櫻桃枝干病害病原鑒定及生物防治

張淑靜，趙 林，孫 超，王 靜，馬安寶，曲永赟

（1.山東省林業科學研究院，山東 濟南 250014；2.濟南棲圣農林科技有限公司，山東 濟南 250014）

近年來，櫻桃作為一種重要的經濟果樹在全國果業生產中的重要地位越來越凸顯，已成為我國鄉村振興、產業興旺的重要引擎[1-4]。目前，全國櫻桃的種植面積超過24.7 萬hm2，年總產量在140 萬t 左右[5-7]。櫻桃栽培區域遍布全國23 個省市，櫻桃已成為我國水果產業發展的重要組成部分。

然而，櫻桃病蟲害的發生已成為制約我國櫻桃產業健康發展的主要障礙[8-9]。其中，櫻桃枝干病害成為近年來櫻桃樹上一種毀滅性病害，發病嚴重地區直接導致櫻桃樹大面積枯萎死亡，造成櫻桃絕收[10-11]。但目前對于櫻桃枝干病害的病原及發病特征研究未有報道，同時如何有效采取針對性生物防治手段未見研究。為了明確櫻桃枝干病害病因，我們對該病的病原進行了初步研究；同時，篩選到高效拮抗該病原的生防微生物，并探究了該菌株液體制劑對櫻桃枝干病害的防治效果，為后續針對櫻桃枝干病害微生物菌劑的研發以及櫻桃枝干病害生物防治提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 病害調查及采樣

2019年至2020年連續2年在山東省主要櫻桃產區煙臺福山區、濰坊臨朐縣、泰安天寶鎮以及淄博燕崖鎮進行病害調查，調查面積超20 hm2。調查內容主要為枝干病害發生時間、發病癥狀、危害程度以及受害株率等。

同時，我們采集發生枝干病害的枝段，統一編號并標明采集地點和采集時間，送回實驗室進行病原菌的分離等相關研究。

1.2 病原菌分離培養及鑒定

1.2.1 病原菌分離培養

將采集送回的枝段立即進行病原菌分離。先用蒸餾水將枝段清洗干凈，再用75%乙醇溶液進行消毒；再用無菌刀片和接種針在枝段病健交界處以及染病的木質部和韌皮部取組織塊，接種于孟加拉紅培養基上，在28℃條件下恒溫培養。待培養物長出，在PDA 培養基上進行兩次轉板純化。將所有純化的培養物按照采集地點、采集時間和標本號進行統一編號，保存于4℃冰箱。

1.2.2 致病性接種試驗

將活化好的yts-01、yts-02 接種于PDB 培養基中，28℃、120 r/min 培養72 h，經過濾將菌絲體除去，制成yts-01 和yts-02 的孢子懸液。選用健康的2年生櫻桃樹苗作為供試材料，一共30 株，分成3 組，分別做如下處理：在同一高度處用接種針進行扎孔處理：①在傷口處接種yts-01 孢子懸液；②在傷口處接種yts-02 孢子懸液；③在傷口處接種無菌水作為對照。選擇的櫻桃樹有一定的間隔，防止試驗過程交叉感染。每隔5 d 觀察發病狀況。

1.2.3 病原菌形態特征觀察

將活化好的病原菌接種于PDA 培養基上，進行形態特征觀察，主要包括菌落形態、生長速度、顏色等；制作切片在顯微鏡下對其分生孢子形態、大小等特征進行觀察。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定

將分離后獲得的病原菌純培養體送至山東森琪生物技術有限公司進行ITS 序列測序。將測的序列在在線GenBank 核酸數據庫中進行Blast 分析，得到相關性序列，利用MEGA7 軟件構建yts-01 系統進化樹，并進行yts-01 系統發育分析。

1.3 熒光假單胞桿菌GH2-1 對櫻桃枝干病害病原的抑制作用

1.3.1 櫻桃枝干病害病原高效拮抗菌株篩選

利用平板對峙培養法，對高效拮抗櫻桃枝干病害病原越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）的拮抗菌株進行篩選。

