長鏈非編碼RNA C17orf91在肝細胞癌中低表達的臨床意義

龐玉艷 李建棣 羅嘉嫄 莫偉嘉

肝癌是全世界癌癥相關死亡的第三大原因，肝細胞癌約占肝癌的75%～85%[1]。肝細胞癌發病機制迄今未明，其危險因素主要有肝炎病毒、黃曲霉毒素、非酒精性脂肪肝等[2-5]。肝癌治療策略包括藥物治療及非藥物治療[6-7]。由于肝細胞癌起病隱匿，許多患者錯失最佳治療時機[8-9]。因此，迫切需要深入研究肝細胞癌發病機制，為晚期肝癌患者提供高效治療靶點，改善預后。

長鏈非編碼RNA異常表達是癌癥中常見的分子事件[10-11]。由于長鏈非編碼RNA表達的廣泛性及組織特異性，它極有可能成為癌癥生物標志物[12-13]。長鏈非編碼RNA C17orf91為hsa-miR-22-3p、hsa-miR-22-5p前體，可參與抑制肝細胞癌增殖、侵襲等惡性生物學行為[14-15]。C17orf91通過miR-10a-5p/NCOR2軸抑制肝細胞癌生長，且C17orf91下調預示肝細胞癌患者不良預后[16]。C17orf91衍生的hsa-miR-22-3p可靶向調控高遷移率族蛋白1，滅活其下游通路；C17orf91還可競爭結合RNA結合蛋白HuR，使β-連環蛋白（βcatenin）編碼基因表達減弱[17]。C17orf91衍生的hsamiR-22-5p可抑制組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 2,HDAC2）活性，增加組蛋白乙?；?，增強肝細胞癌放射敏感性[18]。上述研究揭示C17orf91在肝細胞癌中的抑癌角色，C17orf91及其衍生miRNA有望成為肝細胞癌治療靶點。然而，C17orf91在肝細胞癌中的分子機制尚不明確。因此，本研究旨在評估長鏈非編碼RNA C17orf91在肝細胞癌中的表達水平及其臨床意義，進而探討C17orf91及其衍生miRNA的靶向機制，最終為肝細胞癌患者預測治療靶點。

1 材料和方法

1.1 肝細胞癌mRNA表達譜 本研究所納入的全球肝細胞癌mRNA與miRNA表達譜均下載自高通量基因表達（Gene Expression Omnibus,GEO）、ArrayExpress、癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和基因組織表達（Genotype-Tissue Expression,GTEx）數據庫。納入標準：（1）物種為人類；（2）明確病理診斷為肝細胞癌；（3）對照為健康肝臟組織；（4）表達數據及臨床信息完整。排除標準：（1）樣本中混有肝膽管細胞癌；（2）患者手術前經過放射或者藥物治療。分別合并同一平臺的mRNA及miRNA數據集，產生的批次效應經limma程序包移除，并進行標準化處理。

1.2 C17orf91在全球肝細胞癌組織的表達分析及其潛在臨床意義 利用移除批次后的全球肝細胞癌mRNA表達矩陣計算C17orf91在肝細胞癌組織及非癌肝組織中的表達總數、均值、標準差，計算C17orf91表達水平的標準化平均差（SMD）。通過繪制ROC曲線獲取C17orf91表達鑒別肝細胞癌的最佳靈敏度及特異度，計算真陽性率、假陽性率、假陰性率和真陰性率，經Stata 12.0統計軟件合并得到匯總ROC（summary ROC,sROC）及AUC。最后，利用 Kaplan-Meier Plotter評估C17orf91對肝細胞癌患者預后的潛在影響。

1.3 肝細胞癌mRNA及miRNA差異表達分析 分別利用移除批次后的全球肝細胞癌mRNA及miRNA表達矩陣計算表達值的SMD，鑒定差異表達mRNA（differentially expressed messenger RNA,DEmRNA）及差異表達miRNA（differentially expressed micro RNA,DEmiRNA）（|SMD|＞0，P＜0.05）。

