Dectin-2受體介導宿主抵抗煙曲霉菌感染的研究

吳夢雪， 于 垚， 郭 文， 王蓉蓉， 賈鑫明

(同濟大學醫學院，上海 200092)

Dectin-2(由Clec4n編碼)最初鑒定為朗格漢斯細胞特異性C型凝集素受體，隨后研究發現在樹突狀細胞和巨噬細胞中也表達[6-7]。Dectin-2受體能夠識別白念珠菌細胞壁表面的α-甘露聚糖成分，激活脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)-核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)通路并促進樹突狀細胞和巨噬細胞分泌IL-12p40、IL-6等炎癥因子來啟動宿主天然免疫反應[8]。肺曲霉菌感染患者中肺泡巨噬細胞Dectin-2受體高表達，體外實驗發現該受體通過Syk依賴的NF-κB信號通路誘導活性氧的產生，并介導人肺泡巨噬細胞對煙曲霉菌膨脹態分生孢子的殺傷作用[9-10]。但在小鼠肺部感染模型中Dectin-2是否介導宿主抗煙曲霉菌感染是未知的，因此本文通過構建小鼠肺煙曲霉菌感染模型和煙曲霉菌刺激BMDMs的體外炎癥模型，探究Dectin-2受體在肺曲霉菌感染過程中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

本研究使用的煙曲霉菌株AF293為實驗室保存菌種，PDA培養基購自明舟生物，胎牛血清和DMEM培養基購自澳洲Gibco公司，鏈霉素-青霉素雙抗(PS)和無菌PBS購自南京維森特生物技術有限公司，TNF-α、IL-12p40和IL-6 ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，10%SDS-PAGE蛋白膠預混液和轉膜液購自美國Bio-Rad公司，20×TBS、吐溫-20、脫脂奶粉購自上海生工生物工程股份有限公司，ECL化學發光試劑購自上海默克生命科學有限公司，p-IκBα、p-Syk、Syk和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，HRP標記的鼠抗羊IgG抗體和兔抗羊IgG抗體購自上海艾比瑪特生物醫藥有限公司，37 ℃細胞恒溫培養箱、離心機、酶標儀購自美國Thermo Fisher公司，凝膠成像系統購自上海天能公司，垂直板凝膠電泳系統購自美國Bio-Rad公司，組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

野生型C57雌性小鼠購于上海斯萊克公司，Clec4n-/-小鼠為實驗室保存品系，本研究所用小鼠均飼養在同濟大學SPF級動物實驗中心。

1.3 方法

1.3.1 煙曲霉菌的培養及膨脹態分生孢子的制備 將煙曲霉菌孢子接種于PDA固體培養基上，于37 ℃ 培養箱中培養7 d，將煙曲霉菌分生孢子沖洗刮下，并經70 μm濾器過濾除去菌絲片段，濾液即為煙曲霉菌靜息態分生孢子(resting conidia, RC)。將RC置于1640基礎培養基中，37 ℃培養6 h，即可得到膨脹態分生孢子(swollen conidia, SC)。

1.3.2 小鼠肺煙曲霉菌感染模型的建立 小鼠經異氟烷麻醉后，將其垂直放置并拉出舌頭，用移液槍吸取30 μL包含4×107個煙曲霉菌分生孢子的懸液，緊貼舌根將孢子懸液緩緩滴入小鼠口腔中。小鼠感染2 d后處死，并摘取肺臟進行研磨。將研磨液進行梯度稀釋后，吸取100 μL涂布于PDA培養板上，37 ℃培養過夜，統計菌落個數。剩下的勻漿液離心(離心半徑8 cm，12 000 r/min，10 min)后取上清液，保存于-20 ℃，用于后續細胞因子的檢測。

1.3.3 體外SC刺激 BMDMsWT和Clec4n-/-小鼠骨髓細胞經紅細胞裂解液裂解后，加入DMEM培養基(10%FBS+1%雙抗+40 ng/mL M-CSF)，置于15 cm 平皿中在37 ℃恒溫培養箱培養3 d后，補液10 mL 上述培養基，繼續培養3 d后吸去培養基上清液，經Tris-EDTA-Nacl(TEN)緩沖液消化后，用DMEM完全培養基重懸BMDMs并進行計數。將BMDMs以3×106/mL的細胞密度植在12孔板內，并分為對照組、刺激20 min和40 min組。以6×105/mL的細胞密度將BMDMs植在48孔板內，分為對照組和刺激16 h組，每組3個復孔；按照感染復數(multiplicity of infection, MOI)=5向12孔板和48孔板的刺激組中加入經紫外線滅活的煙曲霉菌SC，放置于37 ℃培養箱中進行孵育。

