HPLC法同時測定維C銀翹片中8種成分的含量

龐文娟，王麗，張生杰

（武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000）

維C銀翹片作為中西藥結合的代表藥品，既有中醫的治療特點，又有西藥退熱鎮痛功效。臨床上維C銀翹片用于治療流感引起的發熱、頭痛、咳嗽、口干和喉嚨痛[1-2]。經查詢國家藥品監督管理局數據庫，維C銀翹片作為中藥制劑已有批準文號306個，同時維C銀翹片也是一種治療上呼吸道感染非處方藥品，患者可以根據癥狀自行購買使用。但是據國家藥品不良反應監測數據顯示該品種存在一定的安全風險，雖然引起不良反應的原因是已知化學成分的不良反應，但是患者往往忽略了所添加的化學藥物，造成重復用藥而帶來新的安全風險[3]。此外，生產維C銀翹片的企業有上百家，每個廠家由于工藝、原輔料的差異使所生產的藥品在質量、臨床療效方面都存在很大差異?，F行維C銀翹片質量標準僅對馬來酸氯苯那敏、對乙酰氨基酚、維生素C、綠原酸、牛蒡子苷的含量進行了控制[4]，缺少對連翹和甘草的質量控制。這就造成很難用質量標準來有效的控制維C銀翹片質量。因此，建立能夠同時控制多個指標的方法對維C銀翹片質量進行控制，以保證藥品質量的穩定、安全，確保療效并降低用藥風險具有重要意義。目前已有文獻報道同時測定維C銀翹片多個成分含量的方法，普遍是選擇維生素C、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、牛蒡子苷這7種成分中的3種或4種進行同時測定的研究[5-8]，此外，也有研究利用多波長檢測技術或液質連用技術實現5～6種成分的同時測定[9-12]。本研究采用高效液相色譜法在同一個色譜條件下測定維C銀翹片中8種指標成分的含量，為通過提高維C銀翹片質量標準來控制原藥材質量，確保質量穩定和療效，提供了新的分析方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AD高效液相色譜，配DAD檢測器（日本島津）；Secura125-1CED型十萬之一電子天平（賽多利斯公司）；UA10MFD型超聲波清洗器（德國wiggens公司）。

1.2 材料 甘草酸銨對照品（批號：110731-201/619，含量：93.1%）、綠原酸對照品（批號：110753-200112，含量：100%）、連翹酯苷A對照品（批號：111810-201606，含量：93.4%）、甘草苷對照品（批號：11052-201611，含量：95.0%）、馬來酸氯苯那敏對照品（批號：100047-200606，含量：99.7%）、連翹苷對照品（批號：110821-201615，含量：94.9%）、牛蒡苷對照品（批號：110819-201007，含量：95.4%）、對乙酰氨基酚對照品（批號：100018-200408，含量：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；維C銀翹片（A廠家，批號：202006020，C20 201120；B廠家，批號：201101；C廠家，批號：20 200803；D廠家，批號：20200601）；乙腈（色譜級）（美國默克公司，批號：10945730812）；甲酸（色譜級）（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10332080）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；梯度洗脫時間程序：0～10.0 min，90%B；10.0～20.0 min，90%～80%B；20.0～30.0 min，80%B～70%B；30.0～45.0 min，70%B～80%B；45.0～55.0 min，80%B～90%B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：275 nm；進樣量：20 μL。

BNP屬于多肽類激素一種，是心血管系統的一種具有生物活性的重要激素，能在心肌受損時快速入血進行調節，能夠靈敏的反映出心肌受損的情況［6］，并且與心肌受損程度正相關，心肌損傷越嚴重BNP水平越高，它是一種常用且有效的心衰檢測指標。目前BNP已被納入心衰診斷指南，用于心衰患者的預測和診斷工作。本研究中，鉤藤人參高劑量組BNP水平與卡托普利組BNP水平相近，并明顯低于模型組，說明鉤藤人參高劑量組在降低HCHF大鼠BNP水平，改善心功能方面效果顯著。

