白酒釀造微生物的生物多樣性歸納分析研究

馬 楠

（西南民族大學食品科學與技術學院，四川 成都 610041）

白酒釀造過程中，微生物在酒曲、酒醅、窖泥中參與了淀粉或糖質的糖化、發酵、產酯生香過程，因此微生物的生態分布情況、種群結構狀態和代謝消長過程直接影響發酵結果。同時，與風味功能有關的微生物結構決定了白酒的釀造質量和香氣類別，是影響白酒香型的關鍵。深入研究白酒中微生物的多樣性可以更好地對白酒釀造技術進行創新，提高白酒的釀造品質、產量等。

我國進入農耕時代較早，掌握了多種糧食種植技術。大部分地區的氣候為夏雨冬干。夏季的雨量較為集中且溫度較高、濕度較大，能夠給微生物提供較為適宜的生長環境。每年從6 月6 日到7 月19 日，我國南方大部分地區處于梅雨季節，此時間段內釀酒所用的糧食水果等原料中更容易產生霉菌，氣候、濕度、溫度等自然條件均適合微生物的生長，有利于人們成功釀造出各類美酒。

現階段，相關學者通過現代生物技術對白酒釀造過程中涉及的微生物情況進行了詳細的研究。陳雪等對鳳香型白酒中的微生物進行了研究，發現該種香型的白酒共含有細菌182 種，真菌32 種，且乳酸桿菌的種群數量占絕對優勢；詳細分析了白酒理化因子與微生物多樣性之間的關系，研究證明細菌多樣性和溫度之間呈負相關，還原糖和淀粉之間呈正相關的關系。崔鳳嬌等對芝麻香型白酒中的微生物多樣性進行了研究，發現在發酵前期，白酒中的優勢菌屬為芽孢桿菌，發酵后期，優勢菌屬變成了乳桿菌，其次才是芽孢桿菌；在酵母方面，伊薩酵母為優勢菌群，其次為假絲酵母和釀酒酵母。

本文以現有研究成果作為基礎，從酒曲、酒醅、窖泥3 個方面分析多種香型白酒釀造過程中的微生物多樣性，總結出微生物多樣性與理化指標之間的關系，并將該關系應用于多種釀酒工藝中，進一步提高白酒的產量和品質。

1 多香型白酒酒曲微生物多樣性分析

曲最早指的是發霉的谷物種子，經過不斷地改良逐漸形成了“曲衣”的說法，指的是含有霉孢子的糧食曲。酒曲在發展初期，微生物種類還較為單一，主要以米曲霉為主，其次為酵母菌。漢代后餅曲逐漸流行，餅曲能夠繁殖出的微生物種類更多，使得微生物組成也更加豐富，更具多樣性，此時酒曲中酵母菌也逐漸增多。后來釀酒者在酒曲中加入了一些草本植物使得各菌群的維生素營養更充分，生成也更為旺盛，也就逐漸形成了現階段邊糖化邊發酵的復式發酵工藝。

微生物對脂肪和蛋白質分解及其自身代謝而產生的分解物會影響酒曲中微生物的多樣性。與高等生物相比，微生物的地域分布特征不明顯，但是更容易隨著氣流運動。因此酒曲中微生物大多數來源于釀造環境、保溫蘆葦等，或者是由各種釀造原料帶入的，主要以細菌和酵母菌為主。

從濃香型、醬香型、清香型3 種香型白酒的釀造過程出發，總結酒曲中微生物的變化情況。經過歸納研究分析，三者釀造環境中的微生物種類大致相同，但由于制曲工藝和釀造原料的不同，酒曲中的微生物種類存在細微差異。

2.1 濃香型白酒酒曲微生物分析

對現階段最為大眾所熟悉的濃香型白酒——瀘州老窖的酒曲微生物進行研究。常用的方法有克隆文庫方法單獨分析成品酒曲微生物組成，也可以與其他方法相結合研究酒曲不同位置細菌和真菌組成的差異。與傳統的研究方法相比，克隆文庫可以獲得更加豐富的多樣性信息。

據研究報道，將瀘州老窖同一批次質量不同的3 種高溫大曲，根據顏色由深到淺分別記為F1、F2、F3。該酒廠夏天濃香型白酒生產堆積的時間是32 h 左右，在堆積過程中跟蹤取樣。取樣時從兩端及中間取樣并混勻，并記錄取樣時的溫度。觀察樣品酒曲在發酵過程中各微生物的消長變化情況如下：

