隆X小車蝗線粒體基因組全序列測定與分析*

孔 勇， 王眾瀟， 汪雨馨， 李 冉

(曲阜師范大學生命科學學院，273165，山東省曲阜市)

0引 言

線粒體是一種真核細胞器，由兩層膜包被，廣泛存在于昆蟲體內，在控制昆蟲的新陳代謝、生命周期、凋亡、病害等方面起著重要作用[1]. 昆蟲線粒體基因組為閉合的環狀雙鏈DNA，總長一般為14～20 kb，能夠穩定地編碼37個基因[2,3]. 線粒體基因組具有母系遺傳、較為保守的基因組分、進化速率較快、不含內含子等優勢，廣泛應用于昆蟲系統發育、進化和種群遺傳等方面的研究[4-7]. 除此之外，在漫長的進化過程中，相比于祖先基因排列順序，有些昆蟲類群的某些基因在經歷重排事件后會發生方向和位置的改變[8]. 不同類群出現的基因重排在昆蟲基因組進化中具有一定規律，已有研究表明，基因重排能夠為探究昆蟲之間的系統發育和進化關系提供證據[9]. 自1995年首個直翅目Orthoptera昆蟲飛蝗Locustamigratoria的線粒體全基因組被報道以來，隨著各種測序技術的不斷發展，直翅目昆蟲的線粒體基因組全序列逐漸被測定和注釋[10-12]. 迄今已測序的物種零星散布在各類群，亟需更多物種的線粒體基因組數據，為深入理解直翅目昆蟲線粒體基因組起源和系統演化過程提供新的依據.

隆X小車蝗OedaleusabruptusThunberg,1815隸屬于直翅目Orthoptera蝗總科Acridoidea蝗科Acrididae斑翅蝗亞科Oedipodinae，主要分布于我國的湖南、湖北、福建、海南、廣東、云南、廣西等省份及地區[13]. 該物種是禾本科植物的一種重要害蟲，它的爆發對甘蔗、水稻、小麥、玉米、高粱等作物造成損害，進而影響農業發展[14]. 近年來對于隆X小車蝗的研究主要聚焦于行為和生理方面[14,15]. 由于其線粒體基因組的結構和進化特征仍不明確，對于該物種的系統發育分析主要基于單個基因或者形態特征[16]. 本研究采用Sanger測序技術測定隆X小車蝗的線粒體基因組全序列，對其基本結構、核酸組分、蛋白編碼基因、tRNA和rRNA以及非編碼區等信息進行全面分析，挖掘該物種的線粒體基因組特點，闡述其在直翅目昆蟲線粒體基因組中的進化共性. 同時，結合已發表的斑翅蝗亞科線粒體基因組序列對其系統發生關系進行了探討，為蝗科分類及直翅目線粒體基因組研究提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 供試材料

隆X小車蝗成蟲標本采集于海南省三亞市吉陽區六盤嶺. 所有標本均野外采集后保存于無水乙醇中，并長期貯存于實驗室超低溫冰箱(-80 ℃). 標本的形態鑒定工作由南京農業大學李保平教授幫助完成.

1.2 總DNA提取

本實驗主要選取隆X小車蝗的后足肌肉組織，使用吸附式DNA提取試劑盒(TransGen)提取分析樣本的基因組總DNA. 使用NanoDrop 2000微量核酸/蛋白分析儀檢測提取的總DNA的濃度和質量(純度). 對檢測合格的模板進行稀釋并分裝，DNA樣品置于超低溫冰箱保存待用.

1.3 引物設計和PCR擴增

本實驗選擇了5對直翅目昆蟲線粒體基因組通用引物[17,18]，將已擴增片段作為上下游序列，使用軟件Premier 5設計特異性引物，擴增通用引物無法得到的片段，進而獲取線粒體基因組全長序列[19]. 本研究選用擴增效率較高的ExTaq酶進行擴增，且總反應體系為25 μL. PCR反應程序為：93 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，45～60 ℃(根據引物而定)退火30 s，72 ℃延伸1 min(根據產物長度而定，擴增效率為1 min/kb)，擴增30個循環；98 ℃變性10 s，72 ℃延伸1 min(根據產物長度而定，擴增效率為1 min/kb)，擴增30個循環；72 ℃最后延伸7 min；4 ℃結束并保存. PCR擴增所得產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一、清晰且大小與本實驗所設計的擴增產物一致后，直接將PCR產物送至金斯瑞生物科技有限公司進行測序.