2.5 精密度試驗 在所建色譜條件下，混合對照品溶液重復進樣6次，得到各待測組分峰面積，計算對乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨峰面積RSD值分別為0.06%、0.05%、0.20%、0.04%、0.45%、0.58%、0.51%、1.35%，表明所使用高效液相色譜儀精密度良好。

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨、對乙酰氨基酚對照品適量，用50%甲醇配成含對乙酰氨基酚（4 662 μg/mL）、綠原酸（222.5 μg/mL）、牛蒡苷（225.1 μg/mL）、馬來酸氯苯那 敏（135.73 μg/mL）、連翹酯苷A（60.12 μg/mL）、甘草苷（51.64 μg/mL）、甘草酸銨（87.48 μg/mL）、連翹苷（48.55 μg/mL）8種對照品的混合對照品溶液。

2.6 穩定性試驗 取維C銀翹片（批號：201101），平行制備6份供試品，按“2.1”項下色譜條件，考察24 h內樣品穩定性，每隔4 h取樣檢測1次，記錄待測成分峰面積，計算峰面積RSD值。乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨峰面積RSD值分別為0.15%、0.62%、0.88%、0.59%、0.91%、0.62%、0.28%、0.68%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，去除包衣，精密稱取細粉約0.20 g，置于棕色容量瓶中，精密加50%甲醇20 mL，稱質量，超聲（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱質量，用50%甲醇補足質量，過濾，取續濾液，即可。

2.9 含量測定 取5批維C銀翹片樣品，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，外標法計算樣品含量，結果見表3。

證明：假設(x(t),y(t),u(t),v(t))T為系統(1.1)的解，由系統(1.1)的第一個方程得，則由引理2.1的結果，易知

表1 8 種化學成分的線性關系、定量限和檢出限

2.2 溶液的制備

2.4 線性關系、定量限和檢出限考察 將混合對照品溶液逐步稀釋6、5、3、2倍，與混合對照品組成毓濃度梯度，按“2.1”項下色譜條件測定，以進樣量（μg）為橫坐標（x），峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸分析，求得回歸方程、相關系數（r）和線性范圍；通過連續稀釋混合對照溶液確定定量限和檢測限，當信號和噪聲之間的比值為3時所對應的濃度確定為檢測限，信號和噪聲之間的比值為10時所對應的濃度確定為定量限[13]，結果見表1。

她從頭到尾見證了他們被屠殺的過程。人的殘忍真是沒有極限，沒有止境。天下是沒有公理的，否則一群人怎么跑到別人的國家如此撒野?把別人國家的人如此欺負?她哭還因為自己國家的人就這樣軟弱，從來都是受人欺負。書娟哭得那個痛啊，把沖天冤屈都要哭出來。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取每份約0.10 g已知含量的維C銀翹片（批號：201101）6份，加入與待測組分含量相當的對照溶液，按建立的色譜條件進行分析，用回歸方程計算相應含量，并計算待測組分的平均加樣回收率和RSD值。結果表明，8種待測組分的加樣平均回收率在95.82%～101.08%之間，RSD＜2.0%，表明所建HPLC色譜方法的準確度良好。（見表2）

2.7 重復性試驗 取維C銀翹片（批號：201101）樣品細粉6份，按供試品溶液制備方法平行制備，按所建立的色譜條件進行分析，計算待測成分含量。乙酰氨基酚、綠原酸、連翹酯苷A、甘草苷、馬來酸氯苯那敏、連翹苷、牛蒡苷、甘草酸銨含量RSD值分別為0.48%、0.57%、0.74%、1.28%、1.30%、1.55%、0.75%、0.78，表明所建方法重復性良好。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.3 專屬性試驗 按“2.1”項下色譜條件，分別進樣20 μL混合對照品溶液和供試品溶液進行專屬性分析。測定結果表明，混合對照品8種待測成分，在供試品溶液保留時間（±0.5%）處都有特征峰，分離度、拖尾因子理論塔板數均滿足定量分析要求，其他成分峰對待測成分無干擾。（見圖1）

