富血小板血漿聯合骨髓間充質干細胞促進兔前交叉韌帶重建后腱骨愈合

張 豪，楊保剛，陳 宇

(1.浙江省臺州醫院 急診科，浙江 臺州 317300；2.浙江省人民醫院 骨科，浙江 杭州 310014)

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)重建術是最常見的腱骨愈合手術，腱骨愈合效果不佳的原因是腱骨中的肌腱移植、礦化和成熟并不總是令人滿意。富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)是各種生長因子的自體富集來源，已在創傷和骨科手術中廣泛使用。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有促進肌腱再生的巨大潛力，含有來自骨髓的BMSCs的宿主細胞有助于腱骨愈合。Wnt/β-catenin途徑已被證明在骨骼發育中至關重要，并作為潛在靶點受到了廣泛關注。近年來，大量研究報告了Wnt/β-catenin信號通路在成骨分化和骨形成中起著重要作用，但PRP聯合BMSCs通過Wnt/β-catenin信號通路對兔ACL重建后腱骨愈合的研究甚少。因此，本實驗采用自體PRP聯合BMSCs頂端注射的方法將相應的凝膠注入骨道內，觀察PRP聯合BMSCs是否對腱骨愈合有促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 45只12 周齡新西蘭白兔，體質量(2.5±0.2)kg，購自浙江省實驗動物中心。

1.2 主要試劑 胎牛血清購自北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司；DMEM/F12培養基購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素、油紅O和茜紅素購自北京索萊寶科技有限公司；CD29、CD90、CD34、CD45、Wnt1、Wnt3a及β-catenin的抗體購自美國Abcam公司；兔VEGF ELISA試劑盒和兔TGF-β1 ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；β-actin抗體和IgG-HRP抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 BMSCs的提取、分離、培養及體外分化 取5只新西蘭兔下肢，75%乙醇浸泡后超凈工作臺中剝離附著的肌肉，充分暴露出股骨和脛骨。去除股骨和脛骨兩端的骨骺，用100 mL無菌注射器吸取DMEM/F12培養基反復沖洗髓腔至澄清。將沖洗出的骨髓吹打成懸液，1 000 ×g/min離心10 min，棄上清。加入DMEM/F12培養基，緩和吹洗；將上述重懸細胞液各取4 mL接種于細胞培養瓶中，加入含有15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM /F12培養基，置于37 ℃、5% CO的培養箱中培養。48 h后棄去培養基，PBS溶液沖洗 2～3次去除未貼壁細胞，加入完全培養基繼續培養。

1.4 PRP及實驗凝膠制備 造模前30 min抽取兔耳緣靜脈血5 mL，置于含有1 mL枸櫞酸鈉的無菌離心管中。3 000 ×g/min，離心15 min，全血分為3層，吸取上部血清及界面下少量紅細胞轉移至新的無菌離心管中；繼續3 000 ×g/min，離心15 min，去掉上層含有極少量未沉降血小板的血漿層，剩余血漿及血細胞成份搖勻即為PRP。在1 mL EP管中分別加入凝血酶與纖維蛋白原按1∶4比例混合，再加入1×10個/mL BMSCs細胞懸液、PRP。

1.5 模型制作、分組及給藥 40只新西蘭白兔隨機分為4組：control組、PRP組、BMSCs組和PRP+BMSCs組，每組10只。每只兔術前禁食12 h，耳緣靜脈注射水合氯醛麻醉，取左側下肢進行ACL重建術，其ACL重建術方法參照楊軍軍等報道。配制PRP和BMSCs凝膠，采用頂端注射的方法注入骨道內。control組僅注射生物蛋白凝膠1 mL；PRP組注射PRP凝膠1 mL；BMSCs組注射BMSCs凝膠1 mL；PRP+BMSCs組注射PRP及BMSCs凝膠1 mL。注射后用生物耳膠封閉骨道外口，最后逐層縫合傷口。術后前3天常規肌肉注射青霉素預防感染。術后28天各組新西蘭白兔經耳緣注射水合氯醛麻醉，進行取材。

1.6 觀察指標

1.6.1 細胞形態及分化鑒定 第3代BMSCs在含有脂向誘導劑的完全培養基中培養，進行2周的成脂分化，用0.5%油紅O染色細胞內脂滴顯示脂肪形成。第3代BMSCs在含有骨向誘導劑的完全培養基中培養4周，進行成骨分化，用2%茜素紅S(pH 4.1～4.3)染色評估。

1.6.2 BMSCs表面標記物鑒定 待第3代BMSCs融合至80%～90%時，將細胞以6 000個/μL的密度重懸，并分別用CD29、CD90、CD34和CD45抗體標記。隨后，在黑暗中孵育25 min， PBS洗滌2次后上機檢測表面標記CD29、CD90、CD34和CD45的表達。

1.6.3 兔腱骨病理變化 取各組兔重建韌帶后的膝關節，剔除關節周圍的組織，置于4%多聚甲醛中固定72 h，之后在室溫下用EDTA溶液脫鈣4周。組織經乙醇脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色，封片后使用顯微鏡進行拍攝。

1.6.4 各組兔血清中VEGF、TGF-β1含量的變化 各組兔經靜脈采血6～8 mL。靜置30 min后，以3 000 ×g/min，離心15 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書測定各組兔血清中VEGF、TGF-β1的含量。

1.6.5 各組兔腱骨結合處骨密度的變化 通過Micro-CT掃描儀在60 kV掃描電壓下以36 μm各向同性體素分辨率掃描所有組織，使用CTAn分析并計算腱骨結合處骨組織的骨密度。

