具有“核殼”結構的乳清分離蛋白-黃原膠復合顆粒的構建

李夢飛，李博睿，孫夢雅，陳存社，李 赫，劉新旗，龐志花

（北京工商大學食品與健康學院，北京 100089）

隨著生活水平的提高，人們對健康越來越重視，對低脂食品的需求也越來越大，食品行業一直非常關注低脂產品的開發。由于去除脂肪后的食品外觀、風味、口感和質地的不良變化，消費者對低脂食品的接受度往往不高。而脂肪替代物是在保證食品的安全性和感官品質的基礎上，部分或全部替代脂肪，降低食品的總熱量，滿足消費者對低脂低熱量的健康需求的物質。

可用于替代脂肪的潛在添加劑是基于多糖或蛋白質的脂肪替代品，例如角叉菜膠、黃原膠（xanthan gum，XG）、瓜爾膠、魔芋、改性淀粉、膳食纖維、大豆分離蛋白和乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）。多糖由于良好的親水性可以改善食品中水相的結構，將水穩定為凝膠狀的三維網狀結構，并截留大量水分，被截留的水分具有很好的流動性，進而改善食品的體積、黏度和結構，產生類似脂肪的口感。蛋白質通過微?；幚?，形成納米或微米級的球形蛋白顆粒，在液體和半固體食品基質中起到“滾珠軸承”的潤滑性能，從而產生乳脂狀的口感。但蛋白質在高溫下結構具有不穩定性、易變性，導致顆粒的尺寸變大，影響其功能特性。而蛋白質與離子型多糖可以通過靜電相互作用，復合形成具有“核（蛋白顆粒）-殼（多糖）”結構的高度結構化生物聚集物，這種復合物的形成可以有效控制蛋白質的熱聚集。蛋白質/多糖復合物的研究目前備受關注，用于功能成分的遞送、乳液的穩定、控制食品的結構、質地和穩定性特征等。高效構建具有良好“核殼”結構的特定尺寸的復合物顆粒是該領域研究的基礎。

WPI是乳制品工業中的副產物，由牛乳除去酪蛋白后得到乳清蛋白，再經進一步加工處理得到的，純度超過90%。WPI具有良好的凝膠特性、乳化性，被廣泛應用于食品與藥品中。謝彩鳳等分析了不同電解質對變性WPI初級團聚體的團聚動力學的影響，發現膠粒穩定性與電解質離子類型和濃度密切相關；舒蒙等通過對WPI和阿拉伯膠（gum arabic，GA）進行熱處理，使蛋白在聚集過程中與GA纏繞，形成穩定的WPI/GA復合物顆粒，也改善了WPI/GA分子內復合物的pH值敏感性。

黃原膠（xanthan gum，XG）是一種由黃單胞菌屬經有氧發酵產生的細胞外雜多糖，是一種陰離子多糖，其帶有負電荷的三糖側鏈環繞主鏈，使分子結構相當牢固，對熱、酸和堿都具有非常好的穩定性，并具有良好的水溶性、獨特的流變學特性，可作為增稠劑、穩定劑、乳化劑等，在食品、醫藥領域得到了廣泛使用。Be Rtrand等研究pH值、GA添加量和NaCl對WPI-GA凝膠形成的影響，發現在不同條件（pH值、離子強度等）下獲得的混合凝膠類型將允許更優化地使用混合凝膠。

由于之前對WPI/GA復合物的研究并沒有對結構進行過多闡述，并且在一定pH值范圍內蛋白質帶正電荷的結構域與帶負電荷的GA相互作用形成弱復合物，這些復合物不會形成凝聚層，形成的顆粒穩定性差，而WPIXG復合物可以通過兩種組分之間的靜電分子締合產生高度穩定的乳液，因此利用XG和WPI形成復合顆粒進一步研究其結構特性及穩定性。當蛋白質/多糖復合體系在接近pI的pH值條件下加熱到蛋白質的變性溫度以上時，就會形成復合物顆粒。多糖依附在蛋白質表面，形成具有“核殼”結構的復合顆粒并在很寬的pH值和離子強度范圍內相對穩定，不會聚集離子強度或解離；因此pH值和離子強度在復合物及核殼結構的形成中起著關鍵作用。本實驗選用乳清分離蛋白、陰離子多糖黃原膠作為基礎原料制備復合顆粒，通過調節pH值、離子強度、熱處理溫度、混合方式和剪切條件，調控復合顆粒的粒徑、電位和濁度，明確復合顆粒的形成規律、穩定性以及結構，以豐富構建蛋白質/多糖復合顆粒的理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI 山東匯益生物科技有限公司；XG 阿澤雷斯國際貿易（上海）有限公司；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Cary-60紫外-可見光分光度計 安捷倫科技（中國）有限公司；ZS90 Zeta電位儀 英國馬爾文儀器有限公司；GHJ-6水浴磁力攪拌器 蘇州市國飛實驗儀器有限公司；FSH-2高速勻漿器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；X-30R離心機 貝克曼庫爾特有限公司；8400全自動凱氏定氮儀 福斯華（北京）科貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPI-XG復合體系的制備

