外泌體的提取、貯存及其臨床應用進展

張芮浩，張曉勃綜述，袁文歡，周海宇審校

1.蘭州大學第二醫院骨科，甘肅 蘭州 730030；

2.甘肅省骨關節疾病研究重點實驗室，甘肅蘭州 730030；

3.內蒙古自治區包頭一附院核磁科，內蒙古包頭 014010；

4.蘭州市西固區人民醫院骨科，甘肅蘭州 730060

外泌體是細胞分泌的納米級細胞外囊泡，大小30～150 nm，攜帶核酸、蛋白質、脂質和其他生物活性物質，在人體的生理和病理過程中發揮重要作用。外泌體首先發生于內體膜的內陷，內陷后形成細胞內囊泡，隨著小囊泡的積累，內體轉化為多囊體。多囊體大部分進入溶酶體后被降解，其余的在與細胞膜融合后釋放到細胞外，成為細胞外囊泡。外泌體最初由JOHNSTONE等［1］在體外培養綿羊網織紅細胞時發現，當時被認為是“細胞灰塵”，為細胞處置自身廢物的一種機制，因此并未引起注意。2007年，VALADI等［2］首次證實外泌體同時含有功能性mRNA和miRNA，它們可以轉移至其他細胞，并在稱為“外泌體穿梭RNA”的新位置發揮作用。自此，外泌體引起了廣泛關注。與脂質體和其他納米顆粒等載體相比，外泌體由于其內在特性，在疾病診斷和治療領域具有廣泛而獨特的優勢。但外泌體的提取純化以及貯存等條件限制了其臨床應用。因此，需進一步探索優化外泌體的提取和貯存條件，促進后續外泌體功能的研究。本文對外泌體的特性、提取和貯存手段及其臨床應用進展作一綜述。

1 外泌體的特性

外泌體的特征是小RNA的聚集，包括mRNA、miRNA、轉運RNA（tRNA）和長鏈非編碼RNA（lnc-RNA）［3-4］。這些RNA分子與蛋白質一起作為遺傳物質，通過外泌體轉移并在細胞間傳遞通訊信息［5］。外泌體通過與細胞膜或配體結合，將信號傳遞給受體細胞后，導致受體細胞的行為發生變化［6-7］。在外泌體生成和釋放的不同階段，外泌體貨物和膜的組成會發生變化，從而導致異質性外泌體種群。外泌體所攜帶的脂質和蛋白質類似于起源細胞中的脂質和蛋白質，它們與受體細胞相互作用以觸發貨物釋放或信號轉導級聯誘導，最終導致細胞活性或功能的改變［8］。與干細胞和其他成分相比，外泌體具有性質穩定、易保存、易轉化等優點，且具有非免疫原性。其為無細胞靶向治療的合適選擇，可作為特定基因或治療疾病的藥物的載體［9］。

2 外泌體的提取純化

當前用于分離外泌體的主要純化方法包括超速離心法（ultracentrifugation，UC）、尺寸排阻色譜法、聚合物沉淀法（試劑盒法）。UC是通過離心作用分步去除細胞、細胞碎片和大囊泡，再沉淀外泌體。由于其操作簡單，外泌體回收率高，是最常用的外泌體純化方法。但UC會破壞外泌體的完整性，且蛋白質污染率高［10］。盡管有研究表明UC可有效地從黏度較低的液體（如培養基、尿液和灌洗液）中提取外泌體，但從黏性液體（如血清）中回收外泌體的效率較低［11］。研究顯示，在外泌體顆粒和蛋白質回收率方面，尺寸排阻色譜法優于UC［12］。外泌體聚合物沉淀法是將含有聚合物的沉淀溶液與生物體液混合，從而沉淀外泌體。目前已有成熟的PEG-base商業試劑盒（如ExoQuickTM）。試劑盒提取方法可以獲得純度較高的外泌體，且操作簡單，不需要高度精密的儀器設備。用外泌體RNA分離試劑盒獲得的RNA含量高于UC［11，13］。

但上述外泌體的分離和提取方法較費時，而且很大程度上取決于預分離步驟。這些方法會導致外泌體和外泌體RNA的濃度、純度以及大小發生變化［13-14］。使用商業提取試劑盒需大量的樣品進行處理，試劑盒和試劑昂貴，操作繁瑣且設備復雜，結果易出現偏差［15］。增加產量和純度并保持其生物學特性的標準化分離方法是目前限制外泌體應用的主要挑戰，開發更有效的外泌體分離方法將促進外泌體藥物遞送（如基于核酸的藥物）系統的開發。外泌體鑒定方法包括形態鑒定（電子顯微鏡）、粒度測量（直徑分析）和標記蛋白檢測（蛋白質印跡），其中，透射電子顯微鏡用于清晰觀察外泌體的大小和形狀，被認為是金標準鑒定方法［16］。

3 外泌體的貯存

貯存溫度是維持細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）活性的重要因素［17］。先前的研究表明，高溫貯存減少了外泌體保留的數量和外泌體含量，而在-80℃下貯存則引起較少的變化［18-19］。因此，目前在磷酸鹽緩沖液中通常的貯存條件是-80℃。最近的研究表明，低溫會影響EV脂質膜的穩定性，而在低溫下形成的冰晶會造成機械損傷，甚至損壞脂質膜，并導致其含量及相應的生物學功能喪失［20］。在20或4℃下保存1 d，EV的抗菌作用會大大降低。在-20℃下貯存28 d，會導致EV尺寸變化和抗菌功能喪失［21］。盡管在-80℃下貯存會對外泌體的數量和大小產生較大影響，但其可部分保留28 d的抗菌功能，極大改變了EV的結構和功能特性。當需要進行功能測試時，最好使用剛提取的EV［21］。由于外泌體的存貯時間較短，商業化外泌體無法確保其功能的完整性，需進一步完善外泌體的保存條件。

