胞產毒的生物合成途徑、遺傳學特征及其環境調控機理等研究仍處于起步階段。深入了解PSTs合成機制及其影響因素, 將為有害藻華的監測與防治提供新思路, 對減少有害藻華的危害、保障人類健康和海洋生態安全具有重要意義。

總結已有研究成果, PSTs毒素還存在以下值得深入研究的方面:

1) PSTs毒素帶有正電荷的胍基基團可以與電壓門控Na+通道的羧基基團相互作用, 阻斷鈉離子通過神經細胞膜, 進而阻斷神經傳導, 理論上具有麻醉、鎮痛的作用, 是一種具有醫學應用潛力的鈉離子通道阻斷劑。在今后的研究中可以此特性為出發點, 深入挖掘其醫用價值。

2) 近年來針對PSTs生物合成途徑的研究已取得了一些進展, 發現了與毒素合成相關的部分基因, 但仍需要進一步研究與探討, 譬如這些基因在毒素合成過程中的具體功能和作用, 毒素的生物合成在分子水平上是如何運作的, 環境因素影響毒素合成的分子機理等, 這些問題需要進一步完善。

3) PSTs合成過程中直接發揮作用的是其翻譯后的蛋白質。因此, 蛋白質水平的研究對揭示細胞中PSTs的合成機制具有更為直接的意義。目前已經鑒定出部分產毒相關的蛋白質, 但這些蛋白質與基因的關系及它們在PSTs合成中的具體功能及作用尚待確定, 甲藻PSTs合成的具體途徑仍待完善。

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Research progress on the biosynthesis, transformation, and factors affecting paralytic shellfish toxins in the ocean

SONG Wei-jia1, 2, 3, 4, SONG Xiu-xian1, 2, 3, 4, YU Zhi-ming1, 2, 3, 4, LI Jing1, 2, 3,ZHANG Yue1, 2, 3

(1. Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Paralytic shellfish toxins (PSTs) are highly toxic neurotoxins produced by dinoflagellates. They are widely distributed in the marine environment and can cause great harm to aquaculture animals and human health. The toxicity of PSTs varies greatly with type and structure. Many studies have been conducted on the source, distribution, transformation, biosynthesis and factors influencing paralytic shellfish toxins. However, studies on the environmental regulatory mechanism, the biosynthetic pathway, and the genetic characteristics of toxin production are still rare. The biosynthesis of PSTs is affected by many environmental factors, such as light, temperature, and nutrients. A change in environmental conditions will change the composition and content of the toxins to varying degrees. Some researchers have used genomics and proteomics techniques to screen and identify genes or proteins related to the biosynthesis of toxins in. It is important to understand the biosynthetic pathway oftoxins more clearly. Based on the toxin-producing physiology of, this study summarizes the biosynthesis and transformation of the PSTs inand the main factors affecting synthesis to provide new ideas for preventing and controlling harmful algal blooms, reducing the damage of harmful algal blooms, and ensuring human health and marine ecological security.

dinoflagellates; paralytic shellfish toxins; biosynthesis; environmental factors

Oct. 1, 2020

Q-1

A

1000-3096(2022)09-0117-13

10.11759/hykx20201001001

2020-10-01;

2020-11-28

國家自然科學基金項目(41976148); 山東省重大科技創新工程項目(2019JZZY010808); 2019年度“泰山學者攀登計劃”(泰山學者工程專項經費資助)

[The National Natural Science Foundation of China, No. 41976148; the Key R&D Project of Shandong Province, No. 2019JZZY010808; The Taishan Scholars Climbing Program of Shandong Province of the Year 2019]

宋維佳(1997—), 女, 山東日照人, 碩士研究生, 主要從事海洋生態學研究, 電話: 0532-82898985, E-mail: songwj178@163.com; 宋秀賢,通信作者, 電話: 0532-82898587, E-mail: songxx@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)