表3 維C 銀翹片樣品測定結果（mg/g）

3 討 論

3.1 待測成分的選擇 維C銀翹片是在經典名方銀翹散基礎上添加西藥組成的中西藥復方制劑。在銀翹散方劑中金銀花、連翹發揮主要療效，相須配伍使用同為君藥，故本研究選擇用綠原酸、連翹脂苷A、連翹苷3個指標成分控制其質量。市場銷售連翹飲片質量分析發現連翹分為青翹、老翹，其連翹脂苷A與連翹苷存在明顯差異，用連翹脂苷A、連翹苷兩種成分同時控制連翹質量更為全面[14-15]。牛蒡苷為牛蒡子的指標成分，能夠直接反映牛蒡子質量狀況，且不同產地牛蒡子中牛蒡苷含量有差異[16]?，F代藥理研究發現甘草苷、甘草酸銨具有明顯的糖皮質激素樣作用[17]，甘草苷和甘草酸銨最大的副作用是由高血壓和低鉀血癥引起的繼發性疾病[18]，故應控制維C銀翹片中甘草的質量以保障療效的穩定。維C銀翹片不良反應主要是由對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏引起的，對其含量控制是保障維C銀翹片安全性的重要質控指標[3]。綜上選擇用上述8種成分能夠更好地控制維C銀翹片質量，以減少用藥風險。

周澤贍霍地一下睜開了眼，門外小雞叫聲已沒先前那么大了。周澤贍把被子掀開，猛地坐起，衣服也不穿就跑了出去。

3.2 優化色譜條件 本研究對確定的8種待測成分在190～700 nm內進行全波長掃描，同時考慮8種成分在維C銀翹片中含量在同一色譜條件下的響應值，為確保各成分峰面積能夠同時滿足定量需求，故確定檢測波長為275 nm。在此波長下待測成分均具有良好的吸收，在供試品色譜中各成分色譜峰能夠實現較好的分離，且能夠滿足在同一色譜條件下定量分析的系統適用性。因待測成分極性差異較大，為實現8種成分同時測定，需選用梯度洗脫。此外，本研究還考察了不同流動相組成對峰形的影響，試驗證明加入0.1%甲酸時峰形最好，并對梯度洗脫時間程序進行優化已實現良好的分離效果?！?.1”項下色譜條件能夠在35 min內實現8種待測成分的同時定量分析。

我打算說點什么，想向他保證，我可以撐下去，也許吧——，但話到嘴邊又咽了回去，不知為什么?？赡芤驗槲也幌朐倏吹桨鹂四菑埬?，也不喜歡他盯著我，甚至永遠不想讓他再看我。

3.3 維C銀翹片質量分析 本研究通過測定維C銀翹片中8種成分的含量發現，不同廠家生產的維C銀翹片和同一廠家生產的維C銀翹片8種成分含量存在明顯的差異，尤其是《中華人民共和國藥典》標準中未列出的質控成分差別更明顯，比如連翹苷A的最高含量是最低含量的兩倍多，甘草酸差別竟高達3倍。這可能為市場上銷售的維C銀翹片質量和療效參差不齊的原因，因此增加維C銀翹片質量控制成分，對其安全性和保證療效尤為重要。本試驗因缺少足夠的樣品并未對市售維C銀翹片的質量進行系統的評價分析，建議市場監督部門加大對維C銀翹片監督抽驗，同時應提高維C銀翹片質量標準以確保安全性和療效。本分析方法不足之處在于未將維生素C納入此分析方法中進行多成分同時測定。維生素C特殊的化學性質，使其在該色譜條件下出峰較早，容易與溶劑峰混淆很難進行定量分析，故本分析方法未能實現同時測定。維生素C常作為抗氧化劑以預防或治療壞血病，超劑量服用可能會導致胃腸道不適、頭痛、失眠等不良反應，且目前尚無具體研究證明其能預防或治療感冒[19]，因此在以后的分析研究中應加以關注。