樣品酒的酒曲中根霉較多，曲霉次之，優質曲中紅曲霉也相對較多。這是因為瀘州老窖的酒曲配置溫度最高不超過55 ℃，因此霉菌和酵母菌存活率較高，酒曲中兩種菌屬的含量也就相對較高。

2.2 醬香型白酒酒曲微生物分析

醬香型白酒主要選取醬香高溫大曲進行研究。研究方法與濃香型白酒相同。酒曲在發酵過程中微生物變化情況如下：

醬香高溫大曲中除了存在根霉、曲霉兩種霉菌以外，還存在少部分耐高溫霉菌，細菌數量占優勢，大致有97.6%，霉菌占據2.3%，而酵母菌不容易被檢測出來。

這是因為高溫制曲是制作醬香型白酒的主要技藝，在其酒曲制作過程中微生物生長會釋放大量的熱量，導致曲塊的溫度能夠達到60 ℃以上，而大多數霉菌和酵母菌在如此高的溫度下都難以存活，因此醬香高溫大曲中霉菌和酵母菌的含量極少。

2.3 清香型白酒酒曲微生物分析

汾酒是清香型白酒的代表，因此以汾酒為例分析清香型白酒在釀造過程中酒曲微生物的變化情況，相關研究結果如下：

汾酒酒曲中的細菌分布情況與瀘州老窖較為相似，均含有較多的乳酸菌、醋酸菌及芽孢桿菌。汾酒的酒曲配置溫度最高不超過50 ℃，因此霉菌和酵母菌存活率較高，酒曲中兩種菌屬的含量也就相對較高。大曲樣品中細菌和芽孢桿菌的數量較高，其中芽孢桿菌的數量較高，該種大曲的“穿衣”效果較為明顯。大曲的“穿衣”一般是微生物尤其是霉菌生長好壞的外在表現特征，由于霉菌在生長繁殖過程中可產生糖化酶、液化酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶類，所以霉菌的生長繁殖狀況對各種酶活力有很大的影響。

此外由于白酒酒曲大部分是靠天然接種培制的，往往也會存在一些不利于釀造的微生物，如上述3 種研究對象中均檢測出了一些犁頭霉，根據多年釀造經驗可以判斷該類霉菌會對酒的釀造質量產生一定的負面影響，例如：如果汾酒的酒曲中含有較多的犁頭霉就會產生微弱苦味。

3 多香型白酒酒醅微生物多樣性分析

酒醅的微生物區系較為復雜，是釀酒過程中研究微生物多樣性的重要對象。在整個發酵過程中，微生物代謝形成的不同酶菌會引起一系列的生化反應，使得白酒形成不同風味，因此本文對不同風味白酒糟醅中的微生物進行分析。

現階段，利用DGGE 指紋圖譜可以比較直觀的觀察微生物菌落的變化，常結合圖像分析軟件，計算微生物群落的多樣性指數及聚類分析。利用DGGE 研究酒醅微生物群落組成的變化，分析與微生物生長環境理化因子以及白酒質量相關的關鍵風味物質變化的關系，對于揭示白酒的釀造機理有十分重要的意義。

3.1 濃香型白酒酒醅微生物分析

通過現代生物學技術對濃香型白酒酒糟中的真核和原核生物進行研究。分析微生物生長、轉化和分布情況后得出如下結論：大多數細菌都在上層酒醅中，只有酵母菌在底層的酒醅中，且霉菌在酒醅中含量較少。

白酒發酵初期，酵母菌、堿性厭氧細菌和霉菌的菌群數量會大幅度增加。隨著發酵的不斷深入，各類菌群數量均有所降低。發酵中期，細菌、酵母會逐漸成為優勢菌群。發酵后期，酵母菌種總量減少，直至不能被檢測出來，數量接近于零。而芽孢桿菌會逐漸增多。

通過對微生物16S rRNA 序列的同源性進行對比，發現糟醅中的原核生物主要是古細菌，如真菌、甲烷囊菌以及甲烷螺桿菌等。

有文獻對現階段最為大眾所熟悉的濃香型白酒——瀘州老窖進行研究。白酒窖內中層中心和周圍的糟醅，在發酵過程中各細菌的消長變化情況如下：剛入窖時期，微生物的多樣性較高，發酵7 d后細菌種類減少，且嗜酸乳桿菌成為優勢菌群。發酵一個月時，散囊菌屬與曲霉菌屬代替了嗜酸乳桿菌成為優勢菌群，實驗前被認為大量存在的酵母屬僅在發酵一周后的糟醅中層邊緣處微量存在，這表明了酵母屬在瀘州老窖的釀造過程中不是主要菌屬，這是因為瀘州老窖在釀造過程中使用了回酒蒸餾技術，給嗜酸乳桿菌的大量產生提供了時機。