1.3.4 Western印跡法 WT和Clec4n-/-小鼠BMDMs按照1.3.3分組處理后，刺激20 min和40 min 后棄去培養基上清液，加入預冷的含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，收集細胞上清液，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，95 ℃煮10 min進行變性。每組取10 μL進行SDA-PAGE，電泳結束后將蛋白電轉到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入p-IκBα(1∶500)，p-Syk(1∶1 000)，Syk(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后再加入1∶10 000稀釋的HRP-羊抗兔/鼠二抗，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次后經ECL化學發光試劑孵育，凝膠成像系統下成像。

1.3.5 ELISA 按照1.3.3分組處理，刺激16 h后收集48孔板中BMDMs上清液。將細胞上清液和1.3.2中肺臟勻漿液進行適當稀釋后，嚴格按照ELISA試劑盒的使用方法進行TNF-α、IL-12p40和IL-6的檢測。用酶標儀測定450 nm處吸光度，根據標準曲線計算出TNF-α、IL-12p40和IL-6的濃度。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 Dectin-2介導煙曲霉菌誘導的NF-κB信號通路的活化

在WT BMDMs中，煙曲霉菌刺激20 min和40 min 后，Syk和IκBα磷酸化水平逐漸增強，NF-κB信號通路被激活，而Clec4n-/-BMDMs中Syk和IκBα的磷酸化水平顯著降低，差異具有統計學意義，見圖1A、B。表明Dectin-2受體介導煙曲霉菌誘導的Syk依賴性NF-κB信號通路的活化。

圖1 Dectin-2缺失對BMDMs NF-κB通路的影響Fig.1 The effect of Dectin-2 deficiency on NF-κB pathway in BMDMsA: Western印跡法；B、C: p-Syk、p-IκBα定量分析；*P<0.05，****P<0.000 1

2.2 Dectin-2介導煙曲霉菌誘導的促炎細胞因子分泌

BMDMs在未刺激時分泌低水平的細胞因子，煙曲霉菌刺激16 h后，WT BMDMs產生高水平的IL-6、TNF-α和IL-12p40，和WT BMDMs相比，Clec4n-/-BMDMs產生的細胞因子水平顯著降低(P分別為0.004 2、0.001 9和P<0.000 1)，差異具有統計學意義，見圖2。表明Dectin-2受體參與介導煙曲霉菌誘導的BMDMs炎癥因子分泌。

圖2 Dectin-2缺失對BMDMs細胞因子分泌的影響Fig.2 The effects of Dectin-2 deficiency on cytokine secretion in BMDMsA: IL-6；B: TNF-α；C: IL-12p40；**P<0.01，****P<0.000 1

2.3 Dectin-2缺失增加小鼠對煙曲霉菌的易感性

煙曲霉菌感染2 d后，Clec4n-/-小鼠肺臟荷菌量顯著高于WT小鼠(P=0.003 2)，且差異具有統計學意義，見圖3。結果說明Dectin-2受體缺失增加了小鼠對煙曲霉菌的易感性。

圖3 Dectin-2缺失對小鼠肺臟荷菌量的影響Fig.3 The effect of Dectin-2 deficiency on fungal burdens of lungs in mice**P<0.01

2.4 Dectin-2缺失降低小鼠肺臟促炎細胞因子產生

WT和Clec4n-/-小鼠在未感染狀態下肺臟勻漿液中IL-6和IL-12p40水平較低，感染煙曲霉菌后，Clec4n-/-小鼠肺臟勻漿液中IL-6(P=0.008 8)和IL-12p40(P=0.001 7)的水平顯著低于WT小鼠，具有統計學意義，見圖4A、B。結果表明Dectin-2缺失降低了小鼠肺臟中促炎細胞因子的產生。

圖4 Dectin-2缺失對小鼠肺臟細胞因子的影響Fig.4 The effect of Dectin-2 deficiency on cytokine production of lungs in miceA: IL-6；B: IL-12p40；**P<0.01