準確稱取適量的WPI粉末溶于去離子水中配制成WPI-XG質量比為9∶1的WPI儲備液，在25 ℃條件下用電子攪拌器在500 r/min攪拌30 min后，置于4 ℃冰箱水化一夜。準確稱取適量XG溶于去離子水中配制成質量分數為0.1%儲備液，在25 ℃條件下用電子攪拌器在500 r/min攪拌30 min后靜置，除去氣泡。

混合相應的儲備溶液，制備WPI-XG質量比為9∶1的混合溶液，控制混合后總聚合物質量分數為0.5%，對于離子強度的影響，向WPI-XG質量比為9∶1的混合液中添加NaCl調節離子強度（（NaCl）=0、20、50、100、200 mmol/L）。

1.3.2 濁度的測定

采用紫外-可見分光光度計對濁度進行測定，使用1 cm石英比色皿，測定波長為600 nm。分光光度計的透光率通過去離子水進行校準為100%，樣品的濁度表示為（100-）%。滴定開始前，首先用0.1 mol/L NaOH將WPI-XG混合溶液、WPI溶液和XG溶液的pH值調節至7.0±0.2，同時固定溶液內總生物聚合物質量分數為0.1%。每當體系pH值變化0.1～0.2時，取樣測定其濁度，同時記下對應的pH值。為保證整個體系混合均勻，滴定過程在磁力攪拌器上進行。

1.3.3 顆粒組成的測定

選用兩種方法制備顆粒：

方法1：配制WPI-XG質量比為9∶1的混合溶液，控制總生物聚合物質量分數為0.5%，調節pH值，并分別在75、85、95 ℃熱處理30 min，熱處理采用恒溫水浴磁力攪拌器，熱處理后用冰水將溶液迅速冷卻至室溫，所獲得的顆粒稱為I型顆粒。

方法2：準備0.9%的WPI溶液，調節pH值，并分別在75、85、95 ℃熱處理30 min，熱處理后用冰水將溶液迅速冷卻至室溫，再加入0.1%的XG儲備液使混合液中蛋白質與多糖的質量比（WPI-XG）為9∶1且生物大分子質量分數為0.5%，充分混合均勻，所獲得的顆粒稱為II型顆粒。

分別將兩種方法制得的混合液在4 ℃、9 000×離心30 min，復合顆粒被離心至試管底部。分別采用凱氏定氮法和苯酚-硫酸法測定上清液中的蛋白質和多糖含量，結合總的蛋白質和多糖添加量即可算出沉淀中的蛋白質和多糖含量。

1.3.4 粒徑和Zeta電位的測定

將熱處理后的混合液用高速勻漿器在剪切速率為10 000 r/min剪切2 min，再稀釋至總生物聚合物質量分數為0.1%，采用Zeta電位儀測定剪切后的粒徑和Zeta電位，用于溶劑和復合顆粒的折射率分別為1.33和1.50。所有測量均在25 ℃并重復3 次。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡

采用激光共聚焦電子顯微鏡觀察顆粒中的蛋白質和多糖分布。分別向WPI儲備液和XG儲備液中加入熒光染料尼羅藍和5-氨基熒光素進行熒光標記，室溫下攪拌1 h后。對于WPI組，將WPI儲備液pH值調至4.32后經75 ℃熱處理30 min，冰水冷卻后，加入去離子水充分攪拌并調節pH值，使溶液pH 4.32且總生物聚合物質量分數為0.5%。隨后將溶液在10 000 r/min高速剪切2 min。按照1.3.3節方法2制備在75 ℃和95 ℃熱處理條件下的WPIXG混合溶液，加熱前后分別將pH值調節為4.32，最后在10 000 r/min高速剪切2 min。取400 μL溶液滴于共聚焦小皿并蓋上蓋玻片。尼羅藍和5-氨基熒光素的激發波長分別為633 nm和488 nm，采集熒光圖像，觀察顆粒的構成形態。