1.6.6 各組兔腱骨最大加載負荷的變化 除重建的ACL之外的所有肌肉、軟組織、韌帶和縫線均被剔除；之后在Instron 553A材料測試系統中已45°屈曲固定，通過20 mm/min的速度連續增加拉伸負荷來進行測試，通過負荷-變性曲線記錄最大加載負荷。

1.6.7 各組兔腱骨界面組織中Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白的表達 RIPA裂解液提取各組兔腱骨界面組織中的總蛋白。各組蛋白變性后經上樣-電泳-轉膜-封閉-一抗孵育[Wnt1抗體(1∶1 000)、Wnt3a抗體(1∶1 000)、β-catenin抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶2 000)，4 ℃ 過夜]-二抗孵育[對應一抗種屬來源的IgG-HRP標記的二抗(1∶5 000)，室溫1.5 h]-顯影曝光，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統對蛋白條帶的灰度值進行分析。

2 結果

2.1 BMSCs的形態及分化鑒定 從新西蘭白兔股骨中提取的BMSCs具有梭形形狀而且呈旋渦分布(圖1A)，體外分化可見細胞內存在大量的脂質滴(圖1B)和許多鈣化結節(圖1C)。

A.BMSCs的形態(400×)；B.BMSCs的成脂分化(油紅O染色，400×)；C.BMSCs的成骨分化(茜素紅染色，200×)

2.2 BMSCs表面標記物鑒定 流式細胞術結果見圖2，第3代BMSCs的表面標記為CD29陽性(95.5%)、CD90陽性(97.2%)、CD34陰性(4.3%)和CD45陰性(2.8%)，與BMSCs的免疫表型特征一致。

圖2 BMSCs表面標記物檢測

2.3 各組兔腱骨病理變化 Control組中，肌腱和骨骼之間的界面主要由成纖維細胞組成，幾乎沒有發現膠原和軟骨纖維；PRP組中，肌腱和骨連接處的纖維和軟骨細胞增加；BMSCs組中，在肌腱和骨連接處的膠原纖維、軟骨細胞和纖維軟骨增加；PRP+BMSCs組中，肌腱和骨連接處的軟骨纖維和軟骨細胞較PRP和BMSCs組增加。見封三圖1。

2.4 各組兔血清中VEGF、TGF-β1含量及骨密度和最大加載負荷的變化 與PRP組和BMSCs組比較，PRP+BMSCs組兔血清中VEGF、TGF-β1含量和兔腱骨結合處骨密度、最大加載負荷均增加，差異均有統計學意義(均<0.05)。見表1。

表1 各組兔血清中VEGF、TGF-β1含量及骨密度和最大加載負荷的變化

2.5 各組兔腱骨界面組織中Wnt1、Wnt3a和β-catenin蛋白表達的變化 Western blot結果表明：與control組比較，PRP組、BMSCs組和PRP+BMSCs組兔腱骨界面組織中Wnt1、Wnt3a和β-catenin蛋白表達水平上調，且PRP+BMSCs組最高，差異均有統計學意義(均<0.01)。見圖3。

注：與control組比較，**P<0.01，***P<0.001；與PRP組比較，##P<0.01；與BMSCs組比較，&&P<0.01。

3 討論

前交叉韌帶(ACL)是膝蓋中的重要組成部分，其損傷是體育活動中的一種嚴重而常見的損傷。最近，外科重建加上軟組織自體移植或同種異體移植已成為ACL撕裂的標準治療方法，但是約有四分之一的患者長期效果不理想，因此尋找更好的方法改善肌腱-骨界面的愈合至關重要。

研究發現，干細胞療法在ACL重建后用于腱骨愈合具有生物學潛力。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是多能干細胞，可以在體外分化為多種細胞。實驗表明，骨髓間充質干細胞能夠在體內形成骨骼，這突出了治療應用的廣闊前景。我們從新西蘭白兔股骨中提取BMSCs，經過鑒定后，采用頂端注射的方法，將BMSCs凝膠1 mL注射到骨道內。經過28天后，我們發現，ACL兔肌腱和骨連接處的軟骨纖維和軟骨細胞增加、腱骨結合處骨密度和最大加載負荷也增加，提示BMSCs能促進前交叉韌帶重建后腱骨愈合。

VEGF是特異性作用于血管內皮細胞的生長因子，能夠促進損傷組織的血管新生。研究表明，VEGF在腱骨愈合過程中可促進愈合組織的再血管化，提高愈合韌帶的強度。TGF-β1是參與細胞外基質重建的細胞因子，對骨基質內膠原的合成具有促進作用，同時也能在一定程度上誘導成骨細胞的分化。在本實驗中，我們發現，PRP聯合BMSCs可促進VEGF和TGF-β1的生成，從而促進腱骨愈合。Wnt/β-catenin信號通路是一個調控細胞生長、發育和分化的重要信號途徑。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路的激活可以誘導成骨細胞分化，抑制破骨細胞分化并抑制軟骨形成。在本實驗中，PRP聯合BMSCs激活了Wnt/β-catenin信號途徑，從而促進肌腱-骨界面的骨形成，從而促進了腱骨愈合，與上述文獻報道一致。

綜上所述，PRP聯合BMSCs促進了VEGF和TGF-β1的生成、增加了肌腱和骨連接處的軟骨纖維和軟骨細胞、腱骨結合處骨密度和最大加載負荷，其有可能與Wnt/β-catenin信號途徑有關，因此，PRP聯合BMSCs具有臨床應用潛力。

感謝杭州醫學院基礎醫學與法醫學院鄧思思老師在實驗研究中給予的幫助。