1.4 C17orf91來源hsa-miR-22-3p及hsa-miR-22-5p靶基因預測 鑒于C17orf91作為hsa-miR-22-3p及hsa-miR-22-5p宿主基因，其功能依賴于miRNA對下游mRNA靶點的調控。本研究全面探討hsa-miR-22-3p及hsa-miR-22-5p的靶基因，利用的11個數據庫包括 miRecords、DIANA-microT-CDS、ElMMo、Micro-Cosm、miRanda、miRDB、miRTarBase、PicTar、PITA、TarBase和 TargetScan。hsa-miR-22-3p、hsa-miR-22-5p與靶基因的相互作用均經過研究驗證（如熒光素酶報告基因實驗、降解組測序、紫外交聯免疫沉淀結合高通量測序等）。

1.5 肝細胞癌C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA競爭性內源RNA機制 C17orf91還有可能通過其他miRNA發揮功能，本研究進一步查詢了C17orf91相關的miRNA及經熒光素酶報告基因實驗驗證的mRNA靶基因。兩者分別與DEmiRNA、DEmRNA交集，用于構建C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA競爭性內源RNA調控網絡。

1.6 17orf91相關靶基因功能注釋 利用Metascape對hsa-miR-22-3p、hsa-miR-22-5p及C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA靶基因的潛在分子生物學功能進行預測。

1.7 計算機輔助預測潛在抗肝細胞癌治療藥物 通過靶向肝細胞癌中的C17orf91調控分子通路，對FDA批準或臨床試驗研究抗癌藥物進行重新利用，初步篩選可能具有較高敏感性的抗肝細胞癌藥物及其潛在作用靶點。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織及非癌肝組織C17orf91表達水平比較 本研究共納入24個基因芯片及高通量測序合并數據集，其肝細胞癌組織及非癌肝組織對照樣本分別達1 381、1 052例，見表1。肝細胞癌組織中C17orf91表達水平明顯下調，其SMD低至-0.96（-1.25～-0.67）（圖1a）。發表偏倚檢測、敏感性分析結果提示未見明顯發表偏倚、未發現明顯的異質性來源，故整合分析結果可靠（圖1b-c）。

表1 全球肝細胞癌表達矩陣中的C17orf91表達水平

2.2 C17orf91表達水平對肝細胞癌患者預后的影響為評估C17orf91在肝細胞癌中的潛在臨床價值，本研究首先利用C17orf91表達水平對肝細胞癌組織、非癌肝組織進行診斷試驗，見表2。結果表明，C17orf91有能力甄別肝細胞癌組織及非癌肝組織，其sROC AUC為0.84（0.80～0.87），靈敏度及特異度分別為0.72（0.63，0.80）、0.82（0.72～0.89）（圖1d），皆提示C17orf91對肝細胞癌具有中等區分能力。陽性似然比、陰性似然比森林圖結果亦揭示了C17orf91用于區分肝細胞癌的準確性（圖1e-f）。本研究進一步評估C17orf91的預后能力，發現C17orf91高表達可預示肝細胞癌患者較低的生存風險（圖2a-b）。由此得知，低表達C17orf91預示肝細胞癌患者預后不良。

表2 C17orf91對肝細胞癌組織與非癌肝組織的區分能力（例）

圖1 C17orf91在全球肝細胞癌組織中的表達下調及其對肝癌患者的潛在鑒別意義（a：與非癌肝組織相比，肝細胞癌組織中C17orf91呈低表達；b：未檢測到明顯發表偏倚；c：敏感性分析未鑒別出明顯異質性來源；d：C17orf91對肝細胞癌組織與非癌肝組織有中等區分能力；e：陽性似然比森林圖；f：陰性似然比森林圖）