將實驗室已保存的14 株待測拮抗菌株于NA 培養基上劃線培養，28℃恒溫培養24 h；用接種環挑取一環菌苔接種于含10 mL NB 培養基的50 mL 三角瓶中，于28℃搖床中120 r/min 均勻震蕩36 h，得到待選菌株的活化菌液。將越橘間座殼于PDA 培養基上進行活化培養，28℃恒溫培養60 h。用打孔器在活化好的櫻桃枝干病害菌邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，接種在PDA 平板中央；在距中央2.0 cm 的兩側用移液槍接10 μL 待選菌液；對照組在另外兩側相同距離處接種10 μL NB 培養基。每一處理重復3 次。處理完成后，28℃恒溫培養，逐日觀察待選菌株對越橘間座殼的抑制作用；待對照組病原菌長滿平板后，測量實驗組病斑的大小，并計算抑菌率。

抑菌率=[（對照菌落直徑-菌餅直徑）-(處理菌落直徑-菌餅直徑)]/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.3.2 熒光假單胞桿菌GH2-1、發酵上清液及所產揮發性物質對櫻桃枝干病害病原的抑制效果

采用平板對峙法檢測熒光假單胞桿菌GH2-1 對櫻桃枝干病害病原生長的抑制效果。實驗方法同1.3.1。

采用含毒介質法檢測熒光假單胞桿菌GH2-1 發酵上清液對櫻桃枝干病害病原生長的抑制效果。將熒光假單胞桿菌GH2-1 發酵上清液與PDA 固體培養基按照1:10 的比例充分混合，制成含毒平板；將櫻桃枝干病害病原菌餅接種于平板中央，對照用無菌水代替，每個處理重復3 次。后續實驗同上。

采用倒扣平板法檢測熒光假單胞桿菌GH2-1 所產揮發性物質對櫻桃枝干病害病原生長的抑制效果。對照組：將櫻桃枝干病害病原的菌餅接于PDA 平板中央并倒扣于LB 固體平板上，封口。實驗組：吸取100 μL熒光假單胞桿菌GH2-1 菌液于PDA 平板上，用滅菌的涂布棒均勻涂開，于28℃培養箱中培養24 h。將櫻桃枝干病害病原菌餅接于PDA 平板中央并倒扣于熒光假單胞桿菌GH2-1 平板上，封口，于28℃培養箱中培養。每一處理重復3 次。后續實驗同上。

1.4 熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑對櫻桃枝干病害防治效果

1.4.1 供試藥劑

GH2-1 液體制劑300 倍稀釋液。

1.4.2 供試材料與防治對象

供試材料為櫻桃幼苗，品種為 ‘紅寶石’；防治對象為櫻桃枝干病害，病原越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）。

1.4.3 試驗地情況

試驗地設在濰坊市臨朐縣櫻桃產區。往年櫻桃枝干病害在該地發病嚴重，特別是櫻桃苗移栽后因感染櫻桃枝干病害成活率較低；我們于2020年3月15日、3月31日和4月15日進行林間防治櫻桃枝干病害試驗。所有試驗小區栽培條件及管理措施一致，施藥時櫻桃枝干病害處于發病初期。

1.4.4 試驗設計及安排

本試驗設計了熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑300 倍稀釋液和不施藥清水做對照共2 個處理，每個小區200 m2，重復3 次，共6 個小區，各小區隨機排列。共施藥2 次，第1 次于2020年3月15日進行浸根處理；移栽緩苗15 d 后于2020年3月31日第2 次施藥，本次方式為灌根，每一小區施用量100 kg；4月15 第3 次

施藥，本次方式為噴霧，每一小區施用量15 kg；5月中旬進行發病情況調查。

1.4.5 試驗調查及計算方法

最后1 次用藥間隔30 d 后統計發病狀況，并計算防治效果。

櫻桃枝干病害發病級數參照表1，以單株為單位。

表1 櫻桃枝干病害發病分級標準Table 1 Classification standard of cherry stem disease

藥效按式①、②計算：

病情指數DI（%）=[∑（病級數）×該級發病植株數）]/[（病級最高值×調查總株數）]×100%①

防治效果（%）=（對照病級指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%②

2 結果與分析

2.1 櫻桃枝干病調查結果

2.1.1 櫻桃枝干病危害情況

在連續2年的調查中發現，櫻桃枝干病害在3年以內樹齡的幼林中發病嚴重，特別是對剛移栽的櫻桃幼苗危害尤為嚴重；4月進入發病高峰。通過實地調查發現，在調查的全部幼林中，發病嚴重地區占40%左右，此病區櫻桃感病率高達80%以上，死株率約50%以上，特別嚴重的幾乎全部死亡。