1.4 線粒體基因組組裝、注釋及分析

測序結果首先利用NCBI中的Blastn進行序列相似性比對，以確保所得序列為該物種的線粒體基因組序列. 隨后使用DNASTAR軟件中的SeqMan將測序數據進行拼接[20]. 最后，使用Geneious軟件對測序結果重疊組裝驗證[21]. 拼接完整的線粒體基因組序列使用在線軟件MITOS進行初步注釋[22]. 蛋白編碼基因的起始位置利用近緣種參考序列進行手動校正. 使用ARWEN和tRNAscan-SE兩個軟件預測tRNA的二級結構[23,24]. 基因間隔、基因重疊以及AT富集區通過MEGA比對確定[25]. 線粒體基因組結構圖通過在線軟件OGDRAW(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制. 使用PhyloSuite和MEGA統計和分析堿基組分、密碼子使用和同義密碼子使用頻率[25,26]. 核苷酸組分的偏好性，即AT偏好性和GC偏好性的計算公式為：AT-skew = (A-T)/(A+T)和GC-skew = (G-C)/(G+C)[27].

1.5 系統發育分析

為探究隆X小車蝗在斑翅蝗亞科中的分類地位及其系統發育關系，下載Genbank中的22個斑翅蝗亞科物種，并選取槌角蝗亞科Gomphocerinae的2個物種作為外群，重建系統發育樹. 使用PhyloSuite對13個蛋白編碼基因依次進行提取、比對、修剪、串聯、數據分區和模型選擇[28]. 利用RAxML和MrBayes分別構建ML樹(Maximum Likelihood)和BI樹(Bayesian Inference)[29,30]. 最后，使用Figtree 1.4對系統發育樹進行美化[31].

2 結 果

2.1 隆X小車蝗線粒體基因組結構

隆X小車蝗線粒體基因組為全長15 746 bp的閉合環狀雙鏈DNA結構(GenBank登錄號：MK352098). 該線粒體全基因組共由37個典型的基因組成，包含13個蛋白編碼基因(PCGs)，22個轉運RNA(tRNAs)，2個核糖體RNA(rRNA)以及1個主要的非編碼AT富集區(AT-rich region). 其中23個基因由J鏈(Majority strand，J-strand)編碼，包括9個PCGs和14個tRNAs；其余14個基因由N鏈(Minority strand，N-strand)編碼，包括4個PCGs、8個tRNAs和2個rRNAs(見圖1，表1). 與假定的祖先昆蟲亞庫巴果蠅Drosophilayakuba線粒體基因組相比，2個tRNAs的位置在進化過程中發生顛倒，即基因排列順序發生變化，由tRNALys—tRNAAsp重排為tRNAAsp—tRNALys.

圖1 隆X小車蝗線粒體基因組結構

表1 隆X小車蝗線粒體基因組的注釋和基因結構

2.2 隆X小車蝗線粒體基因組堿基組成

隆X小車蝗線粒體全基因組及其不同類型基因和AT富集區的核苷酸組分由MEGA分析統計. 結果顯示，該線粒體全基因組的堿基組分為：A=45.09%，T=30.31%，G=10.03%，C=14.58%；A+T總含量為75.40%. PCGs，tRNAs，rRNAs和AT富集區的A+T含量分別為：74.27%，74.10%，77.11%，86.31%. 除此之外，隆X小車蝗線粒體基因組全序列、tRNAs和AT富集區呈現AT偏斜，全線粒體基因組,PCGs,tRNAs和AT富集區呈現CG偏斜.

2.3 隆X小車蝗線粒體基因組蛋白編碼基因

隆X小車蝗線粒體基因組13個PCGs總長度為11 173 bp，約占全序列的70.96%，其中ATP8(156 bp)序列最短，ND5(1 714 bp)序列最長. ND1,ND4,ND4L和ND5等4個基因由N鏈編碼，其余9個基因由J鏈編碼(見表1). 13個基因均起始于典型的ATN密碼子(ATA，ATG，ATC，ATT)，其中7個基因以ATG作為起始密碼子. 終止密碼子方面，10個基因是以TAN(3個基因為TAG，8個基因為TAA)為終止密碼子，而COI,COII和ND5終止于不完整的密碼子T. 除終止密碼子外，共編碼3 714個氨基酸. 使用頻數最多的密碼子是AUU，共331次(RSCU=1.72)(圖2). 隆X小車蝗線粒體基因組所有蛋白質的氨基酸組成中異亮氨酸Isoleucine(Ile)，亮氨酸Leucine 2(Leu 2)和苯丙氨酸Phenylalanine(Phe)數量相對較多.

圖2 隆X小車蝗線粒體基因組蛋白編碼基因同義密碼子相對使用度

2.4 隆X小車蝗線粒體基因組tRNA基因和rRNA基因

隆X小車蝗線粒體基因組包含全部22個典型的tRNA基因，其中有2個氨基酸包含兩組同功受體(Leucine和Serine). 所有tRNA長度在64～71 bp之間，序列最長的是tRNASer(UCN)，tRNALys和tRNAVal，最短的是tRNAArg. 利用MITOS預測二級結構顯示，21個tRNAs都能夠形成典型的三葉草結構，具有完整的氨基酸接受臂、雙氫尿嘧啶(DHU)臂和TΨC臂，而tRNASer(AGN)由于缺少一個穩固的雙氫尿嘧啶(DHU)臂而無法形成三葉草結構(見圖3). 除了正常的堿基配對外，在預測的tRNA二級結構中共發現24個堿基錯配的情況，其中G—U錯配比較常見，共出現19對.