1.4 數據處理與分析

實驗數據使用SPSS統計軟件進行分析處理，采用單因素方差分析，在95%置信區間下分析評估結果的顯著性。

2 結果與分析

2.1 WPI-XG復合凝聚的行為

2.1.1 pH值對WPI-XG復合凝聚的影響

pH值在蛋白質和多糖復合凝聚中起到了關鍵作用。對于蛋白質和陰離子多糖復合體系，當pH值小于pI時，蛋白質帶正電荷，可與陰離子多糖結合形成復合物，并改變體系的透明度。因此，濁度測定是監測復合物形成的最常見且最直觀的方法。圖1顯示了WPI與WPI-XG溶液的濁度在不含鹽離子條件下隨pH值的變化曲線。隨著酸化的進行，pH值逐漸降低，當pH值達到5.54時，WPI-XG溶液的濁度開始增大，說明在靜電力的作用下，WPI與XG部分結合。當pH值達到5.32時，溶液濁度迅速增大并觀察到不溶物的生成。當pH值達到4.32時，溶液濁度最大，此時靜電相互作用最強。然而隨著pH值繼續降低，溶液的濁度也開始降低。這一現象是由于XG的p在3附近，因此隨著溶液pH值的降低，WPI與XG間的靜電相互作用減弱，WPI-XG復合顆粒開始解離。此外，WPI在等電點附近顯示出最高的濁度。從結果看，黃原膠的濁度不會隨著pH值的變化而變化。因此，加入黃原膠之后濁度最高對應的pH值雖然接近，單純黃原膠的濁度不隨pH值變化，可以說明濁度受到復合顆粒生成的影響而產生變化。

圖1 WPI顆粒和WPI-XG溶液濁度隨pH值變化的曲線Fig.1 Turbidity curves of WPI particles and WPI-XG solution as a function of pH

2.1.2 離子強度對WPI-XG復合凝聚的影響

鹽離子主要通過屏蔽生物大分子的表面電荷影響蛋白質和多糖之間的復合凝聚過程。圖2顯示了不同離子強度下WPI-XG溶液的濁度隨pH值變化的曲線，可以明顯看出離子強度對溶液的濁度有著劇烈的影響。

由圖2可以看出，從中性向酸性滴定時，在pH值相同的條件下，鹽離子濃度為20 mmol/L的濁度高于空白組，鹽離子濃度高于20 mmol/L的組別濁度低于空白組。但隨著酸化的進行，空白組的溶液在pH值為4.32時率先達到濁度最高點且其濁度高于含有鹽離子的其他組別。鹽離子濃度越高，其濁度的最高值點越低且達到濁度最高值點時的pH值也越低。隨著pH值進一步降低，各組的濁度逐漸降低，最終趨于近似。這表明在pH值較高時，少量鹽離子可以改善生物聚合物的溶解性從而加強WPI與XG間的靜電相互作用，聚集程度增加；大量鹽離子對生物大分子表面電荷存在屏蔽作用，削弱了WPI與XG間的靜電相互作用，聚集程度降低。隨著pH值逐漸降低，由于鹽離子對生物大分子的表面電荷有屏蔽作用，WPI與XG間的靜電力減弱，因此生物大分子需要在更低的pH值下才能完成聚集，此時蛋白質能攜更多的帶正電荷，從而導致濁度的最高值減少且達到濁度最高值點時的pH值也降低，鹽離子濃度越高，屏蔽作用越強，生物大分子形成聚集體所需的pH值越低。當pH值進一步降低時，由于氫離子的存在，鹽離子對生物大分子表面電荷的屏蔽作用減弱，但由于此時pH值接近XG的p，靜電相互作用減弱，WPIXG開始解離，因而各組濁度下降并趨近。

圖2 不同離子強度下WPI-XG溶液濁度隨pH值變化的曲線Fig.2 Turbidity curves of WPI-XG solution as a function of pH with various ionic strengths

2.2 WPI-XG復合顆粒的組成

表1展示了不同熱處理溫度和混合方式對WPI-XG復合顆粒組成成分的影響，發現混合方式對顆粒中WPI的含量沒有顯著影響，對XG含量有顯著影響，I型比II型的XG含量高。這是由于I型是在熱處理前，WPI和XG在靜電力作用下結合，熱處理時，WPI內部的疏水鍵展開，WPI分子間的疏水相互作用增強，可能形成二硫鍵共價結合，部分XG被WPI分子裹挾進入聚集體內部，同時，游離的XG在靜電力作用下附著在WPI聚集體表面，形成WPI-XG復合顆粒；II型是WPI受熱解折疊，在疏水相互作用下聚合成為“核”，XG在靜電力作用下包裹在“核”的表面，形成“核殼”結構的WPI-XG復合顆粒。熱處理溫度對II型顆粒的蛋白質/多糖比例具有顯著影響。這可能是由于熱處理溫度越高，蛋白質聚集程度越高，聚集體表面基團和電性變化使得多糖難以完全覆蓋蛋白質表面，因此蛋白質/多糖比例增大。