2.1.2 櫻桃枝干病病癥特征

櫻桃枝干病發病后，樹干表面有明顯內陷區域，明顯感到樹皮與樹干分離；但初發病源顏色變化不明顯；進一步觀察發現，病原侵染后，發病部位由木質部向韌皮部擴展逐漸變黑腐爛，也可由韌皮部向木質部擴展變黑腐爛，還表現在由近根處向遠根處進行擴展，最終導致主桿或側枝干枯（圖1）。

為了進一步確定櫻桃枝干枯死是由病原菌感染所致，我們將部分樣品噴灑無菌水保濕，3 天后發現在枝段橫切木質部有大量真菌生長（圖2）。

圖2 感病枝段木質部真菌生長狀況Figure 2 Growth status of xylem fungi in susceptible branches

2.2 病原菌分離培養及鑒定

2.2.1 病原菌分離培養

利用真菌分離技術將采集送回的142 個枝段樣品進行病原菌分離純化，共分離314 株真菌。經平板培養發現，所有分離菌株分為兩種菌落形態，其中289 株菌落形態一致，編號為yts-01；剩余25 株菌落形態一致，編號為yts-02。由此，我們初步推測yts-01 為櫻桃枝干病害的病原菌。

2.2.2 致病性接種試驗

由于致病性接種試驗期間溫度和濕度處于發病最佳條件，在處理10 d 后即可觀察到接種部位發生變化。結果顯示，接種yts-01 孢子懸浮液的櫻桃全部發病，在接種處出現褐色病斑且該區域明顯內陷；接種yts-02 和無菌水的櫻桃均不發病。

對發病的部位取樣進行病原菌的分離培養，發現分離到的菌株菌落形態與試驗菌株yts-01一致，符合柯赫氏法則。以上結果證實yts-01 為櫻桃枝干病害的病原菌。

2.2.3 病原菌形態特征觀察

接種在PDA 培養基上的yts-01 菌落生長速度快，平均生長速度為1.5 cm/d，6 d 左右基本長滿平板（圖3-A）。菌落初期為白色、圓形，氣生菌絲疏松不緊密，隨著生長，出現不規則同心圓（圖3-A）。后期，在同心圓上生長出子座（生長第6 d開始出現），且菌落表面變灰色（圖3-B，圖3-C）。

圖3 yts-01 菌落培養特征Figure 3 Colony culture characteristics of yts-01

分生孢子梗較短或分化不明顯，分生孢子串生于分生孢子梗上，呈現圓形、橢圓、長圓柱等形狀，長度5～7 μm（圖4）。

圖4 yts-01 分生孢子Figure Conidia of yts-01

2.2.4 病原菌分子生物學鑒定

我們將測序結果與GenBank 中收錄的DNA 序列進行比對，并建立yts-01 進化樹。結果說明，櫻桃枝干病病原菌yts-01 與Diaporthe vaccinii（Accession No.LC206678）聚成一支，同源性最高（圖5）。

圖5 yts-01 系統發育樹Figure 5 Phylogenetic tree of yts-01

因此，綜合菌株的ITS 序列分析與形態學特征，鑒定yts-01 為越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）。

2.3 熒光假單胞桿菌GH2-1 對櫻桃枝干病害病原的抑制作用

2.3.1 櫻桃枝干病害病原高效拮抗菌株篩選

結果顯示，在實驗例1 中分離到的14 株菌中，有6 株菌對櫻桃枝干病害菌生長有抑制效果，分別為GH2-1、GH2-2、GH2-4、GH2-5、GH2-6 和GH2-9（表2）；通過對不同菌株抑菌率計算統計發現，菌株GH2-1 對櫻桃枝干病害菌抑制效果高達90.98%，顯著高于其他菌株（表2）。