圖3 隆X小車蝗線粒體基因組tRNA基因的二級結構

隆X小車蝗線粒體基因組包含2個與其他蝗蟲序列具有同源性的rRNAs，分別是大亞基12S和大亞基16S. 12S的長度為828 bp，位于tRNAVal和AT富集區之間，16S長度為1 317 bp，位于tRNALeu(CUN)和tRNAVal之間.

2.5 隆X小車蝗線粒體基因組非編碼區

隆X小車蝗線粒體基因組共測得16個基因間隔區，長度為1～21 bp；且基因排列緊湊，共發現11個基因重疊區，長度為1～8 bp. 在基因ATP8與ATP6之間發現保守的重疊序列ATGATAA，在基因ND4與ND4L之間發現保守的重疊序列TTAACAT. 除此之外，隆X小車蝗線粒體基因組含有一段長的非編碼區(891 bp)，即為AT富集區或稱控制區，位于tRNASer(UCN)和ND1之間，A+T含量為86.31%，表現出明顯的AT堿基偏向性.

2.6 系統發育分析

為明確隆X小車蝗在斑翅蝗亞科中的系統發育地位，我們選擇25個物種(Genbank數據庫已提交的22個斑翅蝗亞科物種+1個新測物種+2個槌角蝗亞科外群)分別構建最大似然樹(ML)和貝葉斯樹(BI). 系統發育樹以PCG數據集(13 PCGs，11 082 bp)來構建. 結果表明BI樹的節點支持率總是高于ML樹、且兩種分析方法所得到的拓撲結構完全一致(見圖4). 系統發育分析均支持小車蝗屬Oedaleus為單系群，即該屬4個物種聚為一支. 同時，系統樹顯示小車蝗屬物種與云斑車蝗Gastrimargusmarmoratus(車蝗屬)為姐妹群，再與飛蝗屬Locusta聚在一起，由于車蝗屬目前僅僅只有1個物種具有線粒體基因組，此發育關系仍需要更多的取樣物種來驗證. 在小車蝗屬內部，隆X小車蝗與亞洲小車蝗Oedaleusasiaticus互為姐妹群，黃脛小車蝗Oedaleusinfernalis和紅脛小車蝗Oedaleusmanjius互為姐妹群. 具體的系統發育關系如下：((隆X小車蝗+亞洲小車蝗)+(黃脛小車蝗+紅脛小車蝗)).

圖4 基于13個蛋白編碼基因序列構建的斑翅蝗亞科系統發育樹

3討 論

直翅目昆蟲的線粒體基因組和其他昆蟲一樣為閉合雙鏈DNA，包含典型的37個基因：13個蛋白編碼基因，22個tRNA基因和2個rRNA基因. 目前已發表的直翅目昆蟲完整線粒體基因組長度為14 957 bp(蜢總科，Pseudothericlescompressifrons，KM657335)到17 033 bp(中華華綠螽Sinochlorasinensis，MK903598). 本研究所測的隆X小車蝗的線粒體全基因組為15 746 bp，介于直翅目線粒體基因組長度范圍之內，與已發表的斑翅蝗亞科昆蟲線粒體全基因組大小十分接近. 與假定的祖先昆蟲線粒體基因組相比，隆X小車蝗的2個tRNAs在進化過程中位置發生顛倒，由tRNALys—tRNAAsp重排為tRNAAsp—tRNALys. 目前，對造成基因重排現象的解釋有很多種，如重組、復制隨機刪除模型、復制非隨機丟失模型以及由tRNA基因錯誤起始引起的復制等. tRNAAsp—tRNALys重排在蝗下目昆蟲中非常保守，可以用復制隨機刪除模型解釋. 早期研究認為該重排模式可能是蝗下目Acrididea重要的進化特征，可為后續開展該類昆蟲系統發育研究提供假定的靶標[32]. 系統發育分析結果均顯示小車蝗屬與車蝗屬為姐妹群，而后與飛蝗屬聚為一支. 該系統發育關系與利用單個基因構建的系統發育結果并一致[33]，可能的原因是在我們的研究中車蝗屬僅有一個代表物種. 小車蝗屬4個種聚為一支且4個物種的進化關系為((隆X小車蝗+亞洲小車蝗)+(黃脛小車蝗+紅脛小車蝗)). 即在小車蝗屬中隆X小車蝗和亞洲小車蝗親緣關系較近，該結果支持傳統的形態分類和基于單個基因的系統發育分析[16]. 如需進一步明確小車蝗屬、車蝗屬和飛蝗屬的系統發育關系，更多的物種取樣和線粒體基因組序列需要補充.