不同的釀造環境所產生的微生物也略有差異，與上文瀘州老窖相似的濃香型酒——習酒和全興酒的酒糟中也以乳桿菌為優勢菌群，而宜賓多糧酒的酒糟中優勢菌則有所不同，主要是以芽孢桿菌為主。此外全興酒的優勢菌群除了與瀘州老窖相同的曲霉菌屬、伊薩酵母菌群以外還有酵母菌屬、犁頭菌屬以及復膜孢子酵母菌屬。這是由于全興酒多釀造于盛夏，所以在發酵初期檢測到的優勢菌多數為未培養菌以及通常分布于土壤中的魏斯氏菌屬。

3.2 醬香型白酒酒醅微生物分析

醬香型白酒與濃香型白酒存在一定差異，醬香型白酒的酒醅表現在兩個方面，分別為窖內發酵酒醅和高溫堆積酒醅。醬香型白酒異于其他香型白酒的釀造工藝，使得酒醅中的微生物區系較為特殊，這也在一定程度上給微生物多樣性的研究增加了難度。

醬香型白酒的高溫制曲工藝導致大量酵母菌死亡。酒醅堆積的過程中，微生物又被網羅其中，再次增加了微生物的多樣性。

據研究報道，醬香型白酒在酒醅堆積過程中，酵母菌的數量會快速升高，細菌的數量隨之降低，且隨著堆積輪次的增多酒醅中的總菌群數量會逐漸降低。在窖內發酵過程中，各類細菌和酵母菌都會不斷減少。發酵后期，乳酸菌會逐漸減少，直至無法被檢測出來。醬香型白酒的制曲溫度一般在50 ℃左右，酒醅中的細菌也以中溫嗜熱菌為主，多為芽孢桿菌屬，還有少量葡萄球菌屬，酵母菌主要為假絲酵母、裂殖酵母屬。

在醬香型白酒冬季生產過程中，堆積的酒醅內部或表層處會出現星白色或微黃色的團狀物，一般帶“霉味”，且酒醅干燥，下窖時酒精味較濃。這種現象稱為“腰線”。有研究采用稀釋涂布法對不同腰線酒醅樣品的酵母與霉菌進行分離，培養基稀釋度分別為10、10、10，于30 ℃恒溫培養箱中靜置培養。3 d 后按平板計數法對酵母菌計數,并對不同形態菌株進行分離與純化。7 d 后，按同樣方法對霉菌菌落計數與分離。實驗發現在該過程中細菌數量和種類的比例有所下降，而酵母菌數量和種類的比例不斷增多。窖內發酵初期細菌的總量下降，酒醅的中上層酵母菌減少。發酵中期，細菌數量會有小幅度的回升，下層的酵母菌數量會迅速增多，隨后又緩慢降低。霉菌的數量在發酵初期慢慢減少，中期時會有所回升，之后基本保持穩定。

3.3 鳳香型及清香型白酒酒醅微生物分析

汾酒為清香型白酒的代表，其生產過程實質為霉菌、酵母菌、細菌互相作用的結果。通過模擬汾酒的發酵過程發現其主要功能菌為細菌和酵母菌。乳酸乙酯是清香白酒的主要香氣成分，其比例略低于乙酸乙酯。夏季溫度升高時，釀酒環境中乳酸菌數量迅速增加，乳酸菌代謝產物——乳酸，經過酯化作用合成乳酸乙酯，導致乳酸乙酯和乙酸乙酯的比例失衡。

另外據有關報道，汾酒酒醅大米查、二米查中的菌群數量在發酵過程中出現了二次生長，但生長過程不完全一致。發酵初期時，大米查中的乳酸菌數量比二米查要多，還存在較少的霉菌，發酵至中期時，二米查的酵母數量多于大米查，發酵后期時大米查逐漸增多的微生物主要為細菌，而二米查中除了細菌變多以外酵母菌數量也逐漸上升。