3 討 論

Dectin-2是CLRs中的 Ⅱ 型跨膜受體，主要分布于髓系細胞表面[11]。研究表明Dectin-2能夠識別白念珠菌、馬拉色菌等多種真菌α-甘露聚糖和α-1，2-甘露糖殘基[12-13]。煙曲霉菌細胞壁中存在兩種甘露聚糖結構，分生孢子和菌絲體中都存在半乳甘露聚糖，而半乳糖胺半乳聚糖僅存在于菌絲體細胞壁中[14-15]，因此Dectin-2可能識別煙曲霉菌。本研究發現Dectin-2缺失降低了煙曲霉菌膨脹態分生孢子誘導的IL-6、TNF-α和IL-12p40的分泌，并降低NF-κB信號通路的活化。Dectin-2通過偶聯FcRγ啟動下游轉導信號，活化Syk后進一步誘導胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain protein 9, CARD9)、B細胞淋巴瘤因子(B-cell lymphoma 10, BCL10)和黏膜相關淋巴組織蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT1)形成三元復合物，從而激活NF-κB促進炎性細胞因子和趨化因子的產生[16]，另外Dectin-2還以CARD9非依賴方式激活細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)信號途徑介導抗真菌免疫[17]。以往結果發現Dectin-2通過Syk-磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinasePI3K)-CARD9信號通路介導樹突狀細胞吞噬新型隱球菌[18]。Dectin-2還能識別莢膜組織胞漿菌觸發Syk-C-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號通路以激活NLRP3炎性體和IL-1β釋放[19]。因此，本課題組后續將會探究煙曲霉菌刺激后Dectin-2缺失對ERK、JNK等信號通路影響。

Dectin-2缺失使小鼠感染白念珠菌后生存率顯著下降，但不影響宿主對隱球菌感染的防御能力[8,20]。研究發現在小鼠真菌性角膜感染模型中，Dectin-2缺失不影響宿主對煙曲霉菌的清除能力[21]。不同的是，在本研究發現Dectin-2缺失使小鼠對煙曲霉菌肺部感染易感性顯著增高，肺臟中促炎因子IL-6和IL-12p40顯著降低。和本次研究結果一致的是，在侵襲性曲霉菌病患者中發現了Dectin-2的純合缺失突變，導致該患者外周血單個核細胞受煙曲霉菌刺激后，IL-6和TNF-α的分泌發生缺陷[22]。靶向遞送包被Dectin-2蛋白胞外段的抗真菌脂質體，對侵襲性肺曲霉菌病有很好的治療作用[23]。另外，研究發現Dectin-2介導人漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)識別煙曲霉菌，Dectin-2抗體阻斷能夠降低煙曲霉菌刺激的pDC中TNF-α和IFN-α的產生及抗真菌活性[24]。以上結論更加佐證了Dectin-2在肺煙曲霉菌感染中具有重要作用。但Dectin-2在曲霉菌性角膜炎和肺部感染模型中發揮作用并不相同，這提示著Dectin-2在不同感染模型中作用機制可能存在差異。

本研究發現Dectin-2參與介導煙曲霉菌誘導的細胞因子分泌，但是Dectin-2受體缺失的BMDMs并沒有完全喪失分泌促炎細胞因子的能力，提示Dectin-2不是唯一參與識別煙曲霉菌的受體。除了研究最為廣泛的Dectin-1受體，其他CLRs也被報道參與到煙曲霉菌感染免疫中。DC-SIGN受體介導肺泡巨噬細胞和煙曲霉菌分生孢子的結合和內吞，但DC-SIGN敲低并不影響煙曲霉菌胚芽管刺激后未成熟樹突狀細胞TNF-α和IL-12的表達[25-26]。這些發現可能反映了固有免疫細胞對不同形態煙曲霉菌的響應機制存在差異。MBL受體可以和煙曲霉菌分生孢子結合，并且用重組人MBL治療可提高小鼠侵襲性肺曲霉菌病模型中的存活率，增強了促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的產生[27-28]。在大鼠煙曲霉菌角膜炎模型中，Mincle受體在感染早期表達上調，并抑制了煙曲霉菌角膜炎中性粒細胞和巨噬細胞的凋亡[29-30]。另外，在白念珠菌感染中Dectin-3缺失BMDMs中IL-6、TNF-α等促炎因子分泌減少，NF-κB激活水平降低，Dectin-2和Dectin-3 受體還能夠形成二聚體協同發揮抗白念珠菌感染作用[31]，但關于Dectin-3在煙曲霉菌感染中的研究還未有所報道。

總之，本研究發現在BMDMs中，C型凝集素受體Dectin-2激活煙曲霉菌誘導的NF-κB信號通路并介導促炎細胞因子的產生，在肺煙曲霉菌感染疾病中發揮重要作用。