2.3 C17orf91的潛在分子功能 本研究共獲取肝細胞癌hsa-miR-22-3p差異表達靶點1 395個、hsa-miR-22-5p差異表達靶點798個，其中分別包含hsa-miR-22-3p上調靶點1 018個、下調靶點377個以及hsamiR-22-5p上調靶點554個、下調靶點244個。hsamiR-22-3p和hsa-miR-22-5p下調靶基因在肝細胞癌差異表達調控網絡中分別參與細胞遷移正性調控和血管發育（圖2c）。

圖2 C17orf91衍生miRNA在肝細胞癌進展中的潛在機制（a：C17orf91低表達預示肝細胞癌患者總體生存期高風險；b：C17orf91低表達預示肝細胞癌患者無進展生存期高風險；c：C17orf91系hsa-miR-22-3p及hsa-miR-22-5p宿主基因，其靶基因在肝細胞癌差異表達調控網絡中分別參與細胞遷移正性調控和血管發育）

2.4 肝細胞癌C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA調控機制 本研究首先反向預測調控C17orf91的69個miRNA，其中僅有16個顯著高表達miRNA及2個顯著低表達miRNA。利用這18個差異表達miRNA，預測得差異表達靶基因42個（下調15個、上調27個）。功能注釋結果表明，上調靶基因主要參與癌癥通路（圖3a），而下調靶基因主要參與細胞遷移正性調控、細胞群增殖負性調控及PID CMYB信號通路（圖3b）。圖4展示了C17orf91-DEmiRNA-DEmRNA調控網絡參與癌癥通路及細胞遷移正性調控的相互作用關系。

圖3 C17orf91上游相關miRNA靶基因功能注釋（a：C17orf91上游相關miRNA的上調靶基因主要參與癌癥通路；b：C17orf91上游相關miRNA的下調靶基因主要參與細胞遷移正性調控）

2.5 潛在抗肝細胞癌藥物及其治療靶點預測 相關分析結果提示，C17orf91衍生hsa-miR-22-3p靶基因具有血小板反應蛋白1型基序1的ADAM金屬肽酶（ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 1,ADAMTS1）表達水平與多種抗癌藥物敏感性顯著相關：ADAMTS1在肝細胞癌組織中顯著低表達，且與雷帕霉素、Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV-939、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物的半抑制濃度（IC50）呈正相關，但與他莫昔芬、伏拉塞替等多種抗癌藥物的IC50呈負相關（圖5）。且ADAMTS1低表達提示雷帕霉素、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物IC50水平較低（圖6）。因此，ADAMTS1可能作為肝癌治療靶點，且ADAMTS1低表達肝細胞癌患者對雷帕霉素、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物敏感性可能較好。

圖5 靶向C17orf91-miRNA-mRNA調控網絡篩選潛在抗肝細胞癌藥物（C17orf91衍生的hsa-miR-22-3p在肝細胞癌中被下調，其調控靶標ADAMTS1亦在肝細胞癌中呈低表達，與雷帕霉素、XAV-939、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物的IC50呈正相關，但與他莫昔芬、伏拉塞替等多種抗癌藥物的IC50呈負相關）

圖6 ADAMTS1通過靶向C17orf91-miRNA-mRNA調控網絡作為肝細胞癌患者的潛在治療靶標

3 討論

長鏈非編碼RNA C17orf91可抑制肝細胞癌的生長發育，然而C17orf91在肝細胞癌中的相關研究依舊十分有限。利用全球基因芯片、測序數據來研究C17orf91的表達意義，探索C17orf91衍生miRNA、C17orf91相關miRNA的靶向調控關系，有助于深入剖析C17orf91抗肝細胞癌的分子機制，并對肝細胞癌患者靶向治療藥物的開發有一定的指導意義。