表2 不同菌株抑菌率統計Table 2 Statistics of bacteriostasis rate of different strains

前期，我們已鑒定GH2-1 為熒光假單胞菌，故結合上述抑菌率結果，選擇熒光假單胞菌GH2-1 為研究對象進行后續相關研究。

2.3.2 熒光假單胞桿菌GH2-1、發酵上清液及所產揮發性物質對櫻桃枝干病害病原的抑制效果

從圖6可以看出，熒光假單胞桿菌GH2-1、發酵上清液及其所產揮發性物質和對櫻桃枝干病害病原的生長有明顯的抑制效果（圖6A、B、C）；抑制后的櫻桃枝干病害病原菌落直徑顯著低于對照（圖6D、E、F）；抑菌率分別為94.49%、62.51%和72.41%。以上結果說明，熒光假單胞桿菌GH2-1 及其產物能夠高效抑制櫻桃枝干病害病原的生長。

圖6 熒光假單胞桿菌GH2-1 及其發酵產物對櫻桃枝干病害病原生長的抑制效果（結果顯示為平均值±標準差（n≥3）。**p＜0.01）Figure 6 Inhibitory effect of Pseudomonas fluorescens GH2-1 and its products on the growth of cherry stem disease pathogens

2.4 熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑對櫻桃枝干病害防治效果

表3結果表明，最后一次施藥后30 d 后，熒光假單胞菌（P.fluorescens）菌株GH2-1 液體制劑對櫻桃枝干病害有較好的防治效果，防治效果為74.3%。這進一步說明菌株GH2-1 在櫻桃枝干病害防治中具有廣泛應用前景。

表3 各個處理后櫻桃枝干病害的發病指數及防治效果Table 3 Disease index and control effect of cherry branch disease after each treatment

3 結論與討論

有文獻報道，越橘間座殼（Diaporthe vaccinii）能夠引起核桃枝枯病、藍莓枝枯病的發生，但未見越橘間座殼引起櫻桃枝干病害的報道[12-13]。本文從感染櫻桃枝干病的櫻桃枯枝中分離到病原yts-01，通過柯赫氏法則驗證該菌株為櫻桃枝干病害的病原，利用形態特征觀察及分子生物學鑒定確定yts-01 為越橘間座殼。由越橘間座殼引起櫻桃枝干病害為首次發現。鑒于該病具有傳染性強、危害范圍廣、傳播隱匿等特點，應對其生物學特性和發生發展規律進行深入研究，為后續病害防治提供更多理論依據。

生物防治因其具有環保、安全、有效、可持續等特點成為目前植物病害防治研究熱點[14-15]。本文在確定越橘間座殼為櫻桃枝干病害的病原的基礎上，通過平板對峙實驗篩選了對該病害病原有高效抑制效果的熒光假單胞桿菌GH2-1；并對熒光假單胞菌GH2-1 的拮抗功能進行了初步研究。結果表明，熒光假單胞桿菌GH2-1、發酵上清液及其所產揮發性物質和對櫻桃枝干病害病原的生長有明顯的抑制效果（圖6A、B、C）；抑制后的櫻桃枝干病害病原菌落直徑分別顯著低于對照 （圖6D、E、F）；抑菌率分別為94.49%、62.51%和72.41%。這表明，熒光假單胞桿菌GH2-1 及其產物能夠高效抑制櫻桃枝干病害病原的生長，但對于發揮作用的具體物質以及作用原理還需進一步研究。

眾所周知，外界非生物因素以及寄主、其他微生物等生物因素都會嚴重影響微生物生防制劑在田間防效的穩定性，致使其優勢難以長時間保持[16]。本文初步研究了熒光假單胞桿菌GH2-1 對櫻桃枝干病害田間防效，結果表明，熒光假單胞菌GH2-1 液體制劑在櫻桃枝干病害防治中具有廣泛應用前景。后期，還需要根據櫻桃枝干病害的發病特點以及熒光假單胞桿菌GH2-1 用藥方式選擇合適的劑型制成微生物菌劑，為櫻桃枝干病害生物防治做出更大貢獻。