表1 WPI顆粒和WPI-XG復合顆粒的組成Table 1 Composition of WPI particles and WPI-XG composite particles

2.3 WPI-XG復合顆粒的粒徑與Zeta電位

Zeta電位是表現顆粒穩定性的一個指標，電位絕對值越大，顆粒穩定性越高。表2展示了不同熱處理溫度和混合方式對WPI-XG復合顆粒的粒徑與電位的影響，發現就WPI而言，熱處理的溫度越高，粒徑越大，電位的絕對值越小。這是由于溫度越高，WPI的解折疊越劇烈，內部的疏水基團暴露更多，表面電荷減少，WPI分子間的疏水相互作用更強，聚集程度更高，形成的顆粒粒徑更大，電位絕對值更小。對于I型顆粒，75 ℃與85 ℃熱處理過后的粒徑及電位沒有顯著差異，這可能是由于XG的存在增加了WPI的穩定性；而95 ℃熱處理后的粒徑及電位絕對值都顯著增大，這是由于WPI在95 ℃解折疊劇烈，展開了更多內部的疏水基團，分子間的疏水相互作用增強，聚集程度增加，顆粒表面積增加，WPI與XG的結合更穩定。對于II型顆粒，75 ℃與85 ℃熱處理過后的粒徑沒有顯著差異，均小于95 ℃熱處理，75 ℃熱處理后的電位絕對值最大，95 ℃次之，85 ℃最小。這是由于在75 ℃時WPI的解折疊程度小，在疏水相互作用和靜電相互作用的驅動下XG包裹在WPI表面且結構穩定，使電位絕對值增大，85 ℃時，由于WPI解折疊程度的增加，靜電相互作用減弱，WPI與XG結合的穩定性下降，電位絕對值減少。此外，II型顆粒的各組粒徑比I型顆粒的小，電位絕對值比I型顆粒的大，表明方法2能形成更穩定的復合顆粒。表3展示了剪切后的各組顆粒的粒徑與電位，發現與剪切前相比，各組顆粒的粒徑和電位絕對值均有所減小且總體趨勢不變。

表2 WPI顆粒和WPI-XG復合顆粒的粒徑與電位（剪切前）Table 2 Particle sizes and potentials of WPI particles and WPI-XG composite particles (before shearing)

表3 WPI顆粒和WPI-XG復合顆粒的粒徑與電位（剪切后）Table 3 Particle sizes and potentials of WPI particles and WPI-XG composite particles (after shearing)

2.4 WPI-XG復合顆粒的微觀結構

如圖3所示，75 ℃熱處理后的WPI以小顆粒狀均勻地分布在體系中；并且75 ℃熱處理后WPI解折疊，內部疏水基團展開，在疏水相互作用下發生聚集，XG在靜電相互作用和疏水相互作用下包裹在聚集的WPI表面，形成以WPI為核、XG為殼的復合顆粒；由于95 ℃熱處理后WPI解折疊程度較大，疏水相互作用增強，聚集程度更高，聚集體表面基團和電性變化導致XG難以完全覆蓋WPI表面，最終形成粒徑更大的“核殼”結構殘缺的復合顆粒。激光共聚焦顯微鏡觀察到的結果與之前粒徑與電位的結果符合。

圖3 WPI顆粒和WPI-XG復合顆粒的微觀結構（pH 4.32）Fig.3 Microstructure of WPI particles and WPI-XG composite particles (pH 4.32)

3 結論

WPI和XG可以在靜電相互作用的驅動下自發形成復合物；離子強度對WPI-XG復合凝聚的影響具有多重效應：當離子強度從0 mmol/L增加到20 mmol/L時，WPI-XG復合體系的濁度增大；當離子強度從20 mmol/L增加到200 mmol/L時，離子強度對電荷的屏蔽作用使得WPI與XG的結合減弱，復合體系的濁度減??；I型和II型WPI-XG復合顆粒的粒徑與電位絕對值均大于WPI顆粒，相比于I型顆粒的粒徑更小，電位絕對值更大，形成的顆粒更穩定，并且剪切后的75 ℃熱處理WPI顆粒與XG復合形成更為完整的“核殼”結構。本實驗結果能夠豐富構建蛋白質/多糖復合顆粒的理論，作為脂肪替代物有望更廣泛地應用于食品領域。