在發酵過程中，微生物種群的變化情況鳳型與清香型大致相同，存在差異的地方是鳳香型白酒的酒醅中含有較多的放線菌，尤其是在發酵的中期和末期，糟醅中的數量最多。

4 白酒窖泥微生物多樣性分析

來自操作環境、窖泥、酒曲等處的各種微生物在酒糟和窖泥中演變、遷徙、能量變換，形成了窖池的微生物區系。各區系達到平衡，意味著固態階段發酵完成。

通過觀察發現窖池中微生物的多樣性和釀造環境的微生態有很大關系，微生物的多樣性是窖池中微生態系統的一部分。釀酒物質的能量代謝與微生物的消長共同促進窖池的生態演變，因此分析釀酒窖池中微生物的多樣性，能夠給微生物工業應用提供可靠的數據支撐。

窖泥是釀造白酒過程中微生物的棲息環境，其中不同種類的微生物會不斷演替代謝，在發酵的整個過程中會出現非常明顯的多態性。窖泥中的環境也較為特殊，其乙醇含量較高，pH 值和氧含量較低，導致了微生物群落結構也更具多樣性。窖泥是各功能菌的繁殖載體，直接與白酒香味的形成相關。張應剛等分別檢測瀘州老窖5 年、30 年、100年、300 年窖泥中的微生物后，結果表明，5 年窖齡的窖泥中優勢菌屬分別為根霉屬、孢子菌屬；100年窖齡的窖泥中優勢菌屬分別為曲霉屬、假絲酵母屬；300年窖泥中的古細菌主要是廣域古菌，占總菌數的9.2 %～16.5 %；30 年的窖泥中廣域古菌占總菌數的0.6 %，相較于300 年窖泥含量更低。30 年窖泥中的優勢菌門為厚壁菌門，占總數的90 %以上，厚壁菌門中又以乳酸菌屬為主，約占總數的92 %以上；而在300 年窖中厚壁菌門也為優勢菌門，占比在43 %以上，也以乳酸菌為主，但是僅占總數的20 %左右。此外，30 年窖泥中還存在梭菌屬和甲烷共生梭菌屬，分別占總數的21 %和2.7%。300 年窖泥中也存在以上兩種菌屬，但是占比少，分別為2.5 %和0.36 %。從以上分析可以看出，年限不同的白酒窖泥微生物菌落結構也不同，而對于不同類型的白酒，窖泥微生物菌落結構也不同，在白酒窖泥微生物多樣性分析中，湯溝白酒退化窖泥、普通窖泥、優質窖泥中的微生物菌落結構具有典型性。退化窖泥中的優勢菌屬為乳桿菌屬；普通窖泥中的優勢菌屬為乳桿菌屬、甲烷共生梭菌屬等；優質窖泥中的優勢菌屬主要為乳桿菌屬、梭狀芽胞桿菌、甲烷共生梭菌屬等。隨著窖泥質量的提升，乳酸桿菌屬的質量逐漸減少，梭狀芽胞桿菌、類桿菌、甲烷諾桿菌等菌群逐漸增多，這就表明后3 種菌屬能夠在一定程度上提高窖泥質量。此外在分析的過程中還發現較高的乳酸含量和有機磷含量、低pH 值可能為窖泥質量發生退化的主要外因。

5 小結

在白酒釀造過程中酵母菌以釀酒酵母、生香酵母等參與發酵。其中釀酒酵母的產醇能力最強，生香酵母具有強大的糖化、酒化、產酯能力，能夠增加酒醅中的酯類物質含量，使白酒呈現出不同的香味。

常見的細菌有乙酸菌、乳酸菌、丁酸菌、醋酸菌。乳酸菌會促進釀酒原料中的發酵糖類轉化為乳酸，乳酸酯化后形成乳酸乙酯。乳酸乙酯為白酒產生香味的主要物質之一，但是若含量過高也會使酒體有悶頭的口感。醋酸也是白酒的主要生香物質，但是含量過多會導致白酒中有刺激性酸味出現。乙酸菌和丁酸菌多分布在窖泥中，是生香物質乙酸乙酯和丁酸乙酯的前體。實際參與釀造的微生物還有很多，總體來說微生物的多樣性越高，則白酒的口感就越為豐富，品質也就越高。因此，在釀酒的過程中需要嚴格控制以上幾種酵母和細菌的含量，使白酒的品質和口感更佳。

本文對白酒釀造中微生物的多樣性進行了歸納研究，以瀘州老窖、茅臺、汾酒等不同釀造環境下的白酒作為分析目標，分別闡述不同香型白酒釀酒微生物多樣性的變化情況，總結出相關規律。若這些微生物的相關研究成果能實際應用于傳統釀酒工藝中，必將能進一步提高白酒的釀造品質。