與先前研究不同，MAROTO等［22］發現，在冰凍條件下，外泌體的大小增加，在4℃下貯存的外泌體直徑增加了10%，在-80℃下貯存的外泌體直徑增加了25%，而且促進了多層囊泡的形成和聚集，影響外泌體的蛋白質含量。盡管研究報道在-80℃下貯存的外泌體大小存在差異，但均表明低溫貯存條件會導致外泌體生物學功能逐漸喪失。

冷凍干燥或噴霧干燥是新開發的一種外泌體存儲方法，可代替冷藏貯存，而且對外泌體的結構和功能維持更有益，但目前尚未摸索出最佳的保存環境［23-24］。此外，細胞外囊泡的不同來源和樣品制備過程也會影響細胞外囊泡的質量和穩定性，如凍融循環次數的增加將導致EV粒子數量的減少和內容物的快速降解，有必要適當減少外泌體使用過程中的凍融循環次數［25-26］。

4 外泌體在腫瘤中的研究進展

惡性腫瘤一直是人類社會面臨的巨大難題，雖然醫學治療方式已發生很大變化，但外科手術和全身化療仍是主要的治療方式，患者死亡率高，預后較差。外泌體作為一種非常有效的基因載體，避免了病毒載體的風險，其攜帶靶向基因藥物微創治療疾病，具有較大的臨床應用前景。

其次，外泌體本身也在腫瘤的疾病發展中起重要作用。其通過促進血管生成［27］、侵襲轉移［28］、免疫逃逸［29］以及耐藥抗性［30］等方面參與腫瘤的癌癥特性，miRNA作為外泌體攜帶的內容物在其中發揮至關重要的作用。這些miRNA可作為旁分泌藥物調節腫瘤的微環境，包括免疫細胞、內皮細胞和成纖維細胞等［31］。那些在腫瘤和正常組織中表達差異的miRNA可作為腫瘤的標志物。此外，抑制或上調腫瘤中的RNA分子也可能是一種有效的治療策略。

5 外泌體的應用

外泌體作為生物載體具有生物活性，可在細胞之間轉運其內含物，從而導致受體細胞功能的改變［32］。其在醫學領域具有許多潛在用途，研究廣泛集中于惡性腫瘤治療、藥物傳遞和再生醫學領域［33］。外泌體通過細胞間的通訊介導癌癥的轉移、耐藥性以及免疫反應［34］。其不僅在腫瘤發生、血管生成和轉移中起重要作用，還抑制腫瘤的進展［35］。由于外泌體幾乎存在于機體分泌的所有體液中，而且可在體液中檢測到，因此被認為是疾病診斷的無創或微創生物標志物，具有檢測包括癌癥在內的許多疾病病理狀態的潛力［36］。它們存在于各種體液中，如血清、唾液或尿液，可輕松地從患者身上采集血液樣本進行分離，然后用于鑒定外泌體中的特定RNA分子或蛋白質，是一種完美的無創診斷/預后技術［37-38］。外泌體由于其表面包含多種黏附蛋白，納米顆粒大小和可變形性使其能夠跨越主要的生物屏障，成為基因治療的藥物載體［39-40］。

研究發現，外泌體可同時發揮免疫激活和免疫抑制功能，腫瘤免疫療法為腫瘤研究領域的新型療法。來自免疫細胞和腫瘤細胞的外泌體部分充當腫瘤免疫學的調節劑，調節腫瘤的進展［41］。POGGIO等［42］發現，去除外泌體PD-L1后，會抑制腫瘤的生長。來自腫瘤的外泌體PD-L1抑制引流淋巴結中的T細胞活化，外泌體PD-L1代表1個治療靶標，可克服目前對抗體療法的耐藥性。轉移是腫瘤進展的關鍵因素，為癌癥死亡的主要原因，也是外泌體介導腫瘤遠處轉移的通訊機制［43］。降低腫瘤外泌體至正常水平，可能是防止癌癥惡化的有效療法。目前的研究發現，外泌體可作為腫瘤疾病的治療靶點［44］。目前，miRNA被認為是潛在的抗癌藥物，但傳遞miRNA、蛋白質和化學藥物的常規方法通常無法產生理想的效果。外源性miRNA在體內易降解，由于缺乏天然構象，外源性蛋白質無法執行所需的功能，所用化學藥物對正常細胞具有致命性。使用外泌體作為載體可解決上述問題，外泌體傳遞的分子靶向藥物作用于腫瘤細胞，可抑制腫瘤的生長和轉移［45］。此外，其還可用于腫瘤的預后監控［46］?？衫猛饷隗w作為生物標志物、疫苗和藥物載體，并對其進行合理的修飾，以進行治療性干預。

6 小結

外泌體的提取方法雖然具有多樣化，但仍無法確定哪種方法絕對有效，目前，研究者可能更傾向于試劑盒提取法。此外，外泌體的貯存具有時效性，且受多種因素影響，需在提取后盡快使用，因此，開發新型貯存方法來保持外泌體的結構和生物學功能，具有極大的研究價值和臨床應用前景。在臨床應用方面，準確有效地鑒定、分離和量化外泌體仍面臨巨大的挑戰，將進一步探索外泌體在轉化醫學中應用的潛力，并為創建有效的臨床診斷和治療策略提供新的途徑。