本研究立足于全球1 381例肝細胞癌及1 052例非癌肝組織樣本，從轉錄層面印證了C17orf91的低表達水平。本研究中，筆者采集了來自德國、韓國、美國、日本、瑞士、西班牙、意大利和中國這8個國家的總共32個單一的肝細胞癌基因芯片、基因高通量測序數據集，不僅證實了C17orf91在肝細胞癌組織中的低表達，還進一步闡明了C17orf91對肝細胞癌的中等區分能力。本研究納入的肝癌樣本量更大、面更廣，對研究C17orf91表達的臨床意義有極大的補充。

C17orf91作為miRNA宿主基因，與hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p有著密切聯系。在肝癌細胞系中，C17orf91來源的hsa-miR-22-3p可顯著抑制C17orf91敲除對肝癌細胞遷移、侵襲的促進作用[17]。此外，C17orf91衍生的hsa-miR-22-5p在肝細胞癌中低表達，且在經受放射治療后hsa-miR-22-5p表達水平升高[18]。這些研究表明hsa-miR-22-3p與hsa-miR-22-5p在肝細胞癌中可能發揮抑癌效果，其中hsamiR-22-5p還可能與肝癌的放療敏感性有關。本研究中，hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p的下調靶基因在肝細胞癌差異表達調控基因網絡中分別參與細胞遷移和血管發育。無獨有偶，hsa-miR-22-3p曾多次被報道可通過靶向組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 6,HDAC6）、PLAG1樣鋅指蛋白2（PLAG1 like zinc finger 2,PLAGL2）和OC1/血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）分別抑制晶狀體上皮、乳腺癌以及內皮祖細胞的遷移能力[19-21]。不僅如此，研究人員證實了hsa-miR-22-3p還可通過靶向下調Sp1轉錄因子[22]、靶向調控Snail1表達[23]、調控上皮-間質轉化相關基因（E-鈣黏蛋白、β-catenin、N-鈣黏蛋白和波形蛋白）[24]等多種機制抑制肝細胞癌細胞系的遷移能力。因此，hsa-miR-22-3p在肝細胞癌中的抑癌作用也極有可能是通過其5'端非翻譯區與靶基因的3'端非翻譯區進行不完全互補配對，從而抑制其靶基因介導的促細胞遷移機制。雖然目前尚無研究闡明hsa-miR-22-5p與血管發育有直接關聯，但不可否認的是，miR-22可促進促炎細胞因子的合成并通過靶向血管內皮-鈣黏蛋白誘發血管生成[25]。綜上所述，C17orf91對抗肝細胞癌的部分原因可能是hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p對下游靶基因的抑制作用。

本研究還進一步探索了hsa-miR-22-3p靶基因ADAMTS1作為肝癌治療靶點的潛能。ADAMTS1作為ADAMTS蛋白家族的一員，它所編碼的蛋白質含有2個去整合素環和3個C末端TS基序，并具有抗血管生成活性[26]。ADAMTS1可能是維持正常生長、生育能力以及器官形態和功能所必需，且其表達可能與各種炎癥過程以及癌癥惡病質的發展均有關。研究表明，ADAMTS1可抑制卵巢癌及纖維肉瘤細胞的增殖和遷移能力[27-28]。本研究中，筆者發現ADAMTS1在肝細胞癌中呈顯著低表達，且其低表達可能還提示癌癥細胞對雷帕霉素、莫特塞尼、博來霉素抗癌藥物具有更高敏感性。綜上，ADAMTS1有可能用于預測肝細胞癌對抗癌藥物的敏感程度。

然而，本研究尚存些許不足。C17orf91來源的hsa-miR-22-5p參與抑制血管發育的機制還未得到佐證。因此，在未來的研究中，還需要開展更進一步的實驗以證實本文提出的假說。

綜上所述，C17orf91在肝細胞癌組織中被顯著下調，且低表達C17orf91預示肝細胞癌患者預后不良。C17orf91來源的hsa-miR-22-3p和hsa-miR-22-5p可能參與抑制細胞遷移正性調控及血管發育。hsamiR-22-3p靶基因ADAMTS1可能作為肝細胞癌的治療靶點。